materiale
cultura celulară
melanomul uman Mel Z, Mel IL și celulele MTP Mel au fost obținute din materialul tumoral al pacienților supuși tratamentului la N. N. Blokhin Centrul Național de cercetare medicală de oncologie50. Fibroblastele BJ-5ta și celulele sk-BR-3 ale cancerului de sân au fost din ATCC. Celelalte celule au fost furnizate cu amabilitate de Drs. E. Svirchevskaya și E. Kovalenko (Shemyakin – Ovchinnikov Institutul de chimie bioorganică RAS, Moscova, Rusia). Toate celulele au fost crescute în mediu de creștere RPMI-1640 suplimentat cu 10% FBS, 2% L-glutamină, 100%/mL streptomicină și 100 U/ml penicilină la 37% C într-o atmosferă umidificată cu 5% CO2. Mediul a fost înlocuit la fiecare 3-4 zile. Conținutul de melanină a fost estimat prin măsurarea spectrului de absorbție în lizele de celule DMSO (106 celule pe ml) utilizând un spectrofotometru Cary 50 UV-Vis.
citometria în flux
celulele au fost recoltate cu soluție Versene, granulate prin centrifugare la 300 g timp de 5 minute și omogenizate în medii RPMI-1640 fără ser până la concentrația finală de 106 celule pe ml. Apoi, 100 de centicli din suspensia celulară au fost transferați în tuburile protejate cu lumină pentru citometrie în flux. Soluțiile de lucru adecvate ale FMN în mediul RPMI-1640 au fost pregătite imediat înainte de experimente. Aceste soluții de FMN au fost adăugate la tuburi, iar concentrația finală de FMN a fost de 10, 30 și 100. Apoi, celulele au fost incubate în întuneric într-un incubator de CO2 timp de 30 de minute. La sfârșitul incubației, 1 ml de PBS rece a fost adăugat la fiecare tub, iar celulele au fost centrifugate (300 g, 4 C) timp de 5 min. Supernatantul a fost îndepărtat, iar celulele au fost omogenizate în 300 unqq de PBS rece și transferate în gheață. Fluorescența a fost examinată folosind un Citometru de flux NovoCyte 2000r (acea Biosciences) și software-ul NovoExpress v. 1.2.4. Fluorescența a fost măsurată pe un canal corespunzător fluorescenței FITC și au fost examinate cel puțin 10.000 de evenimente pentru fiecare probă. Pentru a estima nivelul de acumulare al FMN în celule, s-au determinat valorile mediane ale fluorescenței din fiecare probă, iar apoi nivelul relativ de fluorescență (F) a fost calculat după următoarea formulă:
microscopie confocală
celulele au fost însămânțate într-o placă cu 96 de godeuri (5 103 celule pe godeu) urmată de incubare peste noapte. Apoi, în celule s-au adăugat 100 oqql de soluții de lucru adecvate de FMN (10 oqqm, 30 oqqm și 100 oqqm) în mediu RPMI-1640 și placa a fost incubată în întuneric într-un incubator de CO2 timp de 30 de minute. După aceea, celulele au fost spălate de 3 ori cu PBS rece și, în plus, colorate cu colorant Hoechst 33258 (50 centimm) timp de 15 min. Imaginile optice și datele privind intensitatea fluorescenței au fost obținute utilizând InCell Analyzer 6000 și software-ul stației de lucru Cell Analyzer V.3.7.3 (GE Healthcare, SUA).
studii de citotoxicitate
celulele au fost însămânțate într-o placă cu 96 de godeuri (5 103 celule pe godeu) urmată de incubare peste noapte. Soluțiile de lucru adecvate ale FMN în mediul complet RPMI-1640 au fost pregătite imediat înainte de experimente. Apoi, mediul a fost îndepărtat de pe placa cu 96 de puțuri și s-au adăugat alicote de soluție FMN (100 unqql) în fiecare godeu. Pentru a induce fotoactivarea FMN, plăcile au fost tratate cu lumină la 450 nm, doza de iradiere 0,2 J/cm2–7 J/cm2. Celulele fără tratament au fost utilizate ca controale (100%). Viabilitatea celulară a fost determinată prin testul MTT după 48 de ore de incubare. În acest scop, celulele au fost tratate cu soluție MTT (0,5 mg/ml în RPMI-1640) timp de 3 ore. apoi, mediul a fost înlocuit cu 100 inqql de DMSO pentru a dizolva cristalele formazan formate. Densitatea optică (OD) la 570 nm a fost măsurată folosind Varioskan flash reader (Thermo Scientific, SUA). Viabilitatea celulelor (V) după tratamentul FMN a fost exprimată în % comparativ cu martor conform următoarei ecuații:
cu scopul de a determina citotoxicitatea fotoproduselor FMN, soluțiile de lucru adecvate ale FMN în mediul RPMI-1640 complet au fost iradiate la 450 nm (5 J/cm2) și incubate peste noapte. Apoi, aceste alicote FMN (100 unqql) au fost adăugate la celule și incubate timp de 48 h. testul MTT a fost efectuat așa cum este descris mai sus.
în scopul determinării fototoxicității mediate de ROS, în fiecare godeu s-au adăugat alicote de soluție FMN (100 ECQ) și s-a tratat cu lumină la 450 nm (5 J / cm2). Mediile care conțin FMN au fost îndepărtate imediat după tratament și celulele au fost incubate în medii RPMI-1640 proaspete timp de 48 h. testul MTT a fost efectuat așa cum este descris mai sus.
testul de apoptoză și necroză
celulele au fost însămânțate într-o placă cu 96 de godeuri (5 103 celule pe godeu) urmată de incubare peste noapte. Apoi, în celule s-au adăugat 100 oqql de soluții de lucru adecvate de FMN (10 oqqm, 30 oqqm și 100 oqqm) în mediu RPMI-1640 și placa a fost incubată în întuneric într-un incubator de CO2 timp de 30 de minute. După aceea, celulele au fost iradiate folosind laser de 450 nm la o doză de 5 J/cm2. Apoi, celulele au fost spălate în mod constant cu PBS rece și tampon de legare și colorate cu anexa V-FITC, iodură de propidiu (PI) și Hoechst 33258 la temperatura camerei în tampon de legare timp de 15 min. Imaginile optice și datele privind intensitatea fluorescenței au fost obținute utilizând InCell Analyzer 6000 și software-ul stației de lucru Cell Analyzer V.3.7.3 (GE Healthcare, SUA).
producția de electrozi
nanoelectrozii de carbon au fost gravați într-o soluție de 0,1 m NaOH, 10 mM KCl în timpul a 30-40 de cicluri timp de 10 secunde fiecare pentru a crea o cavitate în suprafața carbonului. Potențialul aplicat a fost în formă de V cu amplitudine de 1,5-2 V. depunerea de platină a fost efectuată prin măturarea potențialului de la 0 la -1500 MV vs Ag/AgCl într-o soluție care conține acid cloroplatinic de 2 mM (H2PtCl6, Sigma). Voltamogramele ciclice în ferocen metanol de 1 mM (FcMeOH, Sigma) au fost obținute pentru electrodul de carbon inițial, pentru electrodul cu nanocavități și cu platină pentru controlul procesului de producție. Depunerea Pt a crescut doar ușor suprafața geometrică efectivă a nanoelectrodului (după cum reiese din voltamograma pentru oxidarea FcMeOH de 1 mM), dar și-a îmbunătățit dramatic activitatea catalitică spre reducerea ROS. Nanoelectrodul a fost polarizat la 600 MV vs Ag / AgCl (pentru detectarea limitată de difuzie a H2O2) și abordat manual la lichid sau la suprafața celulei canceroase unice. Pentru calibrare s-au utilizat soluții cu concentrații diferite de H2O2 (Sigma) în intervalul 10-7-10-4 M.
măsurare ROS cu sondă electrochimică
rezultatele au fost obținute așa cum a fost descris mai devreme47 cu unele modificări. Astfel, modificarea introdusă a electrozilor utilizați în această lucrare este o mai bună aderență a platinei la electrodul de carbon datorită gravării unei cavități în stratul de carbon înainte de depunerea Pt. Discul disponibil comercial, în formă de nanoelectrozi de carbon izolați în cuarț (ICAPPIC Limited, Marea Britanie) cu diametrul de 100-500 nm, au fost utilizați pentru producerea de senzori pentru detectarea ROS. Suprafața de carbon relativ inertă a electrodului a fost funcționalizată în continuare pentru detectarea speciilor redox active. Un strat de platină electrodepusă îmbunătățește activitatea electrocatalitică prin reducerea drastică a suprapotențialului produs de reducerea speciilor reactive de oxigen. Pentru a spori aderența platinei la dopul de carbon, am gravat o nanocavitate în electrodul de carbon. Am folosit o metodă electrochimică pentru a crea mici crestături în vârfurile nanoelectrozilor de carbon51. Fabricarea nanosenzorilor de platină a fost efectuată în două etape: gravarea în soluție alcalină și platinizarea. Toate etapele au fost controlate cu precizie prin măsurători electrochimice. Credem că nanoelectrodul este sensibil atât la formele ROS de scurtă durată, cât și la cele de lungă durată. Recent am demonstrat că producția de oxigen singlet în soluție apoasă de flavin mononucleotidă (FMN) este indusă de iradierea cu lumină albastră. Pe baza acestui rezultat demonstrăm (date suplimentare 9) răspunsul nanoelectrodului de carbon polarizat la +800 MV vs Ag/AgCl asupra producției de ROS în soluție apoasă de FMN sub iradiere cu lumină albastră.
celulele au fost însămânțate într-un vas Petri urmat de incubare peste noapte. Apoi, celulele au fost incubate timp de 30 min cu 100 mm FMN în întuneric și spălate de 3 ori cu PBS. Apoi, nanoelectrodul platinizat a fost introdus cu atenție prin utilizarea micromanipulatorului precis în celula unică sub control optic cu microscop inversat. Pentru manipularea și reglarea electrozilor am folosit micromanipulator PatchStar (Scientifica, UK). Am colectat date voltammetrice ciclice cu amplificator patch-clamp Model 2400 (A-M Systems, SUA). Înregistrarea semnalului a fost efectuată cu dispozitivul multifuncțional I/O USB-6211 (National instruments, SUA) și programul de calculator WinWCP. Toate măsurătorile au fost realizate pe masa microscopului inversat Nikon (Japonia). În toate măsurătorile electrodul Ag/AgCl a fost utilizat ca electrod de referință.
măsurarea ROS cu sondă fluorescentă
evaluarea ROS citoplasmatică a fost efectuată cu ajutorul sondei fluorescente CellROX Deep Red (sonde moleculare / termo). Pe scurt, celulele de melanom Mel IL și m-3 (5 inktu 103) au fost însămânțate în plăci cu 96 de puțuri (Nunc, Danemarca) și incubate cu 2,5 inktu de Cellrox roșu intens în medii complete RPMI-1640 timp de 30 min și spălate în PBS de trei ori. Apoi s-au adăugat în celule 100 oqql de soluții de lucru adecvate (10 oqqm, 30 oqqm și 100 oqqm) de FMN în mediu RPMI-1640 fără roșu fenol și placa a fost incubată în întuneric într-un incubator de CO2 timp de 30 de minute. După aceea, celulele au fost iradiate folosind laser de 450 nm la o doză de 5 J/cm2. Nucleele celulare au fost colorate suplimentar cu 50 de centimetri de soluție de colorant Hoechst 33258 timp de 15 min. Imaginile optice și datele de intensitate a fluorescenței CellROX roșu intens ale celulelor melanomului Mel IL și A375 au fost achiziționate folosind Incell Analyzer 6000 și în Cell Analyzer Workstation software V.3.7.3 (GE Healthcare, SUA).
determinarea conținutului de melanină
folosim teste de rutină pentru determinarea spectrofotometriei melaninei cu modificări minore52. Patru linii celulare de melanom: Mel MTP, Mel IL, Mel Z, a375 și două linii celulare normale (keratinocite umane hacat și fibroblaste ale pielii umane BJ-5ta) au fost numărate și granulate pentru a avea o concentrație finală de 2 celule 106/ml. Pentru determinarea conținutului intracelular de melanină, peletele celulare au fost dizolvate în 1 m NaOH conținând 10% (v/v) DMSO și incubate la 80 CTC timp de 1 oră. După incubare, lizații au fost centrifugați (3000 g timp de 5 minute) și absorbanța a fost măsurată în medii fără celule la 405 nm. Toate rezultatele sunt exprimate ca valoare medie a intensităților de absorbție normalizate la conținutul de melanină în fibroblaste deviația standard (SD) a trei experimente independente. Analiza statistică a fost realizată cu GraphPad Prism versiunea 5.0 (GraphPad Software, La Jolla California SUA).
experimente pe animale
terapia tumorilor primare
șoarecii masculi Balb/c nu / nu în vârstă de 6-7 săptămâni au fost achiziționați de la Ferma animalelor din Shemyakin–Ovchinnikov Institutul de Chimie bioorganică, Academia Rusă de științe și adăpostiți în condiții de mediu controlate în cabinetul de animale ventilate A-Box 80 (Noroit, Franța) la un ciclu de lumină întunecată de 12 ore și au permis accesul liber la apă sterilă și SPF-șoarece chow. Toate experimentele pe animale au fost efectuate în conformitate cu orientările naționale europene și ruse pentru experimentarea pe animale și au fost aprobate de Comitetul de revizuire a animalelor și eticii al FSBSI „N. N. Blokhin NMRCO”, numărul de referință 2017-034.
pentru a stabili un model de șoarece xenogrefă, celulele Mel IL și a375 au fost recoltate cu soluție Versene, granulate prin centrifugare la 300 g timp de 5 minute și omogenizate în medii RPMI-1640 fără ser. Suspensie de celule melanom a fost amestecat (1:1 volum) cu Matrigel (bd Biosciences) și suspensia celulară obținută (2 celule 106 la fiecare injecție) a fost implantată subcutanat în flancul drept al șoarecilor pentru a asigura inițierea cu succes a tumorii și măsurătorile de creștere a tumorii.
administrarea FMN a început în ziua 10 după inoculare când dimensiunea tumorii a ajuns la 100-120 mm3. Soluția FMN (150 xqtl, 10 xqtg / ml) a fost injectată la șoareci intravenos printr-un sinus retroorbital, iar tumorile au fost iradiate cu lumină albastră la 450 nm timp de 15 min până la doza finală de 20 J/cm2.
volumul tumorii a fost estimat prin metoda standard de calipare și a fost calculat după următoarea formulă, presupunând o formă hemi-elipsoidă:
activitatea antitumorală a FMN fotoactivată a fost determinată prin evaluarea ratei de inhibare a creșterii tumorale (TGI%) calculată ca:
terapia fotodinamică a tumorilor îndepărtate
am folosit șoareci c57bl/6 la vârsta de 6-7 săptămâni, achiziționați de la ferma de animale a Institutului de chimie bioorganică Shemyakin–Ovchinnikov, Academia Rusă de științe. Toate experimentele pe animale au fost efectuate în conformitate cu orientările naționale europene și ruse pentru experimentarea pe animale și au fost aprobate de Comitetul de revizuire a animalelor și eticii al FSBI „N. N. Blokhin NMRCO”, numărul de referință 2017-034.
celulele melanomului de șoarece B16-F10 au fost recoltate cu soluție Versene, granulate prin centrifugare la 300 g timp de 5 minute și omogenizate în medii RPMI-1640 fără ser. Suspensia de celule de melanom a fost amestecată (volum 1: 1) cu Matrigel (bd Biosciences), iar suspensia de celule obținută (5 105 celule pe injecție) a fost implantată subcutanat în flancul drept și stâng al șoarecilor pentru a asigura inițierea cu succes a tumorii și măsurătorile de creștere a tumorii.
administrarea FMN a început în ziua a 4-a după inoculare, când dimensiunea tumorii a ajuns la 60 xtx16 mm3 soluție FMN (150 xtxl, 10 mg/ml) a fost injectată intravenos la șoareci printr-un sinus retroorbital, iar tumorile au fost iradiate cu lumină albastră la 450 nm timp de 15 min până la doza finală de 20 J / cm2. Au fost utilizate două grupuri de control: injecție FMN fără iradiere ușoară; iradiere laser fără injecție FMN. Volumul tumorii și activitatea antitumorală a FMN fotoactivat au fost estimate așa cum a fost descris mai sus.
colorarea Hematoxilinei și Eozinei
animalele au fost sacrificate prin luxație cervicală în 24 de ore după PDT. Toate tumorile recoltate au fost fixate cu paraformaldehidă 4% Timp de 24 de ore și apoi încorporate cu parafină. Secțiunile de țesut (cu grosimea de 4 OQQ) au fost colorate cu hematoxilină și eozină.
analiza statistică
toate experimentele au fost efectuate în trei exemplare, cu excepția cazului în care se specifică altfel, și fiecare experiment a fost repetat de trei ori independent. Datele sunt exprimate ca valori medii ale SD-ului de la 0 la opt. Diferențele au fost considerate semnificative statistic atunci când valorile P au fost mai mici de 0,05. Toate analizele statistice au fost efectuate cu GraphPad Prism software (GraphPad Software, La Jolla, San Diego, CA, SUA).