Materiais
de cultura de Células
Humanos melanoma Mel Z, Mel IL, e de Mel MTP células foram obtidos a partir do tumor material de pacientes submetidos ao tratamento no N. N. Blokhin Nacional de Investigação Médica do Centro de oncology50. Os fibroblastos BJ-5ta e as células SK-BR-3 do cancro da mama eram da ATCC. As outras células foram gentilmente fornecidas pelos Drs. E. Svirchevskaya e E. Kovalenko (Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry RAS, Moscovo, Rússia). Todas as células foram cultivadas em meio de crescimento RPMI-1640, complementadas com 10% de FBS, 2 μМ L-glutamina, 100 µg/mL de estreptomicina e 100 U/mL de penicilina a 37 °C numa atmosfera humidificada com 5% de CO2. O meio foi substituído a cada 3-4 dias. O teor de melanina foi estimado medindo o espectro de absorção nos lisados das células DMSO (106 células por ml) utilizando um espectrofotómetro Cary 50 UV-Vis.colheram-se células de citometria de fluxo
com solução de Verseno, granuladas por centrifugação a 300 g durante 5 minutos e ressuspendidas em meio RPMI-1640 sem soro até à concentração final de 106 células por ml. Em seguida, foram transferidos 100 µl da suspensão celular para os tubos protegidos pela luz para a citometria de fluxo. Foram preparadas soluções de trabalho adequadas da FMN em meio RPMI-1640 imediatamente antes das experiências. Estas soluções de FMN foram adicionadas aos tubos e a concentração final de FMN foi de 10 µM, 30 µM e 100 µM. Em seguida, as células foram incubadas no escuro em uma incubadora de CO2 por 30 minutos. No final da incubação, adicionaram-se 1 ml de PBS a frio a cada tubo e centrifugaram-se as células (300 g, 4 °C) durante 5 minutos. O sobrenadante foi removido e as células foram ressuspendidas em 300 µl de PBS a frio e transferidas para gelo. A fluorescência foi examinada utilizando um citómetro de fluxo NovoCyte 2000R (Biosciências ACEA) e novoexpress v. 1.2.4 software. A fluorescência foi medida num canal correspondente à fluorescência do FITC, tendo sido examinados pelo menos 10 000 acontecimentos para cada amostra. Para estimar o acúmulo de nível de FMN nas células, a média de valores de fluorescência em cada amostra foram determinadas e, em seguida, o parente nível de fluorescência (F) foi calculado de acordo com a fórmula a seguir:
microscopia Confocal
as Células foram semeadas em placa de 96 poços das placas (5 × 103 células por poço), seguido de incubação overnight. Em seguida, foram adicionados às células 100 µL de soluções de trabalho adequadas de FMN (10 µM, 30 µM e 100 µM) no meio RPMI-1640 e a placa foi incubada no escuro numa incubadora de CO2 durante 30 minutos. Depois disso, as células foram lavadas 3 vezes com PBS a frio e adicionalmente manchadas com corante Hoechst 33258 (50 µM) durante 15 minutos. Imagens ópticas e dados de intensidade de fluorescência foram adquiridos usando o analisador incell 6000 e no Software Cell Analyzer Workstation v. 3. 7. 3 (GE Healthcare, EUA).os estudos de Citotoxicidade
as células foram semeadas numa placa de 96 alvéolos (5 × 103 células por alvéolo) seguida de incubação nocturna. Foram preparadas soluções de trabalho adequadas da FMN em meio RPMI-1640 completo imediatamente antes das experiências. Em seguida, o meio foi removido da placa de 96 poços e alíquotas de solução FMN (100 µl) foram adicionados em cada poço. Para induzir a fotoactivação FMN, as placas foram tratadas com luz a 450 nm, dose de irradiação 0, 2 J/cm2–7 J/cm2. As células sem qualquer tratamento foram utilizadas como controlos (100%). A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio MTT após 48 horas de incubação. Para este propósito, as células foram tratadas com solução de MTT (0,5 mg/ml em RPMI-1640) durante 3 h. Em seguida, o meio foi substituído com 100 µl de DMSO, a fim de dissolver formadas de cristais de formazan. A densidade óptica (OD) a 570 nm foi medida usando varios Leitores Flash (Thermo Scientific, EUA). A viabilidade das células (V) após o tratamento com FMN foi expressa em % em comparação com o controlo de acordo com a seguinte equação::
$${\rm{V}}=({{\rm{OD}}}_{{\rm{sample}}}-{{\rm{OD}}}_{{\rm{background}}})/({{\rm{OD}}}_{{\rm{control}}}-{{\rm{OD}}}_{{\rm{background}}})\vezes 100 \% .para determinar a citotoxicidade dos fotoprodutos FMN, foram irradiadas a 450 nm (5 J/cm2) soluções de trabalho adequadas da FMN em meio RPMI-1640 completo e incubadas de um dia para o outro. Em seguida, estas alíquotas FMN (100 µl) foram adicionadas às células e incubadas durante 48 h. O ensaio MTT foi realizado como descrito acima. para determinar a fototoxicidade mediada pela ROS, foram adicionadas alíquotas de solução de FMN (100 µl) em cada alvéolo e tratadas com luz a 450 nm (5 J/cm2). O meio contendo FMN foi removido imediatamente após o tratamento e as células foram incubadas em meio fresco RPMI-1640 durante 48 horas. o ensaio MTT foi realizado como descrito acima.as células de apoptose e necrose foram semeadas em placas de 96 alvéolos (5 × 103 células por alvéolo) seguidas de incubação nocturna. Em seguida, foram adicionados às células 100 µL de soluções de trabalho adequadas de FMN (10 µM, 30 µM e 100 µM) no meio RPMI-1640 e a placa foi incubada no escuro numa incubadora de CO2 durante 30 minutos. Depois disso, as células foram irradiadas com laser de 450 nm numa dose de 5 J / cm2. Em seguida, as células foram constantemente lavadas com PBS frios e tampão de ligação e manchadas com o Anexo V-FITC, iodeto de propídio (PI) e Hoechst 33258 à temperatura ambiente em tampão de ligação durante 15 minutos. Imagens ópticas e dados de intensidade de fluorescência foram adquiridos usando o analisador incell 6000 e no Software Cell Analyzer Workstation v. 3. 7. 3 (GE Healthcare, EUA).
produção de eletrodos
os nanoelectrodos de carbono foram gravados em uma solução de 0,1 M NaOH, 10 mM KCl durante 30-40 ciclos por 10 segundos cada para criar uma cavidade na superfície de carbono. O potencial aplicado foi em forma de V com amplitude de 1, 5-2 V. A deposição de platina foi realizada varrendo o potencial de 0 a -1500 mV vs Ag/AgCl numa solução contendo ácido cloroplásico de 2 mM (H2PtCl6, Sigma). Os voltammogramas cíclicos em 1 mM de ferroceno metanol (FcMeOH, Sigma) foram obtidos para o eléctrodo de carbono inicial, para o eléctrodo com nanocavidades e com platina para controlar o processo de produção. A deposição de Pt apenas aumentou ligeiramente a área geométrica efectiva da superfície da nanoelectroda (como evidenciado pelo voltammograma para a oxidação de 1 mM FcMeOH), mas aumentou drasticamente a sua actividade catalítica para a redução Da ROS. O nanoelectrode foi polarizado a 600 mV vs Ag/AgCl (para a detecção limitada de difusão de H2O2) e se aproximou manualmente do líquido ou da superfície da única célula cancerosa. Para a calibração, utilizámos soluções com diferentes concentrações de H2O2 (Sigma) na gama de 10-7-10-4 M.
ROS medição com sonda electroquímica
os resultados foram obtidos tal como foi descrito earlier47 com algumas alterações. Assim, a modificação introduzida dos eletrodos utilizados neste trabalho é a melhor aderência da platina ao eletrodo de carbono devido à entrada de uma cavidade na camada de carbono antes da deposição de Pt. Os nanoelectrodes de carbono em forma de disco comercialmente disponível, isolados em quartzo (ICAPPIC Limited, Reino Unido) com diâmetro de 100-500 nm, foram utilizados para a produção de sensores para detecção de ROS. A superfície de carbono relativamente inerte do eletrodo foi ainda mais funcionalizada para a detecção de espécies redox ativas. Uma camada de platina eletrodepositada aumenta a atividade eletrocatalítica reduzindo drasticamente o excesso de potência produzido pela redução de espécies reativas de oxigênio. Para aumentar a aderência da platina ao tampão de carbono, gravámos uma nanocavidade no eléctrodo de carbono. Nós usamos um método eletroquímico para criar pequenos entalhes nas pontas dos nanoelectrodes51 de carbono. A fabricação de nanossensores de platina foi realizada em duas fases: gravação em solução alcalina e platinização. Todas as etapas foram controladas com precisão por medições eletroquímicas. Acreditamos que o nanoelectrode é sensível às formas de vida curta e longa. Recentemente, demonstrámos que a produção de oxigénio singlet em solução aquosa de mononucleótido de flavina (FMN) é induzida pela irradiação de luz azul. Com base neste resultado, demonstramos (dados suplementares 9) a resposta do nanoelectrode de carbono polarizado a +800 mV vs Ag/AgCl sobre a produção de ROS em solução aquosa de FMN sob irradiação de luz azul.as células
foram semeadas numa placa de Petri seguida de incubação nocturna. Em seguida, as células foram incubadas durante 30 minutos com 100 µM de FMN na escuridão e lavadas 3 vezes com PBS. Em seguida, o nanoelectrode platinizado foi cuidadosamente introduzido usando o micromanipulador preciso na única célula sob controle óptico com microscópio invertido. Para manipulação e ajuste de eletrodos usamos o micromanipulador PatchStar (Scientifica, Reino Unido). Coletamos dados voltamétricos cíclicos com o modelo amplificador de pinça de patch 2400 (A-M Systems, EUA). A gravação do sinal foi realizada com o dispositivo multifuncional USB-6211 (National instruments, USA) e o programa de computador WinWCP. Todas as medições foram realizadas na tabela de Nikon de microscópio invertido (Japão). Em todas as medições, o eletrodo Ag/AgCl foi usado como um eletrodo de referência.a medição Da ROS com sonda fluorescente foi realizada utilizando sonda fluorescente de cor vermelha profunda (sondas moleculares / termo). Brevemente, Mel IL e M-3 células de melanoma (5 × 103) foram distribuídos em 96 placas de poços (Nunc, Dinamarca) e incubadas com 2,5 µM de CellROX Vermelho Profundo em pleno RPMI-1640 media por 30 min e lavadas em PBS três vezes. Em seguida, foram adicionados às células 100 µL de soluções de trabalho adequadas (10 µM, 30 µM e 100 µM) de FMN em meio RPMI-1640 sem Vermelho de fenol e a placa foi incubada no escuro numa incubadora de CO2 durante 30 minutos. Depois disso, as células foram irradiadas com laser de 450 nm numa dose de 5 J / cm2. Os núcleos celulares foram adicionalmente manchados por 50 µM de solução de Corante Hoechst 33258 durante 15 minutos. Imagens ópticas e dados de intensidade de fluorescência de cor vermelha profunda de Mel IL e A375 células de melanoma foram adquiridos usando o analisador de células 6000 e no software de Estação de trabalho do analisador de células v. 3.7.3 (GE Healthcare, EUA).determinação do teor de melanina
usamos o ensaio de rotina para a determinação da melanina por espectrofotometria com pequenas alterações52. Quatro linhas celulares de melanoma: Mel MTP, Mel IL, Mel Z, A375 e duas linhas celulares normais (HaCaT de queratinócitos humanos e fibroblastos BJ-5ta de pele humana) foram contadas e peletadas de modo a obter uma concentração final de 2 × 106 células/ml. Para a determinação do teor intracelular de melanina, os pellets celulares foram dissolvidos em 1 m de NaOH contendo 10% (v/v) de DMSO e incubados a 80 °C durante 1 h. Após a incubação, os lisados foram centrifugados (3000 g durante 5 minutos) e a absorvância foi medida em meio sem células a 405 nm. Todos os resultados são expressos em valor médio das intensidades de absorvância normalizadas ao teor de melanina em fibroblastos ± desvio-padrão (SD) de três experiências independentes. A análise estatística foi realizada com GraphPad Prism version 5.0 (GraphPad Software, La Jolla California USA).experiências com animais foram compradas de uma quinta de animais do Instituto de química bio–orgânica Shemyakin-Ovchinnikov, Academia de Ciências da Rússia, e alojadas em condições ambientais controladas no armário de animais com revestimento a-Box 80 (Noroit, França), num ciclo de luz escura de 12 horas, permitindo o acesso livre a água esterilizada e comida para ratos SPF. Todas as experiências com animais foram realizadas de acordo com as diretrizes nacionais europeias e russas para a experimentação com animais e foram aprovadas pelo Comitê de exame de ética e animal do FSBSI “N. N. Blokhin NMRCO”, número de referência 2017-034.as células Mel IL e A375 foram colhidas com uma solução de Verseno, granuladas por centrifugação a 300 g durante 5 minutos e ressuspendidas em meio RPMI-1640 sem soro. A suspensão de células de Melanoma foi misturada (1:1 volume) com Matrigel (Biociências BD), e a suspensão celular obtida (2 × 106 células por injecção) foi implantada por via subcutânea no flanco direito dos ratinhos para garantir o sucesso das medições de iniciação do tumor e crescimento do tumor.
A administração de FMN começou no dia 10 após a inoculação, quando o tamanho do tumor atingiu 100-120 mm3. A solução de FMN (150 µl, 10 µg/ml) foi injectada nos ratos por via intravenosa através de um sinusal retro-orbital, e os tumores foram irradiados com luz azul a 450 nm durante 15 minutos até à dose final de 20 J/cm2.
Tumor volume foi estimada pelo método padrão de calipation e foi calculada pela seguinte fórmula, considerando um hemi-elipsóide forma:
$${{\rm{V}}}_{{\rm{tumor}}}={\rm{comprimento}}\times {({\rm{largura}})}^{2}/2$$
a atividade Antitumoral de photoactivated FMN foi determinada avaliando-se o crescimento do tumor de inibição da taxa (TGI%) calculado como:
$${\rm{TGI}} \% =({{\rm{TG}}}_{{\rm{controle}}}-{{\rm{TG}}}_{{\rm{teste}}})/{{\rm{TG}}}_{{\rm{controle}}}\times \mathrm{100} \% $$
a terapia Fotodinâmica distantes tumores
Nós utilizado C57BL/6 ratos com 6 ou 7 semanas de idade, adquiridos a partir de animal farm de Shemyakin–Ovchinnikov Instituto de Bioorganic Química, Academia russa de Ciências. Todas as experiências em animais foram realizadas de acordo com as diretrizes nacionais europeias e russas para experimentação em animais e foram aprovadas pelo Comitê de revisão de ética e animal do FSBI ” N. N. Blokhin NMRCO”, número de referência 2017-034.as células de melanoma do rato B16-F10 foram colhidas com solução de Verseno, granuladas por centrifugação a 300 g durante 5 minutos e ressuspendidas em meio RPMI-1640 sem soro. A suspensão celular de Melanoma foi misturada (volume 1:1) com Matrigel (Biociências BD), e a suspensão celular obtida (5 × 105 células por injecção) foi implantada por via subcutânea no flanco direito e esquerdo dos ratinhos para garantir o sucesso das medições de iniciação do tumor e crescimento do tumor.
Administração de FMN começaram no dia 4 após a inoculação, quando o tamanho do tumor atingiu 60 ± 16 mm3 FMN solução (150 µl, 10 mg/ml) foi injetado em ratos por via intravenosa através de um retro-orbital do sinus, e os tumores foram irradiados com luz azul a 450 nm para 15 min para o final dose de 20 J/cm2. Foram utilizados dois grupos de controlo: injecção FMN sem irradiação de luz; irradiação a laser sem injecção de FMN. O volume tumoral e a atividade antitumoral da FMN fotoativada foram estimados como foi descrito acima.
hematoxilina e coloração da eosina
os animais foram sacrificados por luxação cervical em 24 horas após a PDT. Todos os tumores colhidos foram fixados com 4% de paraformaldeído durante 24 h E depois embebidos em parafina. As secções dos tecidos (4 µm de espessura) estavam manchadas com hematoxilina e eosina.
análise estatística
todas as experiências foram realizadas em triplicado, salvo indicação em contrário, e cada experiência foi repetida três vezes de forma independente. Os dados são expressos em média ± DP. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando os valores de P foram inferiores a 0, 05. Todas as análises estatísticas foram realizadas com GraphPad Prism software (GraphPad Software, La Jolla, San Diego, CA, EUA).
produção de eletrodos
os nanoelectrodos de carbono foram gravados em uma solução de 0,1 M NaOH, 10 mM KCl durante 30-40 ciclos por 10 segundos cada para criar uma cavidade na superfície de carbono. O potencial aplicado foi em forma de V com amplitude de 1, 5-2 V. A deposição de platina foi realizada varrendo o potencial de 0 a -1500 mV vs Ag/AgCl numa solução contendo ácido cloroplásico de 2 mM (H2PtCl6, Sigma). Os voltammogramas cíclicos em 1 mM de ferroceno metanol (FcMeOH, Sigma) foram obtidos para o eléctrodo de carbono inicial, para o eléctrodo com nanocavidades e com platina para controlar o processo de produção. A deposição de Pt apenas aumentou ligeiramente a área geométrica efectiva da superfície da nanoelectroda (como evidenciado pelo voltammograma para a oxidação de 1 mM FcMeOH), mas aumentou drasticamente a sua actividade catalítica para a redução Da ROS. O nanoelectrode foi polarizado a 600 mV vs Ag/AgCl (para a detecção limitada de difusão de H2O2) e se aproximou manualmente do líquido ou da superfície da única célula cancerosa. Para a calibração, utilizámos soluções com diferentes concentrações de H2O2 (Sigma) na gama de 10-7-10-4 M.
ROS medição com sonda electroquímica
os resultados foram obtidos tal como foi descrito earlier47 com algumas alterações. Assim, a modificação introduzida dos eletrodos utilizados neste trabalho é a melhor aderência da platina ao eletrodo de carbono devido à entrada de uma cavidade na camada de carbono antes da deposição de Pt. Os nanoelectrodes de carbono em forma de disco comercialmente disponível, isolados em quartzo (ICAPPIC Limited, Reino Unido) com diâmetro de 100-500 nm, foram utilizados para a produção de sensores para detecção de ROS. A superfície de carbono relativamente inerte do eletrodo foi ainda mais funcionalizada para a detecção de espécies redox ativas. Uma camada de platina eletrodepositada aumenta a atividade eletrocatalítica reduzindo drasticamente o excesso de potência produzido pela redução de espécies reativas de oxigênio. Para aumentar a aderência da platina ao tampão de carbono, gravámos uma nanocavidade no eléctrodo de carbono. Nós usamos um método eletroquímico para criar pequenos entalhes nas pontas dos nanoelectrodes51 de carbono. A fabricação de nanossensores de platina foi realizada em duas fases: gravação em solução alcalina e platinização. Todas as etapas foram controladas com precisão por medições eletroquímicas. Acreditamos que o nanoelectrode é sensível às formas de vida curta e longa. Recentemente, demonstrámos que a produção de oxigénio singlet em solução aquosa de mononucleótido de flavina (FMN) é induzida pela irradiação de luz azul. Com base neste resultado, demonstramos (dados suplementares 9) a resposta do nanoelectrode de carbono polarizado a +800 mV vs Ag/AgCl sobre a produção de ROS em solução aquosa de FMN sob irradiação de luz azul.as células
foram semeadas numa placa de Petri seguida de incubação nocturna. Em seguida, as células foram incubadas durante 30 minutos com 100 µM de FMN na escuridão e lavadas 3 vezes com PBS. Em seguida, o nanoelectrode platinizado foi cuidadosamente introduzido usando o micromanipulador preciso na única célula sob controle óptico com microscópio invertido. Para manipulação e ajuste de eletrodos usamos o micromanipulador PatchStar (Scientifica, Reino Unido). Coletamos dados voltamétricos cíclicos com o modelo amplificador de pinça de patch 2400 (A-M Systems, EUA). A gravação do sinal foi realizada com o dispositivo multifuncional USB-6211 (National instruments, USA) e o programa de computador WinWCP. Todas as medições foram realizadas na tabela de Nikon de microscópio invertido (Japão). Em todas as medições, o eletrodo Ag/AgCl foi usado como um eletrodo de referência.a medição Da ROS com sonda fluorescente foi realizada utilizando sonda fluorescente de cor vermelha profunda (sondas moleculares / termo). Brevemente, Mel IL e M-3 células de melanoma (5 × 103) foram distribuídos em 96 placas de poços (Nunc, Dinamarca) e incubadas com 2,5 µM de CellROX Vermelho Profundo em pleno RPMI-1640 media por 30 min e lavadas em PBS três vezes. Em seguida, foram adicionados às células 100 µL de soluções de trabalho adequadas (10 µM, 30 µM e 100 µM) de FMN em meio RPMI-1640 sem Vermelho de fenol e a placa foi incubada no escuro numa incubadora de CO2 durante 30 minutos. Depois disso, as células foram irradiadas com laser de 450 nm numa dose de 5 J / cm2. Os núcleos celulares foram adicionalmente manchados por 50 µM de solução de Corante Hoechst 33258 durante 15 minutos. Imagens ópticas e dados de intensidade de fluorescência de cor vermelha profunda de Mel IL e A375 células de melanoma foram adquiridos usando o analisador de células 6000 e no software de Estação de trabalho do analisador de células v. 3.7.3 (GE Healthcare, EUA).determinação do teor de melanina
usamos o ensaio de rotina para a determinação da melanina por espectrofotometria com pequenas alterações52. Quatro linhas celulares de melanoma: Mel MTP, Mel IL, Mel Z, A375 e duas linhas celulares normais (HaCaT de queratinócitos humanos e fibroblastos BJ-5ta de pele humana) foram contadas e peletadas de modo a obter uma concentração final de 2 × 106 células/ml. Para a determinação do teor intracelular de melanina, os pellets celulares foram dissolvidos em 1 m de NaOH contendo 10% (v/v) de DMSO e incubados a 80 °C durante 1 h. Após a incubação, os lisados foram centrifugados (3000 g durante 5 minutos) e a absorvância foi medida em meio sem células a 405 nm. Todos os resultados são expressos em valor médio das intensidades de absorvância normalizadas ao teor de melanina em fibroblastos ± desvio-padrão (SD) de três experiências independentes. A análise estatística foi realizada com GraphPad Prism version 5.0 (GraphPad Software, La Jolla California USA).experiências com animais foram compradas de uma quinta de animais do Instituto de química bio–orgânica Shemyakin-Ovchinnikov, Academia de Ciências da Rússia, e alojadas em condições ambientais controladas no armário de animais com revestimento a-Box 80 (Noroit, França), num ciclo de luz escura de 12 horas, permitindo o acesso livre a água esterilizada e comida para ratos SPF. Todas as experiências com animais foram realizadas de acordo com as diretrizes nacionais europeias e russas para a experimentação com animais e foram aprovadas pelo Comitê de exame de ética e animal do FSBSI “N. N. Blokhin NMRCO”, número de referência 2017-034.as células Mel IL e A375 foram colhidas com uma solução de Verseno, granuladas por centrifugação a 300 g durante 5 minutos e ressuspendidas em meio RPMI-1640 sem soro. A suspensão de células de Melanoma foi misturada (1:1 volume) com Matrigel (Biociências BD), e a suspensão celular obtida (2 × 106 células por injecção) foi implantada por via subcutânea no flanco direito dos ratinhos para garantir o sucesso das medições de iniciação do tumor e crescimento do tumor.
A administração de FMN começou no dia 10 após a inoculação, quando o tamanho do tumor atingiu 100-120 mm3. A solução de FMN (150 µl, 10 µg/ml) foi injectada nos ratos por via intravenosa através de um sinusal retro-orbital, e os tumores foram irradiados com luz azul a 450 nm durante 15 minutos até à dose final de 20 J/cm2.
Tumor volume foi estimada pelo método padrão de calipation e foi calculada pela seguinte fórmula, considerando um hemi-elipsóide forma:
a atividade Antitumoral de photoactivated FMN foi determinada avaliando-se o crescimento do tumor de inibição da taxa (TGI%) calculado como:
a terapia Fotodinâmica distantes tumores
Nós utilizado C57BL/6 ratos com 6 ou 7 semanas de idade, adquiridos a partir de animal farm de Shemyakin–Ovchinnikov Instituto de Bioorganic Química, Academia russa de Ciências. Todas as experiências em animais foram realizadas de acordo com as diretrizes nacionais europeias e russas para experimentação em animais e foram aprovadas pelo Comitê de revisão de ética e animal do FSBI ” N. N. Blokhin NMRCO”, número de referência 2017-034.as células de melanoma do rato B16-F10 foram colhidas com solução de Verseno, granuladas por centrifugação a 300 g durante 5 minutos e ressuspendidas em meio RPMI-1640 sem soro. A suspensão celular de Melanoma foi misturada (volume 1:1) com Matrigel (Biociências BD), e a suspensão celular obtida (5 × 105 células por injecção) foi implantada por via subcutânea no flanco direito e esquerdo dos ratinhos para garantir o sucesso das medições de iniciação do tumor e crescimento do tumor.
Administração de FMN começaram no dia 4 após a inoculação, quando o tamanho do tumor atingiu 60 ± 16 mm3 FMN solução (150 µl, 10 mg/ml) foi injetado em ratos por via intravenosa através de um retro-orbital do sinus, e os tumores foram irradiados com luz azul a 450 nm para 15 min para o final dose de 20 J/cm2. Foram utilizados dois grupos de controlo: injecção FMN sem irradiação de luz; irradiação a laser sem injecção de FMN. O volume tumoral e a atividade antitumoral da FMN fotoativada foram estimados como foi descrito acima.
hematoxilina e coloração da eosina
os animais foram sacrificados por luxação cervical em 24 horas após a PDT. Todos os tumores colhidos foram fixados com 4% de paraformaldeído durante 24 h E depois embebidos em parafina. As secções dos tecidos (4 µm de espessura) estavam manchadas com hematoxilina e eosina.
análise estatística
todas as experiências foram realizadas em triplicado, salvo indicação em contrário, e cada experiência foi repetida três vezes de forma independente. Os dados são expressos em média ± DP. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando os valores de P foram inferiores a 0, 05. Todas as análises estatísticas foram realizadas com GraphPad Prism software (GraphPad Software, La Jolla, San Diego, CA, EUA).