TESTO
La sifilide è una malattia a trasmissione sessuale causata da infezione con la spirochete Treponema pallidum. A causa dell’incapacità di coltivare abitualmente l’agente infettivo, la diagnosi di infezione da sifilide viene eseguita principalmente da una combinazione di presentazione clinica e sierologia. Questo test sierologico può essere ampiamente diviso in due tipi di saggi: test treponemici che testano gli anticorpi diretti contro T. test pallidum e non treponemici che misurano gli anticorpi anticardiolipina prodotti durante l’infezione attiva.
Negli ultimi anni, molti laboratori si sono spostati verso lo screening dei pazienti con un test treponemico e poi reflexing campioni positivi a test non treponemici, una pratica che inverte l’approccio storico. C’è un dibattito in corso nella letteratura sui meriti relativi degli algoritmi. Mentre una parte della discussione si concentra sulla rilevanza clinica dell’identificazione degli anticorpi treponemici in pazienti asintomatici e sull’efficacia in termini di costi di diversi algoritmi di screening (4, 8, 9), un’ulteriore preoccupazione è la prestazione analitica dei test treponemici disponibili sul mercato (10). Sebbene gli studi iniziali suggerissero che il tasso di risultati analitici falsi positivi fosse relativamente basso quando si utilizzavano test di anticorpi treponemici per lo screening (3), un’indagine più recente ha identificato una maggiore frequenza di risultati positivi non confermati (2). Tuttavia, questi risultati sono alquanto difficili da interpretare, poiché sono state utilizzate diverse combinazioni di test di screening e di conferma. Mentre molti studi hanno confrontato le caratteristiche prestazionali di vari test treponemici commercializzati (1, 5, 7), una limitazione è che i risultati della sierologia treponemica sono generalmente considerati come una variabile binaria (cioè “reattiva” rispetto a “non reattiva”) piuttosto che continua. Per risolvere questo problema, abbiamo esaminato se i risultati semiquantitativi forniscono ulteriori informazioni rilevanti per determinare lo stato sierologico di un paziente.
I campioni sono stati analizzati per la presenza di anticorpi treponemici mediante l’uso di due saggi immunologici: il saggio Bioplex 2200 syphilis IgG (SYPHG) (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) e il saggio Trep-Sure (Phoenix BioTech Corp., Oakville, Ontario, Canada). Il saggio Bioplex SYPHG è un saggio immunologico multiplex a base di perline che utilizza antigeni treponemici ricombinanti (Tp15, Tp17 e Tp47) come reagente di cattura, seguito dal rilevamento con un coniugato di IgG-ficoeritrina (PE) anti-umano murino (6). I risultati sono espressi come un” indice anticorpale ” (AI), che è un’unità arbitraria correlata al rapporto tra segnale del campione e tagli definiti dal calibratore. Trep-Sure è un saggio immunoenzimatico basato su micropiastre (EIA) che utilizza anche antigeni treponemici ricombinanti (in una miscela proprietaria) come reagente di cattura, ma utilizza antigeni treponemici coniugati con perossidasi per la rilevazione (11). La misurazione degli anticorpi non retonemici è stata eseguita mediante test rapid plasma reagin (RPR) (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ).
I campioni di studio sono stati selezionati da campioni inviati al nostro laboratorio per test di routine sulla sifilide e analizzati senza conoscere le storie cliniche. Aliquote da campioni che erano reattivi nello screening iniziale Bioplex SYPHG sono stati ulteriormente testati sia dal Trep-Sure EIA e RPR. Il nostro laboratorio serve una popolazione a bassa prevalenza, con un tasso iniziale positivo allo schermo di circa il 3% basato su dati storici (dati non mostrati).
Un totale di 142 campioni che sono stati identificati come reattivi nel test iniziale di screening Bioplex sono stati sottoposti a test di riflesso come descritto sopra. La presenza di anticorpi treponemici è stata confermata dall’EIA treponemica nel 77% (110/142) dei campioni, un tasso simile a quello riportato in precedenti studi multicentrici (3). Tuttavia, la probabilità di conferma era fortemente dipendente sia dallo stato di RPR del paziente che dal valore di SIFG determinato nel test di screening Bioplex (Fig. 1). Lo stato degli anticorpi treponemici è stato confermato da EIA per tutti i campioni RPR-positivi (n = 27), indipendentemente dal valore iniziale di SIFG. Al contrario, risultati discordanti sono stati determinati per il 28% (32/115) dei pazienti RPR-negativi, con una frequenza crescente nei campioni con bassi valori di SIFG nello screening iniziale. L’analisi ROC (Receiver Operating Characteristic) è stata eseguita per identificare un valore di cutoff che fornirebbe un alto livello di specificità per l’identificazione di campioni “true-positivi” (confermati dalla VIA) (Fig. 2). È stato selezionato un valore di cutoff AI di 6,0, che fornisce una specificità del 100% (intervallo di confidenza , da 89,3 a 100,0%). Tutti i campioni con valori di SIFG di screening superiori a questo livello (78/78) sono stati confermati dalla VIA rispetto a solo il 50% (32/64) dei campioni con livelli di SIFG di screening < 6.0 AI (P < 0.0001 ).
Confronto dei risultati degli anticorpi treponemici. Un totale di 142 campioni sono stati testati per gli anticorpi treponemici mediante l’uso di entrambi i test Bioplex e Trep-Sure (EIA), nonché per la reattività RPR. I risultati sono classificati in base al valore del SIFG rilevato nel test iniziale di screening Bioplex.
Analisi ROC dei valori SIFG per la previsione di campioni true-positivi (confermati da EIA). La sensibilità è stata definita come l’identificazione di campioni con risultati reattivi nella VIA di conferma. Il valore per l’area sotto la curva (AUC) è 0,919 (IC al 95%, da 0,87 a 0,96), con una specificità del 100% raggiunta a tutti i valori di IA ≥ 5,8. Viene anche mostrata una tabella di contingenza 2 per 2 costruita usando 6.0 AI come cutoff. Le frequenze dei risultati confermati dalla VIA per i due gruppi erano significativamente diverse (P < 0,0001 ).
Per garantire che questa disparità non fosse dovuta a differenze nella sensibilità analitica tra i saggi Bioplex e Trep-Sure, cinque campioni fortemente positivi (risultati SIFG di > 8.0 AI) sono stati diluiti con siero normale per ottenere valori compresi tra 1.0 e 2.0 AI nel saggio Bioplex. Tutti e cinque questi campioni diluiti hanno dato risultati positivi nel test Trep-Sure, dimostrando che questo test di conferma era in grado di rilevare anticorpi treponemici a queste concentrazioni inferiori. Ciò era coerente con i risultati osservati in campioni RPR-positivi, dove diversi campioni debolmente positivi sono stati comunque confermati da VIA.
Determinare la rilevanza di un risultato positivo di anticorpi treponemici per un paziente con RPR negativo può essere difficile, in particolare in assenza di una chiara anamnesi clinica. Per questo motivo, è fondamentale identificare e ridurre al minimo i risultati analitici falsi positivi. In questa relazione, dimostriamo che il valore SYPHG può aiutare a informare questa decisione e può essere utilizzato quando si sviluppa una strategia per i test reflex. Sebbene il test di screening utilizzato in questo studio non sia stato autorizzato dalla FDA come test quantitativo, questi dati suggeriscono che il risultato di AI semiquantitiative può ancora fornire informazioni utili relative alla necessità di test di conferma. Sulla base di questi dati, offriamo il seguente algoritmo per lo screening della sifilide presso la nostra istituzione. Tutti i campioni che sono reattivi nel test iniziale di screening SYPHG sono ulteriormente testati da RPR. I campioni RPR-positivi non richiedono ulteriori test, indipendentemente dall’IA iniziale nel test SYPHG. Al contrario, i test RPR-negativi con i risultati iniziali del SIFG di < 6.0 sono automaticamente sottoposti a VIA di conferma. Questo algoritmo limita i test di VIA riflessa a circa l ‘ 1% dei campioni inviati per il test della sifilide, ma si concentra sui campioni che hanno più probabilità di avere risultati discordanti.
Una limitazione è che, a causa di una mancanza di standardizzazione dei saggi treponemici di diversi produttori, i valori specifici di SIFG AI identificati in questo studio si applicano solo ai casi in cui lo screening iniziale viene eseguito utilizzando il test Bioplex. Tuttavia, l’approccio qui dimostrato può essere facilmente valutato per altri saggi al fine di determinare il valore di taglio ideale per innescare il test riflesso. Un punto importante è che, quando viene implementato il test di conferma, deve essere eseguito utilizzando un test che abbia una sensibilità analitica per rilevare basse concentrazioni di anticorpi treponemici uguali o migliori di quelli del test di screening. Un’analisi sistematica delle sensibilità analitiche relative degli attuali test treponemici sarebbe uno strumento prezioso per aiutare i laboratori a stabilire algoritmi di test appropriati.
Determinare i meriti relativi dell’uso di saggi treponemici rispetto a quelli non treponemici per valutare i pazienti per l’infezione da sifilide richiede ulteriori studi. Tuttavia, indipendentemente dal metodo, i laboratori dovrebbero sviluppare approcci per identificare i risultati analitici falsi positivi laddove possibile. Comprendere le caratteristiche analitiche delle prestazioni dei saggi treponemici, insieme a stabilire tagli specifici per il test per attivare i test di conferma, è un approccio che può essere utilizzato per aiutare in questo senso, in particolare quando si selezionano popolazioni a bassa prevalenza.