Fotodynamisk terapi av melanom ved blå-lys fotoaktivering av flavin mononukleotid

Materialer

Cellekultur

Human melanom Mel Z, Mel IL, Og Mel MTP celler ble oppnådd fra tumor materiale av pasienter som gjennomgår behandling Ved N. N. Blokhin National Medical Research Center of oncology50. Bj-5ta fibroblaster OG brystkreft SK-BR – 3 celler var fra ATCC. De andre cellene ble vennlig levert Av Dr. E. Svirchevskaya Og E. Kovalenko (Shemyakin – Ovchinnikov Institutt For Bioorganisk Kjemi RAS, Moskva, Russland). Alle celler ble dyrket i RPMI-1640 vekstmedium supplert med 10% FBS, 2 μМ l-glutamin, 100 µ/ml streptomycin og 100 e/ml penicillin ved 37 ° c I en 5% co2-FUKTET atmosfære. Mediet ble erstattet hver 3-4 dager. Melanininnholdet ble estimert ved å måle absorpsjonsspekteret I DMSO – cellelysater (106 celler per ml) ved Hjelp Av Et Cary 50 UV-Vis spektrofotometer.

Flowcytometri

Celler ble høstet Med Versene-oppløsning, pelletert ved sentrifugering ved 300 g i 5 min, og resuspendert i RPMI-1640 media uten serum til den endelige konsentrasjonen av 106 celler per ml. Deretter ble 100 µ av cellesuspensjonen overført til de lysbeskyttede rørene for flowcytometri. Passende arbeidsløsninger AV FMN I rpmi-1640 medium ble utarbeidet umiddelbart før forsøkene. Disse FMN-løsningene ble lagt til rørene, og den endelige fmn-konsentrasjonen var 10 µ, 30 µ og 100 µ. Deretter ble cellene inkubert i mørket i EN CO2-inkubator i 30 minutter. Ved slutten av inkubasjonen ble 1 ml kaldt PBS tilsatt til hvert rør, og cellene ble sentrifugert (300 g, 4 °C) i 5 min. Supernatanten ble fjernet og cellene ble resuspendert i 300 µ kalde PBS og overført til is. Fluorescens ble undersøkt ved Hjelp Av et flowcytometer NovoCyte 2000r (ACEA Biosciences) Og NovoExpress v. 1.2.4 programvare. Fluorescens ble målt på en kanal som svarer TIL FITC fluorescens, og minst 10.000 hendelser ble undersøkt for hver prøve. For å estimere akkumuleringsnivået FOR FMN i cellene ble medianfluorescensverdiene i hver prøve bestemt, og deretter ble det relative fluorescensnivået (F) beregnet i henhold til følgende formel:

konfokal mikroskopi

celler ble sådd i en 96-brønnplater (5 × 103 celler per Brønn) etterfulgt av inkubasjon over natten. Deretter ble 100 µ av passende arbeidsløsninger av FMN (10 µ, 30 µ og 100 µ) i RPMI-1640 medium tilsatt til celler, og platen ble inkubert i mørket i EN CO2-inkubator i 30 minutter. Etter det ble cellene vasket 3 ganger med kaldt PBS og i tillegg farget Med Hoechst 33258 fargestoff (50 µ) i 15 min. Optiske bilder og fluorescensintensitetsdata ble samlet inn ved Hjelp Av InCell Analyzer 6000 og I Cell Analyzer Workstation software v. 3.7.3 (GE Healthcare, USA).

Cytotoksisitetsstudier

Celler ble sådd i en 96-brønnsplate (5 × 103 celler per brønn) etterfulgt av inkubasjon over natten. Passende arbeidsløsninger AV FMN i full rpmi-1640 medium ble utarbeidet umiddelbart før forsøkene. Deretter ble mediet fjernet fra 96-brønnsplaten, OG FMN-oppløsning (100 µ) ble tilsatt i hver brønn. For å indusere fmn fotoaktivering ble platene behandlet med lys ved 450 nm, bestrålingsdose 0,2 J / cm2-7 J / cm2. Celler uten behandling ble brukt som kontroller (100%). Celleviabilitet ble bestemt VED MTT-analyse etter 48 h inkubasjon. Til dette formål ble celler behandlet MED mtt-oppløsning (0,5 mg / ml I RPMI-1640) i 3 timer. deretter ble mediet erstattet med 100 µ AV DMSO for å oppløse dannede formazankrystaller. Den optiske tettheten (OD) ved 570 nm ble målt Ved Bruk Av Varioskan Flash reader (Thermo Scientific, USA). Cellens levedyktighet (V) etter fmn-behandling ble uttrykt i % sammenlignet med kontrollen i henhold til følgende ligning:

Med sikte på å bestemme cytotoksisiteten TIL FMN-fotoprodukter, ble passende arbeidsløsninger AV FMN i full rpmi-1640 medium bestrålt ved 450 nm (5 j/cm2) og inkubert over natten. Da ble DISSE FMN-alikvotene (100 µ) tilsatt til cellene og inkubert i 48 timer. MTT-analysen ble utført som beskrevet ovenfor.

Med Sikte på å bestemme ROS-mediert fototoksisitet ble fmn-løsningslikvoter (100 µ) tilsatt i hver brønn og behandlet med lys ved 450 nm (5 J/cm2). Fmn-holdige medier ble fjernet umiddelbart etter behandlingen, og celler ble inkubert i fersk rpmi-1640 media for 48 h. MTT-analyse ble utført som beskrevet ovenfor.

Apoptose-og nekroseanalyse

Celler ble sådd i en 96-brønnplate (5 × 103 celler per brønn) etterfulgt av inkubasjon over natten. Deretter ble 100 µ av passende arbeidsløsninger av FMN (10 µ, 30 µ og 100 µ) i RPMI-1640 medium tilsatt til celler, og platen ble inkubert i mørket i EN CO2-inkubator i 30 minutter. Etter det ble celler bestrålt ved bruk av 450 nm laser i en dose på 5 J / cm2. Deretter ble cellene konsekvent vasket med kald PBS og bindingsbuffer og farget Med Annexin V-FITC, propidiumjodid (PI) og Hoechst 33258 ved romtemperatur i bindingsbuffer i 15 min. Optiske bilder og fluorescensintensitetsdata ble samlet inn ved Hjelp Av InCell Analyzer 6000 og I Cell Analyzer Workstation software v. 3.7.3 (GE Healthcare, USA).

Elektrodeproduksjon

karbon nanoelektrodene ble etset i en 0,1 M NaOH, 10 mM KCl-løsning under 30-40 sykluser i 10 sekunder hver for å skape et hulrom i karbonoverflaten. Det anvendte potensialet var V-formet med amplitude på 1,5-2 V. Platinavsetning ble utført ved å feie potensialet fra 0 til -1500 mV vs Ag / AgCl i en oppløsning inneholdende 2 mM kloroplatininsyre (H2PtCl6, Sigma). De sykliske voltammogrammene i 1 mM ferrocenmetanol (FcMeOH, Sigma) ble oppnådd for den første karbonelektroden, for elektroden med nanokaviteter og med platina for å kontrollere produksjonsprosessen. Avsetningen Av Pt økte bare litt det effektive geometriske overflatearealet av nanoelektroden (som det fremgår av voltammogrammet for oksidasjon av 1 mM FcMeOH), men dramatisk forbedret sin katalytiske aktivitet mot ROS-reduksjon. Nanoelektroden ble polarisert ved 600 mV vs Ag / AgCl (for diffusjonsbegrenset deteksjon AV H2O2) og nærmet seg manuelt til væsken eller overflaten av enkeltkreftcellen. For kalibreringen brukte vi løsninger med forskjellig konsentrasjon AV H2O2 (Sigma) i området 10-7-10-4 M.

ROS måling med elektrokjemisk sonde

resultatene ble oppnådd som det ble beskrevet tidligere47 med noen endringer. Således er den innførte modifikasjon av elektroder som brukes i dette arbeidet bedre adhesjon av platina til karbonelektrode på grunn av etsing av et hulrom i karbonlag før Pt-avsetning. Kommersielt tilgjengelig disk, formet karbon nanoelektroder isolert i kvarts (ICAPPIC Limited, UK) med diameter 100-500 nm, ble brukt til produksjon av sensorer FOR ROS deteksjon. Den relativt inerte karbonoverflaten av elektroden ble ytterligere funksjonalisert for påvisning av redoks-aktive arter. Et elektrodepositert platinag forbedrer den elektrokatalytiske aktiviteten ved å drastisk redusere overpotensialet som produseres ved reduksjon av reaktive oksygenarter. For å forbedre adhesjonen av platina til karbonpluggen, etset vi en nanokavitet i karbonelektroden. Vi har brukt en elektrokjemisk metode for å lage små hakk i spissene av karbon nanoelektroder51. Fremstilling av platina nanosensorer ble utført i to trinn: etsing i alkalisk oppløsning og platinisering. Alle stadier ble nøyaktig kontrollert av elektrokjemiske målinger. Vi tror at nanoelektroden er følsom både for kortvarige OG langlivede ROS-former. Nylig viste vi at singlet oksygenproduksjon i vandig løsning av flavin mononukleotid (FMN) er indusert av blått lys bestråling. Basert på dette resultatet viser vi (Supplerende data 9) respons av karbon nanoelektrode polarisert ved +800 mV vs Ag/AgCl PÅ ROS produksjon i vandig løsning AV FMN under blått lys bestråling.

Celler ble sådd i En Petriskål etterfulgt av inkubasjon over natten. Deretter ble cellene inkubert i 30 min med 100 µ FMN i mørket og vasket 3 ganger med PBS. Deretter ble den platiniserte nanoelektroden nøye introdusert ved å bruke den nøyaktige mikromanipulatoren i enkeltcellen under optisk kontroll med invertert mikroskop. For elektrode manipulasjon og justering vi brukte micromanipulator PatchStar (Scientifica, UK). Vi samlet en syklisk voltammetriske data med patch-klemme forsterker Modell 2400 (A-M Systems, USA). Opptak av signalet ble utført med multifunksjonell I / O-enhet USB-6211 (National instruments, USA) Og dataprogram WinWCP. Alle målinger ble oppnådd på bordet av invertert mikroskop Nikon (Japan). I alle målinger Ble Ag / AgCl elektrode brukt som referanseelektrode.

ROS-måling med fluorescerende probe

Evaluering av cytoplasmatisk ROS ble utført Ved Bruk Av CellROX Dyprød fluorescerende probe (Molekylære Prober/Termo). Mel IL og m-3 melanomceller (5 × 103) ble sådd i 96 brønnplater (Nunc, Danmark) og inkubert med 2,5 µ CellROX Deep Red i full RPMI-1640 media i 30 min og vasket i PBS tre ganger. Deretter ble 100 µ av passende arbeidsløsninger (10 µ, 30 µ og 100 µ) AV FMN I RPMI-1640 medium uten Fenolrød tilsatt til celler og platen ble inkubert i mørket i EN CO2-inkubator i 30 minutter. Etter det ble celler bestrålt ved bruk av 450 nm laser i en dose på 5 J / cm2. Cellekjerner ble i tillegg farget med 50 µ Av Hoechst 33258 fargestoffoppløsning i 15 min. Optiske bilder og Cellrox Dyp Rød fluorescensintensitetsdata Av Mel IL og a375 melanomceller ble anskaffet ved Hjelp Av InCell Analyzer 6000 og I Cell Analyzer Workstation software v. 3.7.3 (GE Healthcare, USA).

bestemmelse Av Melanininnhold

vi bruker rutinemessig analyse for spektrofotometri melaninbestemmelse med mindre endringer52. Fire melanomcellelinjer: Mel MTP, Mel IL, Mel Z, A375 og to normale (humane keratinocytter HaCaT og humane hudfibroblaster BJ-5TA) cellelinjer ble talt og pelletert for å få en endelig konsentrasjon på 2 × 106 celler/ml. For bestemmelse av intracellulært melanininnhold ble cellepellets oppløst I 1 M NaOH inneholdende 10% (v/v) DMSO og inkubert ved 80 °C i 1 time. Etter inkubasjon ble lysatene sentrifugert (3000 g i 5 min) og absorbansen ble målt i cellefrie medier ved 405 nm. Alle resultatene er uttrykt som middelverdi av absorpsjonsintensiteter normalisert til melanininnholdet i fibroblaster ± standardavvik (SD) av tre uavhengige eksperimenter. Statistisk analyse ble utfort med GraphPad Prism versjon 5.0 (GraphPad Software, La Jolla California USA).

Dyreforsøk

Terapi av primære svulster

Mannlige Balb / c nu / nu mus i alderen 6-7 uker ble kjøpt fra animal farm Av Shemyakin-Ovchinnikov Institute Of Bioorganic Chemistry, Russian Academy Of Sciences, og plassert under kontrollerte miljøforhold i ventilert dyr skap A-Box 80 (Noroit, Frankrike) på en 12 h mørk-lys syklus og tillatt tilgang til sterilt vann og SPF-mus chow fritt. Alle dyreforsøk ble utført I samsvar Med Europeiske og russiske nasjonale retningslinjer for dyreforsøk og ble godkjent av animal and ethics review committee AV FSBSI «N. N. Blokhin NMRCO», referansenummer 2017-034.For å etablere en xenograft-musemodell ble Mel IL og A375-celler høstet Med Versene-oppløsning, pelletert ved sentrifugering ved 300 g i 5 min, og resuspendert I rpmi-1640 media uten serum. Melanomcellesuspensjon ble blandet (1:1 volum) Med Matrigel (BD Biosciences) og den oppnådde cellesuspensjonen (2 × 106 celler per injeksjon) ble implantert subkutant i musens høyre flanke for å sikre vellykket tumorinitiering og tumorvekstmålinger.

Administrasjon av FMN startet på dag 10 etter inokulering når tumorstørrelsen nådde 100-120 mm3. FMN-oppløsning (150 µ, 10 µ/ml) ble injisert intravenøst i musene gjennom en retro-orbital sinus, og svulstene ble bestrålt med blått lys ved 450 nm i 15 minutter til den endelige dosen på 20 j / cm2.

Tumorvolum ble estimert ved standardmetoden for kalipering og ble beregnet med følgende formel, forutsatt en hemi-ellipsoid form: