Materiali
di coltura Cellulare
di melanoma Umano Mel Z, Mel IL, e Mel MTP sono state ottenute cellule dal tumore, materiale di pazienti sottoposti a trattamento presso il N. N. Blokhin Nazionale del Centro per la Ricerca Medica di oncology50. I fibroblasti BJ-5ta e le cellule del cancro al seno SK-BR-3 provenivano da ATCC. Le altre celle sono state gentilmente fornite dal Drs. E. Svirchevskaya ed E. Kovalenko (Shemyakin-Ovchinnikov Istituto di Chimica bioorganica RAS, Mosca, Russia). Tutte le cellule sono state coltivate nel terreno di crescita RPMI-1640 integrato con 10% FBS, 2 μМ L-glutammina, 100 µg/mL streptomicina e 100 U/mL penicillina a 37 °C in un’atmosfera umidificata al 5% di CO2. Il mezzo è stato sostituito ogni 3-4 giorni. Il contenuto di melanina è stato stimato misurando lo spettro di assorbimento nei lisati cellulari DMSO (106 cellule per ml) utilizzando uno spettrofotometro Cary 50 UV-Vis.
Citometria a flusso
Le cellule sono state raccolte con soluzione di Versene, pellettate per centrifugazione a 300 g per 5 min e risospese in mezzi RPMI-1640 senza siero alla concentrazione finale di 106 cellule per ml. Quindi, 100 µl della sospensione cellulare sono stati trasferiti ai tubi protetti dalla luce per la citometria a flusso. Soluzioni di lavoro appropriate di FMN nel mezzo RPMI-1640 sono state preparate immediatamente prima degli esperimenti. Queste soluzioni di FMN sono state aggiunte ai tubi e la concentrazione finale di FMN era di 10 µM, 30 µM e 100 µM. Quindi, le cellule sono state incubate al buio in un incubatore di CO2 per 30 minuti. Alla fine dell’incubazione, 1 ml di PBS freddo è stato aggiunto a ciascun tubo e le cellule sono state centrifugate (300 g, 4 °C) per 5 min. Il surnatante è stato rimosso e le cellule sono state risospese in 300 µl di PBS freddo e trasferite al ghiaccio. La fluorescenza è stata esaminata utilizzando un citometro a flusso NovoCyte 2000R (ACEA Biosciences) e il software NovoExpress v. 1.2.4. La fluorescenza è stata misurata su un canale corrispondente alla fluorescenza FITC e sono stati esaminati almeno 10.000 eventi per ciascun campione. Per stimare il livello di accumulo di FMN nelle cellule, la mediana dei valori di fluorescenza in ogni campione sono stati determinati, e quindi il relativo livello di fluorescenza (F) è stato calcolato secondo la seguente formula:
microscopia Confocale
le Cellule sono state seminate in piastre da 96 pozzetti (5 × 103 cellule per pozzetto), seguita da una notte di incubazione. Quindi, 100 µL di soluzioni di lavoro appropriate di FMN (10 µM, 30 µM e 100 µM) nel mezzo RPMI-1640 sono stati aggiunti alle cellule e la piastra è stata incubata al buio in un incubatore di CO2 per 30 minuti. Successivamente, le cellule sono state lavate 3 volte con PBS freddo e inoltre colorate con colorante Hoechst 33258 (50 µM) per 15 min. Le immagini ottiche e i dati sull’intensità della fluorescenza sono stati acquisiti utilizzando InCell Analyzer 6000 e nel software Cell Analyzer Workstation v. 3.7. 3 (GE Healthcare, USA).
Studi di citotossicità
Le cellule sono state seminate in una piastra a 96 pozzetti (5 × 103 cellule per pozzetto) seguita da incubazione durante la notte. Le soluzioni di lavoro appropriate di FMN nel mezzo RPMI-1640 completo sono state preparate immediatamente prima degli esperimenti. Quindi, il mezzo è stato rimosso dalla piastra a 96 pozzetti e sono state aggiunte aliquote di soluzione FMN (100 µl) in ciascun pozzetto. Per indurre la fotoattivazione FMN, le piastre sono state trattate con luce a 450 nm, dose di irradiazione 0,2 J/cm2–7 J / cm2. Le cellule senza alcun trattamento sono state utilizzate come controlli (100%). La vitalità cellulare è stata determinata dal test MTT dopo 48 ore di incubazione. A tale scopo, le cellule sono state trattate con soluzione MTT (0,5 mg/ml in RPMI-1640) per 3 h. Quindi il mezzo è stato sostituito con 100 µl di DMSO per sciogliere i cristalli formazan formati. La densità ottica (OD) a 570 nm è stata misurata utilizzando Varioskan Flash reader (Thermo Scientific, USA). La vitalità delle cellule (V) dopo il trattamento con FMN è stata espressa in % rispetto al controllo secondo la seguente equazione:
Al fine di determinare la citotossicità dei fotoprodotti FMN, appropriate soluzioni di lavoro di FMN in pieno mezzo RPMI-1640 sono state irradiate a 450 nm (5 J/cm2) e incubate durante la notte. Quindi queste aliquote FMN (100 µl) sono state aggiunte alle cellule e incubate per 48 h. Il test MTT è stato eseguito come descritto sopra.
Al fine di determinare la fototossicità mediata dal ROS, sono state aggiunte aliquote di soluzione di FMN (100 µl) in ciascun pozzetto e trattate con luce a 450 nm (5 J / cm2). I supporti contenenti FMN sono stati rimossi immediatamente dopo il trattamento e le cellule sono state incubate in supporti freschi RPMI-1640 per 48 h. Il test MTT è stato eseguito come descritto sopra.
Analisi di apoptosi e necrosi
Le cellule sono state seminate in piastre a 96 pozzetti (5 × 103 cellule per pozzetto) seguite da incubazione notturna. Quindi, 100 µL di soluzioni di lavoro appropriate di FMN (10 µM, 30 µM e 100 µM) nel mezzo RPMI-1640 sono stati aggiunti alle cellule e la piastra è stata incubata al buio in un incubatore di CO2 per 30 minuti. Successivamente, le cellule sono state irradiate utilizzando un laser a 450 nm alla dose di 5 J/cm2. Quindi, le cellule sono state costantemente lavate con PBS freddo e tampone legante e colorate con Annexin V-FITC, ioduro di propidio (PI) e Hoechst 33258 a temperatura ambiente in tampone legante per 15 min. Le immagini ottiche e i dati sull’intensità della fluorescenza sono stati acquisiti utilizzando InCell Analyzer 6000 e nel software Cell Analyzer Workstation v. 3.7. 3 (GE Healthcare, USA).
Produzione di elettrodi
I nanoelettrodi di carbonio sono stati incisi in una soluzione di 0,1 M NaOH, 10 mM KCl durante 30-40 cicli per 10 secondi ciascuno per creare una cavità nella superficie del carbonio. Il potenziale applicato era a forma di V con ampiezza di 1,5-2 V. La deposizione di platino è stata effettuata spazzando il potenziale da 0 a -1500 mV vs Ag/AgCl in una soluzione contenente acido cloroplatinico 2 mM (H2PtCl6, Sigma). I voltammogrammi ciclici in metanolo ferrocene da 1 mm (FcMeOH, Sigma) sono stati ottenuti per l’elettrodo di carbonio iniziale, per l’elettrodo con nanocavità e con platino per controllare il processo di produzione. La deposizione di Pt ha solo leggermente aumentato l’effettiva area geometrica della superficie del nanoelettrodo (come evidenziato dal voltammogramma per l’ossidazione di 1 mM FcMeOH), ma ha notevolmente migliorato la sua attività catalitica verso la riduzione del ROS. Il nanoelettrodo è stato polarizzato a 600 mV vs Ag / AgCl (per il rilevamento limitato alla diffusione di H2O2) e avvicinato manualmente al liquido o alla superficie della singola cellula tumorale. Per la taratura abbiamo utilizzato soluzioni con diversa concentrazione di H2O2 (Sigma) nell’intervallo di 10-7-10-4 M.
Misurazione ROS con sonda elettrochimica
I risultati sono stati ottenuti così come è stato descritto in precedenza47 con alcune alterazioni. Pertanto, la modifica introdotta degli elettrodi utilizzati in questo lavoro è la migliore adesione del platino all’elettrodo di carbonio dovuta all’incisione di una cavità nello strato di carbonio prima della deposizione di Pt. Disco disponibile in commercio, nanoelettrodi di carbonio a forma di isolati in quarzo (ICAPPIC Limited, UK) con diametro 100-500 nm, sono stati utilizzati per la produzione di sensori per il rilevamento ROS. La superficie di carbonio relativamente inerte dell’elettrodo è stata ulteriormente funzionalizzata per la rilevazione di specie redox-attive. Uno strato di platino elettrodepositato migliora l’attività elettrocatalitica riducendo drasticamente il sovrapotenziale prodotto dalla riduzione delle specie reattive dell’ossigeno. Per migliorare l’adesione del platino al tappo di carbonio, abbiamo inciso una nanocavità nell’elettrodo di carbonio. Abbiamo utilizzato un metodo elettrochimico per creare piccole tacche nelle punte dei nanoelettrodi di carbonio51. La fabbricazione di nanosensori di platino è stata eseguita in due fasi: incisione in soluzione alcalina e platinizzazione. Tutte le fasi sono state controllate con precisione da misurazioni elettrochimiche. Crediamo che il nanoelettrodo sia sensibile sia alle forme ROS di breve durata che a quelle di lunga durata. Recentemente abbiamo dimostrato che la produzione di ossigeno singoletto in soluzione acquosa di flavin mononucleotide (FMN) è indotta da irradiazione di luce blu. Sulla base di questo risultato dimostriamo (dati supplementari 9) risposta del nanoelettrodo di carbonio polarizzato a +800 mV vs Ag/AgCl sulla produzione di ROS in soluzione acquosa di FMN sotto irradiazione di luce blu.
Le cellule sono state seminate in una capsula di Petri seguita da incubazione durante la notte. Quindi, le cellule sono state incubate per 30 min con 100 µM FMN nell’oscurità e lavate 3 volte con PBS. Quindi, il nanoelettrodo platinato è stato accuratamente introdotto utilizzando il preciso micromanipolatore nella singola cella sotto controllo ottico con microscopio invertito. Per la manipolazione e la regolazione degli elettrodi abbiamo utilizzato il micromanipolatore PatchStar (Scientifica, UK). Abbiamo raccolto dati voltammetrici ciclici con amplificatore patch-clamp Modello 2400 (A-M Systems, USA). La registrazione del segnale è stata eseguita con dispositivo I / O multifunzionale USB-6211 (National instruments, USA) e programma per computer WinWCP. Tutte le misurazioni sono state effettuate sul tavolo del microscopio invertito Nikon (Giappone). In tutte le misurazioni l’elettrodo Ag/AgCl è stato utilizzato come elettrodo di riferimento.
Misurazione ROS con sonda fluorescente
La valutazione del ROS citoplasmatico è stata eseguita utilizzando la sonda fluorescente Cellrox Deep Red (Molecular Probes / Thermo). In breve, le cellule di melanoma Mel IL e M-3 (5 × 103) sono state seminate in piastre a 96 pozzetti (Nunc, Danimarca) e incubate con 2,5 µM di CellROX Deep Red in media RPMI-1640 per 30 min e lavate in PBS tre volte. Quindi 100 µL di soluzioni di lavoro appropriate (10 µM, 30 µM e 100 µM) di FMN nel mezzo RPMI-1640 senza rosso fenolo sono stati aggiunti alle cellule e la piastra è stata incubata al buio in un incubatore di CO2 per 30 minuti. Successivamente, le cellule sono state irradiate utilizzando un laser a 450 nm alla dose di 5 J/cm2. I nuclei cellulari sono stati inoltre colorati con 50 µM di soluzione colorante Hoechst 33258 per 15 min. Immagini ottiche e dati di intensità di fluorescenza rosso intenso CellROX di cellule di melanoma Mel IL e A375 sono stati acquisiti utilizzando InCell Analyzer 6000 e nel software Cell Analyzer Workstation v. 3. 7.3 (GE Healthcare, USA).
Determinazione del contenuto di melanina
Usiamo il test di routine per la determinazione della melanina spettrofotometrica con cambiamenti minori52. Quattro linee cellulari di melanoma: Mel MTP, Mel IL, Mel Z, A375 e due linee cellulari normali (cheratinociti umani HaCaT e fibroblasti della pelle umana BJ-5ta) sono state contate e pellettate per avere una concentrazione finale di 2 × 106 cellule/ml. Per la determinazione del contenuto intracellulare di melanina, i pellet cellulari sono stati sciolti in 1 M di NaOH contenente il 10% (v / v) di DMSO e incubati a 80 °C per 1 ora. Dopo l’incubazione i lisati sono stati centrifugati (3000 g per 5 min) e l’assorbanza è stata misurata in mezzi privi di cellule a 405 nm. Tutti i risultati sono espressi come valore medio delle intensità di assorbanza normalizzate al contenuto di melanina nei fibroblasti ± deviazione standard (SD) di tre esperimenti indipendenti. L’analisi statistica è stata eseguita con GraphPad Prism versione 5.0 (Software GraphPad, La Jolla California USA).
esperimenti su Animali
la Terapia dei tumori primari
Maschio Balb/c topi nu/nu età di 6-7 settimane sono state acquistate da la fattoria degli animali di Shemyakin–Ovchinnikov Istituto di Bioorganic Chemistry, Accademia russa delle Scienze, e ospitato in condizioni ambientali controllate in ventilato animale armadio A-Box 80 (Noroit, Francia) a 12 h scuro-ciclo di luce e consentito l’accesso ad acqua sterile e SPF-chow mouse liberamente. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida nazionali europee e russe per la sperimentazione animale e sono stati approvati dal comitato di revisione degli animali e dell’etica della FSBSI “N. N. Blokhin NMRCO”, numero di riferimento 2017-034.
Per stabilire un modello murino di xenotrapianto, le cellule Mel IL e A375 sono state raccolte con soluzione di Versene, pellettate mediante centrifugazione a 300 g per 5 min e risospese in mezzi RPMI-1640 senza siero. La sospensione di cellule di melanoma è stata miscelata (1:1 volume) con Matrigel (BD Biosciences) e la sospensione cellulare ottenuta (2 × 106 cellule per iniezione) è stata impiantata per via sottocutanea nel fianco destro dei topi per garantire l’inizio del tumore e le misurazioni della crescita del tumore.
La somministrazione di FMN è iniziata il giorno 10 dopo l’inoculazione quando la dimensione del tumore ha raggiunto 100-120 mm3. La soluzione di FMN (150 µl, 10 µg/ml) è stata iniettata nei topi per via endovenosa attraverso un seno retro-orbitale e i tumori sono stati irradiati con luce blu a 450 nm per 15 min fino alla dose finale di 20 J/cm2.
volume del Tumore è stata stimata con il metodo standard di calipation ed è stata calcolata con la formula seguente, assumendo un hemi-ellissoide:
attività Antitumorale di fotoattivati FMN è stato determinato valutando l’inibizione della crescita tumorale tasso (TGI%), calcolato come:
la terapia Fotodinamica di metastasi di tumori
Abbiamo utilizzato topi C57BL/6 topi a 6-7 settimane di età, acquistato da la fattoria degli animali di Shemyakin–Ovchinnikov Istituto di Bioorganic Chemistry, Accademia russa delle Scienze. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida nazionali europee e russe per la sperimentazione animale e sono stati approvati dal comitato di revisione degli animali e dell’etica del FSBI ” N. N. Blokhin NMRCO”, numero di riferimento 2017-034.
Le cellule di melanoma di topo B16-F10 sono state raccolte con soluzione di Versene, pellettate mediante centrifugazione a 300 g per 5 min e risospese in mezzi RPMI-1640 senza siero. La sospensione cellulare del melanoma è stata miscelata (volume 1:1) con Matrigel (BD Biosciences) e la sospensione cellulare ottenuta (5 × 105 cellule per iniezione) è stata impiantata per via sottocutanea nel fianco destro e sinistro dei topi per garantire l’avvio del tumore e le misurazioni della crescita del tumore.
La somministrazione di FMN è iniziata il giorno 4 dopo l’inoculazione quando la dimensione del tumore ha raggiunto 60 ± 16 mm3 La soluzione di FMN (150 µl, 10 mg/ml) è stata iniettata nei topi per via endovenosa attraverso un seno retro-orbitale e i tumori sono stati irradiati con luce blu a 450 nm per 15 min Sono stati utilizzati due gruppi di controllo: iniezione FMN senza irradiazione di luce; irradiazione laser senza iniezione FMN. Il volume tumorale e l’attività antitumorale di FMN fotoattivato sono stati stimati come è stato descritto sopra.
Ematossilina ed eosina colorazione
Animali sono stati sacrificati da dislocazione cervicale in 24 ore dopo PDT. Tutti i tumori raccolti sono stati fissati con 4% paraformaldeide per 24 h e quindi incorporati con paraffina. Le sezioni di tessuto (4 µm di spessore) sono state colorate con ematossilina ed eosina.
Analisi statistica
Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in triplice copia se non diversamente indicato, e ogni esperimento è stato ripetuto tre volte in modo indipendente. I dati sono espressi come media ± SD. Le differenze sono state considerate statisticamente significative quando i valori di P erano inferiori a 0,05. Tutte le analisi statistiche sono state eseguite con il software GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, San Diego, CA, USA).