Argomenti
trentuno sano, resistenza addestrati maschi (il 22,1 ± 5.0 anni, 180 ± 0,1 cm, 86.1 ± 13,0 kg, il 18,1 ± 6.4% di grasso corporeo) sono stati informati del protocollo di studio, approvato dal comitato di Revisione Istituzionale presso la Baylor University prima della partecipazione. Lo stato di formazione è stato auto-segnalato e gli individui che mancavano di almeno un anno di esperienza prima dello studio sono stati esclusi. Inoltre, i soggetti sono stati esclusi se: 1) avevano anamnesi di malattia metabolica, ipertensione, epatorenale, muscolo-scheletrica, autoimmune o neurologica; 2) stavano attualmente assumendo farmaci tiroidei, antiiperlipidemici, ipoglicemici, antipertensivi o androgeni; e 3) avevano assunto integratori alimentari che possono influenzare la massa muscolare e/o i livelli di ormone anabolico/catabolico entro tre mesi dall’inizio dello studio.
Test di base
I soggetti idonei sono stati familiarizzati con il protocollo di studio tramite una spiegazione verbale e scritta del design dello studio. I soggetti hanno firmato una dichiarazione di consenso informato e hanno completato storie personali e mediche completando anche un test di capacità anaerobica Wingate prima del test di base. I soggetti sono stati istruiti ad astenersi da un intenso esercizio fisico per 48 ore e digiunare per 10 ore prima del test basale (cioè, giorno 0) che si è verificato 3-4 giorni dopo la familiarizzazione per consentire la registrazione dell’assunzione con la dieta. Questo studio ha impiegato un design di studio parallelo in doppio cieco, controllato con placebo, in cui i soggetti sono stati abbinati uniformemente in cluster in base all’età e alla massa corporea.
Protocollo sperimentale
Durante i giorni 0, 25 e 50 ogni soggetto ha riferito al laboratorio dopo un digiuno di 10 ore. L’altezza è stata misurata utilizzando l’antropometria standard e la massa corporea totale è stata misurata utilizzando una bilancia elettronica calibrata per estensimetri digitali (Bridgeview, IL) con una precisione di ± 0,02 kg. La composizione corporea è stata quindi determinata utilizzando un dispositivo di assorbimento a raggi X a doppia energia (DXA) Hologic Discovery W calibrato (Hologic Inc., Bedford, MA), mentre la pressione sanguigna e la frequenza cardiaca a riposo sono state determinate utilizzando procedure standard. I soggetti hanno quindi donato circa 25 ml di sangue a digiuno utilizzando tecniche di venipuntura standard per pannelli ematologici, di chimica clinica e successivamente analisi di citochine e ormoni. Due provette vacutainer per la separazione del siero da 10 ml e una provetta vacutainer K3 EDTA da 5 ml sono state inserite nel supporto vacutainer per la raccolta del sangue in successione utilizzando tecniche di flebotomia a campione multiplo. Il sangue intero è stato immediatamente analizzato per un esame emocromocitometrico completo mentre le provette di vacutainer sono state centrifugate a temperatura ambiente per 15 min a 1.500 g, il surnatante sierico è stato trasferito in provette per microcentrifuga e i campioni di siero sono stati conservati a -20°C per successive analisi ormonali e metaboliche. Solo nei giorni 0 e 50, i soggetti hanno donato circa 60 mg di muscolo scheletrico dal vasto lateralis utilizzando la tecnica di biopsia di Bergstrom. La resistenza superiore e inferiore del corpo sono state valutate utilizzando procedure di test standard 1RM con una panca e una slitta a 35° (Nebula, Versailles, OH). Test-retest affidabilità di questi test di resistenza su soggetti addestrati alla resistenza nel nostro laboratorio hanno prodotto un’elevata affidabilità per la panca (r = 0,94) e la pressa per gambe (r = 0,91). Dopo la determinazione della slitta dell’anca 1RM, i soggetti si sono riposati 10 minuti prima di completare un test di capacità anaerobica Wingate di 30 secondi su un cicloergometro computerizzato (Lode Excalibur, Lode, Groningen, Paesi Bassi) per valutare la potenza anaerobica della parte inferiore del corpo. Questo test consisteva nell’avere ogni soggetto sprint in modo completo sul cicloergometro per 30 secondi contro un carico di lavoro standard di 0,075 kg·kg-1 di peso corporeo. L’affidabilità dei test-retest per la potenza di picco assoluta e la potenza media nel nostro laboratorio hanno anche prodotto valori di affidabilità elevati (r = 0,69 e r = 0.95, rispettivamente, P < 0.05).
Biopsie muscolari percutanee
Le biopsie muscolari sono state effettuate nei giorni 0 e 50 prima di tutti i test di forza per evitare potenziali interruzioni miofibrillari dovute all’esercizio . I soggetti sono stati istruiti ad astenersi dall’esercizio 48 ore prima di ogni biopsia muscolare. Il muscolo è stato estratto dalla porzione laterale del vasto lateralis a metà strada tra la rotula e la cresta iliaca della gamba dominante utilizzando un ago da biopsia da 5 mm con aspirazione applicata . Brevemente, 1,5 ml di 1.0% Lidocaina HCl è stato iniettato per via sottocutanea prima di effettuare una piccola incisione pilota. Utilizzando le procedure a doppio taglio e l’aspirazione applicata, il campione ha prima rimosso tutto il grasso visibile e il tessuto connettivo prima di essere congelato in azoto liquido. Tutti i campioni sono stati successivamente conservati a -80°C fino ad analisi successive.
Protocollo di supplementazione e monitoraggio dietetico
In doppio cieco, i soggetti hanno ingerito quattro capsule da 250 mg contenenti un placebo di olio di mais o AA (Fattore X, nutrizione molecolare, Giove, FL) per 50 giorni dopo i test di base. Gli integratori sono stati preparati in forma di capsule e confezionati in flaconi generici da Molecular Nutrition. La conformità è stata monitorata facendo restituire ai soggetti le bottiglie di integratore vuote dopo 25 e 50 giorni di supplementazione. In conformità con le linee guida precedenti e nel tentativo di garantire che l’assunzione di energia e proteine fosse adeguata per facilitare l’ipertrofia muscolare, tutti i soggetti sono stati istruiti ad aumentare l’apporto calorico di circa 500 kcal·giorno-1 mantenendo allo stesso tempo un apporto proteico stimato di 2 g·kg-1·giorno-1 rispetto all’analisi dietetica basale . Ai soggetti è stata fornita una polvere sostitutiva del pasto disponibile in commercio (Lean Body, Labrada Nutrition, Houston, TX) contenente circa 290 kilocalorie, 24 g di carboidrati, 45 g di proteine e 1 g di grassi per porzione nel tentativo di soddisfare il fabbisogno energetico e proteico sopra menzionato. A seconda dell’assunzione di proteine al basale, ai soggetti è stato detto di ingerire da 1 a 2 pacchetti del supplemento sostitutivo del pasto al mattino e/o immediatamente dopo ogni allenamento . Inoltre, i soggetti sono stati istruiti per evitare il consumo regolare di alimenti noti per essere di alta ω-3 acidi grassi di olio di pesce, olio di semi di lino, pesce di acqua fredda, olio di oliva, olio di sesamo, burro di arachidi, N-acetil-cisteina, acido linoleico coniugato, così come farmaci anti-infiammatori tra cui il paracetamolo, l’ibuprofene, l’aspirina e altri farmaci non steroidei anti-infiammatori . Assunzione alimentare così come linoleico (18: 2, ω-6), linolenico (18:3, ω-3) e l’assunzione di AA sono state monitorate con richiami dietetici di 4 giorni ai giorni 0, 25 e 50 e valutate utilizzando il software alimentare III Nutrition (ESHA Nutrition Research, Salem, OR).
Protocollo di allenamento di resistenza
In un periodo di 50 giorni, i soggetti hanno completato un programma di allenamento di resistenza a periodizzazione lineare di 4 giorni·settimana-1. Parte superiore del corpo ascensori inclusi bench press, lat pull, shoulder press, righe seduti, spalle scrollate di spalle, mosche petto, bicipiti riccioli, e tricipiti press-down mentre inferiore del corpo ascensori inclusi leg press, estensione posteriore, step up, riccioli gamba, leg extension, heel solleva, e scricchiolii addominali due volte a settimana. I soggetti hanno eseguito 3 serie di 10 ripetizioni con il peso che potevano sollevare per set (cioè 60-80% di 1RM). I periodi di riposo tra gli esercizi non superavano i 3 minuti, mentre il resto tra le serie non superava i 2 minuti. La formazione è stata condotta presso lo student life center dell’università, documentata nei registri di formazione e firmata da membri del personale designati per verificare la conformità e monitorare i progressi. Questo protocollo è stato indicato nella ricerca precedente per promuovere i guadagni significativi nella forza muscolare, nella resistenza muscolare e nella massa libera grassa .
Analisi del siero e del sangue intero
Campioni di siero e sangue intero sono stati utilizzati per valutare la sicurezza clinica durante i protocolli di integrazione. Serum samples were assayed for comprehensive metabolic panels including glucose, total protein, blood urea nitrogen (BUN), creatinine, BUN/creatinine ratio, uric acid, aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), creatine kinase (CK), lactate dehydrogenase (LDH), gamma-glutamyl transpeptidase (GGT), albumin, globulin, sodium, chloride, calcium, carbon dioxide, total bilirubin, alkaline phosphatase (ALP), triglycerides, cholesterol, HDL and LDL using a Dade Dimension XL clinical chemistry system (Dade Behring Inc., Newark, DE). La conta completa dei globuli rossi, l’emoglobina, l’ematocrito, il volume medio delle cellule, l’emoglobina corpuscolare media, la concentrazione di emoglobina corpuscolare media, la larghezza di distribuzione dei globuli rossi, la conta dei globuli bianchi, i neutrofili, i linfociti, i monociti, gli eosinofili e i basofili sono stati analizzati tramite citometria a flusso utilizzando Cell-DYN 1800 (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). Test per testare l’affidabilità (all’interno e tra) di eseguire questi saggi variava dal 2 al 6% per i singoli saggi con un coefficiente medio di variazione (C V ) del 3,0%. I campioni sono stati eseguiti in duplice copia per verificare i risultati se i valori osservati erano al di fuori dei valori di controllo e/o delle norme cliniche secondo le procedure standard.
Campioni di siero successivi sono stati successivamente analizzati per cortisolo (CORT), testosterone libero (fTEST), testosterone totale (tTEST), interleuchina-6 (IL-6), prostaglandina E2 (PGE2) e prostaglandina F2a (PGF2a). I test immunoassorbenti enzimatici commerciali sono stati utilizzati per analizzare le concentrazioni sieriche di PGF2a, PGE2 e IL-6 (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) e CORT, fTEST e tTEST (Diagnostic Systems Laboratories, Webster, TX). La C V di eseguire questi saggi basati sulla VIA variava dal 3,0 al 5,0%.
Isolamento totale di RNA
L’RNA cellulare totale è stato estratto dall’omogenato di campioni bioptici con una soluzione monofasica di fenolo e isotiocianato di guanidina contenuta all’interno del TRI-reagente (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Le concentrazioni totali di RNA di ciascun campione sono state determinate spettrofotometricamente con una densità ottica di 260 nm (OD260), con concentrazione finale regolata a 200 ng·µl-1 diluendo gli estratti di RNA totali grezzi in H2O privo di nucleasi trattati con DEPC. Questa procedura ha dimostrato di produrre RNA non degradato, privo di DNA e proteine come indicato dalle bande di RNA ribosomiali 28S e 18S prominenti, nonché un rapporto OD260/OD280 di circa 2,0 . I campioni di RNA sono stati conservati a -80°C fino ad analisi successive.
Trascrizione inversa e sintesi del DNA clonale
Le soluzioni standardizzate dell’RNA cellulare totale sono state trascritte per sintetizzare il DNA clonale (cDNA) come descritto in precedenza . In breve, una miscela di reazione di trascrizione inversa è stata incubata a 42°C per 40 minuti, riscaldata a 85°C per 5 minuti e poi raffreddata rapidamente su ghiaccio producendo il prodotto cDNA. Le concentrazioni iniziali del modello di cDNA sono state standardizzate a 200 ng * µl-1 prima dell’amplificazione della reazione a catena della polimerasi (RT-PCR) in tempo reale rilevando spettrofotometricamente i prodotti grezzi sintetizzati da cDNA a una lunghezza d’onda di 260 nm e diluendoli in H2O privo di nucleasi. Le soluzioni di cDNA standardizzate sono state congelate a -80°C fino a
RT-PCR
Le coppie di primer oligonucleotidici anti-sense e sense sono state costruite utilizzando il software Beacon Designer disponibile in commercio (Bio-Rad, Hercules, CA) da sequenze di mRNA note pubblicate nel database nucleotidico GenBank e sintetizzate commercialmente (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). I seguenti primer oligonucleotidici 5 ‘sense e 3′ anti-sense sono stati utilizzati per isolare le tre isoforme MHC adulte (Tipo I, IIa e IIx): Tipo I MHC mRNA (5′ primer: basi 776-796, 3’ primer: basi 1398-1378, GenEMBL AC X06976), Tipo IIA MHC mRNA (5 ‘ primer: basi 1785-1805, 3’ primer: basi 2440-2420, GenEMBL AC AF111784), tipo IIX MHC mRNA (5 ‘primer: basi 1138-1158, 3’ primer: basi 1746-1726, GenEMBL AC AF111785). Questi primer amplificano frammenti di 141, 145 e 148 coppie di basi, rispettivamente, per il tipo I, IIa, IIX MHC. la β-actina è stata utilizzata come standard di riferimento esterno per rilevare il cambiamento relativo nella quantità di mRNA target a causa della sua considerazione come gene di pulizia costitutivamente espresso , Questi primer β-actina amplificano un frammento di PCR di 135 coppie di basi. Duecento ng di cDNA sono stati aggiunti a ciascuna delle quattro reazioni PCR per MHC di tipo I,- IIa, e-IIx e β-actina. In particolare, ciascuna reazione PCR conteneva le seguenti miscele: 2 µl di modello cDNA sono stati aggiunti insieme a 12,5 µl di 2× SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA) , 1,5 µl di primer sense e anti-sense e 7,5 µl DH2O privo di nucleasi]. Ogni reazione PCR è stata amplificata con un termociclatore (Bio Rad, Hercules, CA) e la sequenza di amplificazione ha comportato una fase di denaturazione a 95°C per 30 secondi, ricottura del primer a 55°C per 30 secondi ed estensione a 72°C per 60 secondi . RT-PCR è stata eseguita su 40 cicli con fluorescenza emessa dal fluoroforo verde SYBR misurata dopo ogni ciclo. Un’emissione di fluorescenza si verifica a causa dell’integrazione del SYBR green nel cDNA a doppio filamento prodotto durante la reazione PCR. Tutti i valori CT sono stati valutati nella porzione lineare di amplificazione e un’analisi della curva di fusione del DNA è stata eseguita dopo l’amplificazione per assicurare che i singoli prodotti genici fossero amplificati in assenza di primer-dimeri. La quantificazione di tutti gli mRNA è stata espressa rispetto all’espressione di β-actina. Un confronto dei rapporti di valore CT è stato utilizzato per confrontare i cambiamenti nell’espressione genica basale tra i gruppi AA e PLA. L’elettroforesi su gel di agarosio utilizzando aliquote 25 µl delle miscele di reazione PCR finalizzate è stata eseguita in 1.gel di agarosio al 5% con tampone 1× acido tris-borico-EDTA (TBE) e illuminato con un transilluminatore UV (Chemi-Doc XRS, Bio-Rad, Hercules, CA) per verificare l’amplificazione positiva dell’mRNA target (dati non mostrati) . Il C V per MHC I, IIa, e IIx erano 2,06%, 3,18%, e 2,73%, rispettivamente .
Quantificazione totale delle proteine muscolari
La proteina totale rimanente dalla procedura di isolamento dell’RNA totale è stata isolata con isopropanolo, etanolo e 0,3 M di guanidina cloridrato. La proteina miofibrillare è stata isolata con 0.1% di sodio dodecil solfato (SDS), prima di avere il contenuto proteico determinato spettrofotometricamente utilizzando un test di Bradford a una lunghezza d’onda di 595 nm. Una curva standard è stata generata utilizzando (r2 = 0.98, P < 0.001) albumina sierica bovina come standard e rappresentata rispetto al peso bagnato muscolare . Ogni campione proteico è stato successivamente diluito a 50 µg di proteina per tampone SDS da 30 µl per il successivo immunoblotting. La C V per la proteina miofibrillare è stata del 2,03%.
MHC protein isoform quantation
La composizione delle isoforme proteiche MHC all’interno di ciascun campione di omogenato muscolare è stata determinata mediante SDS-PAGE automatizzata utilizzando chip Experion Pro260 (Bio-Rad, Hercules, CA). Circa 6 µl di aliquote di ciascun campione sono state pipettate in ciascun pozzetto del campione sul microchip. Ogni campione sconosciuto è stato preparato da 4 µl della diluizione proteica di ciascun soggetto (o 4 µl della scala del peso molecolare), 2 µl di tampone del campione con β-mercaptoetanolo e 84 µl di acqua deionizzata. Sulla base dei risultati di Gazith e colleghi , ci si aspettava che tutte e tre le isoforme MHC migrassero nella regione 200-210 kiloDaulton all’interno del gel di poliacrilammide rispetto alla scala del peso molecolare. I gel sono stati visualizzati digitalmente dal software Experion (Bio-Rad, Hercules, CA) e le concentrazioni di MHC in ciascun campione sono state valutate confrontando la densità arbitraria di ciascuna isoforma MHC con le densità arbitrarie dei marcatori di peso molecolare con concentrazioni note. Il C V delle bande proteiche ≥10 kD era ≤1,1%.
Immunoblotting proteico
La quantificazione dei recettori PGF2a (FP) e PGE2 (EP3) è stata eseguita a temperatura ambiente estraendo la proteina muscolare totale dall’omogenato e tamponando 50 µg di proteina totale sulle membrane di nitrocellulosa utilizzando un sistema di blotting proteico Bio-Dot (Bio-Rad, Hercules, CA). Le membrane tamponate sono state incubate con una soluzione di blocco per 1 ora su un bilanciere orbitale, decantate e le membrane sono state incubate con una soluzione di lavaggio TTBS per 5 minuti per un totale di tre lavaggi. Le membrane sono state incubate con anticorpi policlonali specifici anti-recettore FP e anti-recettore EP3 (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI), diluiti a 4 µg·ml-1, per 1 o 2 ore su un bilanciere orbitale. Le soluzioni anticorpali primarie sono state quindi decantate e le membrane lavate con soluzione TTBS per 5 minuti su un bilanciere orbitale per un totale di tre lavaggi. La soluzione di lavaggio TTBS è stata decantata e le membrane sono state incubate con una soluzione anticorpale secondaria biotinilata di capra anti-coniglio (Bio-Rad, Hercules, CA) per 1 ora su un bilanciere orbitale. Continuando, la soluzione anticorpale secondaria biotinilata di capra anti-coniglio è stata decantata e le membrane incubate in soluzione di lavaggio TTBS per un totale di tre lavaggi a 5 minuti per lavaggio. Le membrane sono state incubate con una soluzione complessa di fosfatasi alcalina streptavidina-biotinilata (Bio-Rad, Hercules, CA) per 1 ora su un bilanciere orbitale. Infine, la soluzione del complesso di fosfatasi alcalina streptavidina-biotinilata è stata decantata e le membrane lavate tre volte con soluzione TTBS a 5 minuti per lavaggio su uno shaker orbitale. È stata aggiunta una soluzione di sviluppo del colore contenente BCIP/NBT (Bio-Rad, Hercules, CA) e lo sviluppo del colore è stato monitorato per 30-60 minuti. Lo sviluppo del colore è stato interrotto incubando la membrana in doppio distillato H2O per 10 minuti su un rocker orbitale. Le membrane macchiate sono state digitalizzate mediante densitometria utilizzando un sistema di imaging XRS Chemi-Doc (Bio-Rad, Hercules, CA) e la densità di banda è stata espressa in unità di densità integrate rispetto al peso muscolare.
Analisi statistica
Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando SPSS (versione 14.0, SPSS Inc., Chicago, IL). Le variabili di sangue intero, siero, prestazioni e composizione corporea sono state analizzate utilizzando 2 × 3 (group × testing session) analisi della varianza (ANOVA) con misure ripetute test univariati. I livelli proteici del recettore MHC, FP e EP3 sono stati analizzati utilizzando ANOVA separata 2 × 2 (gruppo × sessione di test) con misure ripetute. Inoltre, nel caso di un effetto principale significativo per il gruppo, sono state eseguite ANOVA unidirezionali con misure ripetute sulle sessioni di test per ciascun gruppo per valutare eventuali differenze tra i test. I t-test indipendenti sono stati utilizzati per analizzare i cambiamenti nell’espressione dell’mRNA MHC dopo 50 giorni di supplementazione. Oltre all’analisi del punteggio grezzo, è stata eseguita l’analisi del punteggio delta (cioè i valori del giorno 0 sottratti dal giorno 25 e/o 50) per le variabili che mostravano variazioni estranee tra i gruppi al giorno 0. Come accennato con punteggi grezzi, un 2 × 3 (gruppo × sessione di test) analisi della varianza (ANOVA) con misure ripetute test univariati è stato utilizzato per analizzare i punteggi delta per la composizione corporea, le variabili di performance, e le concentrazioni ormonali, mentre un 2 × 2 misure ripetute ANOVA è stato utilizzato per analizzare tutti i punteggi delta intramuscolari. In circostanze in cui non è stato possibile assumere variazioni uguali all’interno dei gruppi, il fattore di correzione di Hunyhs-Feldt epsilon è stato utilizzato per regolare all’interno dei rapporti F del gruppo. In circostanze in cui le tendenze statistiche sembravano esistere (cioè, P = 0,05 a 0.10), le dimensioni degli effetti sono state riportate anche come parziale Eta al quadrato (np2). Le dimensioni parziali dell’effetto Eta al quadrato sono state determinate come deboli (np2 ≤ 0,01), medie (np2 = 0,06), forti = (np2 = 0,14) come descritto in precedenza . La significatività per tutte le analisi statistiche è stata determinata utilizzando un livello alfa di 0,05. Va notato che un’analisi di potenza a priori del progetto ha indicato che una dimensione n di 15 partecipanti per trattamento produrrebbe una potenza elevata (> 0,8) per valori delta variabili di criterio da 0,75 a 1,25. Va inoltre notato che l’analisi dei valori anomali post hoc utilizzando i grafici a caselle è stata eseguita in circostanze in cui vi erano interazioni significative di gruppo × tempo per garantire che non fossero presenti valori anomali. Tutti i dati sono riportati come media ± deviazioni standard (SD).