Matériaux
Culture cellulaire
Mélanome humain Les cellules Mel Z, Mel IL et Mel MTP ont été obtenues à partir du matériel tumoral de patients sous traitement au Centre national de Recherche médicale N.N. Blokhin de oncologie50. Les fibroblastes BJ-5ta et les cellules SK-BR-3 du cancer du sein provenaient d’ATCC. Les autres cellules ont été gracieusement fournies par les Drs E. Svirchevskaya et E. Kovalenko (Institut Shemyakin-Ovchinnikov de Chimie bioorganique RAS, Moscou, Russie). Toutes les cellules ont été cultivées dans un milieu de croissance RPMI-1640 additionné de 10% de FBS, de 2 μМ L-glutamine, de 100 µg/mL de streptomycine et de 100 U/mL de pénicilline à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5% de CO2. Le milieu a été remplacé tous les 3-4 jours. La teneur en mélanine a été estimée en mesurant le spectre d’absorption dans les lysats de cellules DMSO (106 cellules par ml) à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis Cary 50.
Cytométrie en flux
Les cellules ont été récoltées avec une solution de Versène, granulées par centrifugation à 300 g pendant 5 min, et remises en suspension dans un milieu RPMI-1640 sans sérum à la concentration finale de 106 cellules par ml. Ensuite, 100 µl de la suspension cellulaire ont été transférés dans les tubes protégés de la lumière pour la cytométrie en flux. Des solutions de travail appropriées de FMN dans le milieu RPMI-1640 ont été préparées immédiatement avant les expériences. Ces solutions de FMN ont été ajoutées aux tubes et la concentration finale de FMN était de 10 µM, 30 µM et 100 µM. Ensuite, les cellules ont été incubées dans l’obscurité dans un incubateur de CO2 pendant 30 minutes. A la fin de l’incubation, 1 ml de PBS froid a été ajouté dans chaque tube et les cellules ont été centrifugées (300 g, 4 °C) pendant 5 min. Le surnageant a été éliminé et les cellules ont été remises en suspension dans 300 µl de PBS froid et transférées sur de la glace. La fluorescence a été examinée à l’aide d’un cytomètre en flux NovoCyte 2000R (ACEA Biosciences) et du logiciel NovoExpress v.1.2.4. La fluorescence a été mesurée sur un canal correspondant à la fluorescence FITC, et au moins 10 000 événements ont été examinés pour chaque échantillon. Pour estimer le niveau d’accumulation de FMN dans les cellules, les valeurs médianes de fluorescence dans chaque échantillon ont été déterminées, puis le niveau relatif de fluorescence (F) a été calculé selon la formule suivante:
Microscopie confocale
Les cellules ont été ensemencées dans des plaques de 96 puits (5 × 103 cellules par puits) suivies d’une incubation d’une nuit. Ensuite, 100 µL de solutions de travail appropriées de FMN (10 µM, 30 µM et 100 µM) en milieu RPMI-1640 ont été ajoutés aux cellules et la plaque a été incubée à l’obscurité dans un incubateur à CO2 pendant 30 minutes. Après cela, les cellules ont été lavées 3 fois avec du PBS froid et en outre colorées avec du colorant Hoechst 33258 (50 µM) pendant 15 min. Des images optiques et des données d’intensité de fluorescence ont été acquises à l’aide de l’analyseur InCell 6000 et du logiciel Cell Analyzer Workstation v.3.7.3 (GE Healthcare, États-Unis).
Études de cytotoxicité
Les cellules ont été ensemencées dans une plaque de 96 puits (5 × 103 cellules par puits) suivie d’une incubation d’une nuit. Des solutions de travail appropriées de FMN en milieu RPMI-1640 complet ont été préparées immédiatement avant les expériences. Ensuite, le milieu a été retiré de la plaque à 96 puits et des aliquotes de solution de FMN (100 µl) ont été ajoutées dans chaque puits. Pour induire la photoactivation FMN, les plaques ont été traitées avec de la lumière à 450 nm, dose d’irradiation 0,2 J / cm2 – 7 J / cm2. Des cellules sans traitement ont été utilisées comme témoins (100%). La viabilité cellulaire a été déterminée par dosage MTT après 48 h d’incubation. A cet effet, les cellules ont été traitées avec une solution de MTT (0,5 mg / ml dans RPMI-1640) pendant 3 h. Ensuite, le milieu a été remplacé par 100 µl de DMSO afin de dissoudre les cristaux de formazan formés. La densité optique (DO) à 570 nm a été mesurée à l’aide du lecteur flash Varioskan (Thermo Scientific, USA). La viabilité des cellules (V) après traitement FMN a été exprimée en % par rapport au témoin selon l’équation suivante:
Dans le but de déterminer la cytotoxicité des photoproduits FMN, des solutions de travail appropriées de FMN en milieu RPMI-1640 complet ont été irradiées à 450 nm (5 J/cm2) et incubées pendant une nuit. Ensuite, ces aliquotes de FMN (100 µl) ont été ajoutées aux cellules et incubées pendant 48 h. Le dosage MTT a été effectué comme décrit ci-dessus.
Dans le but de déterminer la phototoxicité médiée par le ROS, des aliquotes de solution de FMN (100 µl) ont été ajoutées dans chaque puits et traitées avec de la lumière à 450 nm (5 J/cm2). Les milieux contenant du FMN ont été retirés immédiatement après le traitement et les cellules ont été incubées dans des milieux RPMI-1640 frais pendant 48 h. Le dosage MTT a été effectué comme décrit ci-dessus.
Analyse de l’apoptose et de la nécrose
Les cellules ont été ensemencées dans des plaques de 96 puits (5 × 103 cellules par puits) suivies d’une incubation d’une nuit. Ensuite, 100 µL de solutions de travail appropriées de FMN (10 µM, 30 µM et 100 µM) en milieu RPMI-1640 ont été ajoutés aux cellules et la plaque a été incubée à l’obscurité dans un incubateur à CO2 pendant 30 minutes. Après cela, les cellules ont été irradiées à l’aide d’un laser de 450 nm à une dose de 5 J / cm2. Ensuite, les cellules ont été régulièrement lavées avec du PBS froid et du tampon de liaison et colorées avec de l’annexine V-FITC, de l’iodure de propidium (PI) et du Hoechst 33258 à température ambiante dans du tampon de liaison pendant 15 min. Des images optiques et des données d’intensité de fluorescence ont été acquises à l’aide de l’analyseur InCell 6000 et du logiciel Cell Analyzer Workstation v.3.7.3 (GE Healthcare, États-Unis).
Production d’électrodes
Les nanoélectrodes de carbone ont été gravées dans une solution de NaOH de 0,1 M, 10 mm de KCl pendant 30 à 40 cycles pendant 10 secondes chacun pour créer une cavité dans la surface du carbone. Le potentiel appliqué était en forme de V avec une amplitude de 1,5-2 V. Le dépôt de platine a été effectué en balayant le potentiel de 0 à -1500 mV vs Ag/AgCl dans une solution contenant de l’acide chloroplatinique de 2 mM (H2PtCl6, Sigma). Les voltammogrammes cycliques en ferrocène méthanol 1 mM (FcMeOH, Sigma) ont été obtenus pour l’électrode initiale en carbone, pour l’électrode à nanocavités et avec du platine pour contrôler le processus de production. Le dépôt de Pt n’a que légèrement augmenté la surface géométrique effective de la nanoélectrode (comme en témoigne le voltammogramme pour l’oxydation de 1 mm FcMeOH), mais a considérablement augmenté son activité catalytique vers la réduction du ROS. La nanoélectrode a été polarisée à 600 mV vs Ag/AgCl (pour la détection à diffusion limitée de H2O2) et approchée manuellement du liquide ou de la surface de la cellule cancéreuse unique. Pour l’étalonnage, nous avons utilisé des solutions avec des concentrations différentes de H2O2 (Sigma) dans la plage de 10-7-10-4 M.
Mesure ROS avec sonde électrochimique
Les résultats ont été obtenus tels qu’ils ont été décrits plus tôt47 avec quelques modifications. Ainsi, la modification introduite des électrodes utilisées dans ce travail est la meilleure adhérence du platine à l’électrode de carbone due à la gravure d’une cavité en couche de carbone avant le dépôt de Pt. Des nanoélectrodes de carbone en forme de disque disponibles dans le commerce, isolées dans du quartz (ICAPPIC Limited, Royaume-Uni) avec un diamètre de 100 à 500 nm, ont été utilisées pour la production de capteurs pour la détection de ROS. La surface carbonée relativement inerte de l’électrode a en outre été fonctionnalisée pour la détection d’espèces redox actives. Une couche de platine électrodéposée améliore l’activité électrocatalytique en réduisant drastiquement le surpotentiel produit par la réduction des espèces réactives de l’oxygène. Pour améliorer l’adhérence du platine au bouchon de carbone, nous avons gravé une nanocavité dans l’électrode de carbone. Nous avons utilisé une méthode électrochimique pour créer de minuscules encoches dans les pointes de nanoélectrodes de carbone51. La fabrication des nanocapteurs de platine a été réalisée en deux étapes : gravure en solution alcaline et platinisation. Toutes les étapes ont été contrôlées avec précision par des mesures électrochimiques. Nous pensons que la nanoélectrode est sensible à la fois aux formes ROS de courte et de longue durée de vie. Récemment, nous avons démontré que la production d’oxygène singulet en solution aqueuse de mononucléotide de flavine (FMN) est induite par une irradiation à la lumière bleue. Sur la base de ce résultat, nous démontrons (données supplémentaires 9) la réponse de la nanoélectrode de carbone polarisée à + 800 mV vs Ag / AgCl sur la production de ROS en solution aqueuse de FMN sous irradiation à la lumière bleue.
Les cellules ont été ensemencées dans une boîte de Pétri suivie d’une incubation d’une nuit. Ensuite, les cellules ont été incubées pendant 30 min avec 100 µM de FMN dans l’obscurité et lavées 3 fois avec du PBS. Ensuite, la nanoélectrode platinée a été soigneusement introduite en utilisant le micromanipulateur précis dans la cellule unique sous contrôle optique au microscope inversé. Pour la manipulation et le réglage des électrodes, nous avons utilisé le micromanipulateur PatchStar (Scientifica, Royaume-Uni). Nous avons collecté des données voltammétriques cycliques avec un amplificateur patch-clamp Modèle 2400 (A-M Systems, USA). L’enregistrement du signal a été effectué avec le périphérique d’E / S multifonctionnel USB-6211 (National instruments, USA) et le programme informatique WinWCP. Toutes les mesures ont été effectuées sur la table du microscope inversé Nikon (Japon). Dans toutes les mesures, l’électrode Ag/ AgCl a été utilisée comme électrode de référence.
Mesure du ROS avec sonde fluorescente
L’évaluation du ROS cytoplasmique a été réalisée à l’aide d’une sonde fluorescente Rouge profond CellROX (Sondes moléculaires/ Thermo). Brièvement, des cellules de mélanome Mel IL et M-3 (5 × 103) ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits (Nunc, Danemark) et incubées avec 2,5 µM de CellROX Deep Red dans un milieu RPMI-1640 complet pendant 30 min et lavées dans du PBS trois fois. Ensuite, 100 µL de solutions de travail appropriées (10 µM, 30 µM et 100 µM) de FMN en milieu RPMI-1640 sans Rouge de phénol ont été ajoutés aux cellules et la plaque a été incubée à l’obscurité dans un incubateur à CO2 pendant 30 minutes. Après cela, les cellules ont été irradiées à l’aide d’un laser de 450 nm à une dose de 5 J / cm2. Les noyaux cellulaires ont en outre été colorés par 50 µM de solution de colorant Hoechst 33258 pendant 15 min. Des images optiques et des données d’intensité de fluorescence Rouge profond CellROX de cellules de mélanome Mel IL et A375 ont été acquises à l’aide de l’analyseur InCell 6000 et du logiciel Cell Analyzer Workstation v.3.7.3 (GE Healthcare, États-Unis).
Détermination de la teneur en mélanine
Nous utilisons un dosage de routine pour la détermination de la mélanine par spectrophotométrie avec des changements mineurs52. Quatre lignées cellulaires de mélanome : Mel MTP, Mel IL, Mel Z, A375 et deux lignées cellulaires normales (kératinocytes humains HaCaT et fibroblastes cutanés humains BJ-5ta) ont été comptées et granulées afin d’avoir une concentration finale de 2 ×106 cellules/ml. Pour la détermination de la teneur en mélanine intracellulaire, des pastilles cellulaires ont été dissoutes dans 1 M de NaOH contenant 10% (v/v) de DMSO et incubées à 80 °C pendant 1 h. Après incubation, les lysats ont été centrifugés (3000 g pendant 5 min) et l’absorbance a été mesurée en milieu cellulaire à 405 nm. Tous les résultats sont exprimés en valeur moyenne des intensités d’absorbance normalisées à la teneur en mélanine dans les fibroblastes ± écart type (SD) de trois expériences indépendantes. L’analyse statistique a été réalisée avec GraphPad Prism version 5.0 (Logiciel GraphPad, La Jolla California USA).
Expériences animales
Thérapie des tumeurs primitives
Des souris mâles Balb /c nu / nu âgées de 6 à 7 semaines ont été achetées à la ferme animalière de l’Institut de chimie bioorganique Shemyakin–Ovchinnikov, Académie des Sciences de Russie, et hébergées dans des conditions environnementales contrôlées dans une armoire pour animaux ventilée A-Box 80 (Noroit, France) à un cycle de lumière foncée de 12 h et ont permis d’accéder librement à de l’eau stérile et à de la nourriture pour souris SPF. Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément aux directives nationales européennes et russes pour l’expérimentation animale et ont été approuvées par le comité d’évaluation des animaux et de l’éthique de la FSBSI « N.N. Blokhin NMRCO”, numéro de référence 2017-034.
Pour établir un modèle de souris xénogreffe, des cellules Mel IL et A375 ont été récoltées avec une solution de Versène, granulées par centrifugation à 300 g pendant 5 min et remises en suspension dans un milieu RPMI-1640 sans sérum. La suspension cellulaire de mélanome a été mélangée (1:1 volume) avec Matrigel (BD Biosciences), et la suspension cellulaire obtenue (2 × 106 cellules par injection) a été implantée par voie sous-cutanée dans le flanc droit des souris pour assurer une initiation tumorale réussie et des mesures de croissance tumorale.
L’administration de FMN a commencé le jour 10 après l’inoculation lorsque la taille de la tumeur a atteint 100-120 mm3. Une solution de FMN (150 µl, 10 µg / ml) a été injectée aux souris par voie intraveineuse à travers un sinus rétro-orbital et les tumeurs ont été irradiées à la lumière bleue à 450 nm pendant 15 min jusqu’à la dose finale de 20 J / cm2.
Le volume tumoral a été estimé par la méthode standard de calipation et a été calculé par la formule suivante, en supposant une forme hémi-ellipsoïde:
L’activité antitumorale de la FMN photoactivée a été déterminée en évaluant le taux d’inhibition de la croissance tumorale (TGI%) calculé comme suit ::
Thérapie photodynamique de tumeurs distantes
Nous avons utilisé des souris C57BL / 6 à l’âge de 6-7 semaines, achetées à la ferme animale de l’Institut de Chimie bioorganique Shemyakin–Ovchinnikov de l’Académie des Sciences de Russie. Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément aux directives nationales européennes et russes pour l’expérimentation animale et ont été approuvées par le comité d’évaluation des animaux et de l’éthique du FSBI « N.N. Blokhin NMRCO », numéro de référence 2017-034.
Des cellules de mélanome de souris B16-F10 ont été récoltées avec une solution de Versène, granulées par centrifugation à 300 g pendant 5 min et remises en suspension dans un milieu RPMI-1640 sans sérum. Une suspension cellulaire de mélanome a été mélangée (volume 1: 1) avec Matrigel (BD Biosciences), et la suspension cellulaire obtenue (5 × 105 cellules par injection) a été implantée par voie sous-cutanée dans le flanc droit et gauche des souris pour assurer une initiation tumorale réussie et des mesures de croissance tumorale.
L’administration de FMN a commencé le jour 4 après l’inoculation lorsque la taille de la tumeur a atteint 60 ± 16 mm3 de solution de FMN (150 µl, 10 mg / ml) a été injectée aux souris par voie intraveineuse à travers un sinus rétro-orbital, et les tumeurs ont été irradiées à la lumière bleue à 450 nm pendant 15 min jusqu’à la dose finale de 20 J / cm2. Deux groupes témoins ont été utilisés: injection FMN sans irradiation lumineuse; irradiation laser sans injection FMN. Le volume tumoral et l’activité antitumorale de la FMN photoactivée ont été estimés tels qu’ils ont été décrits ci-dessus.
Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine
Les animaux ont été sacrifiés par luxation cervicale 24 heures après la TPD. Toutes les tumeurs récoltées ont été fixées avec 4% de paraformaldéhyde pendant 24 h, puis noyées avec de la paraffine. Des coupes de tissus (4 µm d’épaisseur) ont été colorées avec de l’hématoxyline et de l’éosine.
Analyse statistique
Toutes les expériences ont été réalisées en trois exemplaires, sauf indication contraire, et chaque expérience a été répétée trois fois indépendamment. Les données sont exprimées en moyenne ± SD. Les différences ont été considérées comme statistiquement significatives lorsque les valeurs de P étaient inférieures à 0,05. Toutes les analyses statistiques ont été effectuées avec le logiciel GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, San Diego, CA, USA).