Materiales
Cultivo celular
Se obtuvieron células de melanoma humano Mel Z, Mel IL y Mel MTP del material tumoral de pacientes en tratamiento en el Centro Nacional de Oncología N. N. Blokhin 50. Los fibroblastos BJ-5ta y las células SK-BR-3 de cáncer de mama procedían de CCTA. Las otras celdas fueron proporcionadas amablemente por los doctores E. Svirchevskaya y E. Kovalenko (Instituto Shemyakin – Ovchinnikov de Química Bioorgánica RAS, Moscú, Rusia). Todas las células se cultivaron en un medio de crecimiento RPMI-1640 suplementado con 10% de FBS, 2 μМ L-glutamina, 100 µg/mL de estreptomicina y 100 U/ml de penicilina a 37 °C en una atmósfera humidificada de CO2 al 5%. El medio se reemplazaba cada 3-4 días. El contenido de melanina se estimó midiendo el espectro de absorción en lisados de células DMSO (106 células por ml) utilizando un espectrofotómetro UV-Vis Cary 50.
Citometría de flujo
Las células se recolectaron con solución Versene, se peletizaron por centrifugación a 300 g durante 5 min y se resuspendieron en medios RPMI-1640 sin suero a la concentración final de 106 células por ml. Luego, se transfirieron 100 µl de la suspensión celular a los tubos protegidos por la luz para la citometría de flujo. Inmediatamente antes de los experimentos se prepararon soluciones de trabajo apropiadas de FMN en medio RPMI-1640. Estas soluciones de FMN se añadieron a los tubos, y la concentración final de FMN fue de 10 µM, 30 µM y 100 µM. Luego, las células se incubaron en la oscuridad en una incubadora de CO2 durante 30 minutos. Al final de la incubación, se añadió 1 ml de PBS frío a cada tubo, y las células se centrifugaron (300 g, 4 °C) durante 5 min. Se eliminó el sobrenadante y se resuspendieron las células en 300 µl de PBS frío y se transfirieron al hielo. La fluorescencia se examinó utilizando un citómetro de flujo NovoCyte 2000R (ACEA Biosciences) y el software NovoExpress v.1.2.4. La fluorescencia se midió en un canal correspondiente a la fluorescencia FITC, y se examinaron al menos 10.000 eventos para cada muestra. Para estimar el nivel de acumulación de FMN en las células, se determinaron los valores medios de fluorescencia en cada muestra, y luego se calculó el nivel de fluorescencia relativo (F) de acuerdo con la siguiente fórmula:
Microscopía confocalcélulas h3>
se sembraron en placas de 96 pocillos (5 × 103 por pocillo) seguidas de incubación nocturna. Luego, se agregaron a las células 100 µL de soluciones de trabajo adecuadas de FMN (10 µM, 30 µM y 100 µM) en medio RPMI-1640 y la placa se incubó en la oscuridad en una incubadora de CO2 durante 30 minutos. Después de eso, las células se lavaron 3 veces con PBS frío y se teñieron adicionalmente con tinte Hoechst 33258 (50 µM) durante 15 min. Las imágenes ópticas y los datos de intensidad de fluorescencia se obtuvieron utilizando InCell Analyzer 6000 y en el software para estaciones de trabajo Cell Analyzer v.3.7.3 (GE Healthcare, EE. UU.).
Los estudios de citotoxicidad
Las células se sembraron en una placa de 96 pocillos (5 × 103 células por pocillo), seguida de incubación nocturna. Inmediatamente antes de los experimentos se prepararon soluciones de trabajo apropiadas de FMN en medio RPMI-1640 completo. A continuación, se retiró el medio de la placa de 96 pocillos y se añadieron alícuotas de solución FMN (100 µl) en cada pocillo. Para inducir la fotoactivación de FMN, las placas se trataron con luz a 450 nm, dosis de irradiación 0,2 J / cm2-7 J / cm2. Se utilizaron células sin tratamiento como controles (100%). La viabilidad celular se determinó mediante el ensayo MTT tras 48 h de incubación. Para este propósito, las células se trataron con solución de MTT (0,5 mg/ml en RPMI-1640) durante 3 h. Luego, el medio se reemplazó con 100 µl de DMSO para disolver los cristales de formazán formados. La densidad óptica (do) a 570 nm se midió utilizando Varioskan Flash reader (Thermo Scientific, USA). La viabilidad de las células (V) después del tratamiento con FMN se expresó en % en comparación con el control de acuerdo con la siguiente ecuación:
Con el objetivo de determinar la citotoxicidad de los fotoproductos FMN, se irradiaron soluciones de trabajo adecuadas de FMN en medio RPMI-1640 completo a 450 nm (5 J/cm2) y se incubaron durante la noche. A continuación, estas alícuotas de FMN (100 µl) se añadieron a las células y se incubaron durante 48 h. El ensayo MTT se realizó como se describió anteriormente.
Para determinar la fototoxicidad mediada por ROS, se añadieron alícuotas de solución de FMN (100 µl) en cada pocillo y se trataron con luz a 450 nm (5 J/cm2). Los medios que contenían FMN se retiraron inmediatamente después del tratamiento y las células se incubaron en medios RPMI-1640 frescos durante 48 h. El ensayo de MTT se realizó como se describió anteriormente.
Ensayo de apoptosis y necrosis
Las células se sembraron en placas de 96 pocillos (5 × 103 células por pocillo) seguidas de incubación nocturna. Luego, se agregaron a las células 100 µL de soluciones de trabajo adecuadas de FMN (10 µM, 30 µM y 100 µM) en medio RPMI-1640 y la placa se incubó en la oscuridad en una incubadora de CO2 durante 30 minutos. Después de eso, las células fueron irradiadas con láser de 450 nm a una dosis de 5 J/cm2. Luego, las células se lavaron consistentemente con PBS frío y tampón de unión y se teñieron con anexina V-FITC, yoduro de propidio (PI) y Hoechst 33258 a temperatura ambiente en tampón de unión durante 15 min. Las imágenes ópticas y los datos de intensidad de fluorescencia se obtuvieron utilizando InCell Analyzer 6000 y en el software para estaciones de trabajo Cell Analyzer v.3.7.3 (GE Healthcare, EE. UU.).
Producción de electrodos
Los nanoelectrodos de carbono se grabaron en una solución KCl de NaOH de 0,1 m y 10 mm durante 30-40 ciclos durante 10 segundos cada uno para crear una cavidad en la superficie de carbono. El potencial aplicado fue en forma de V con una amplitud de 1,5–2 V. La deposición de platino se llevó a cabo barriendo el potencial de 0 a -1500 mV vs Ag/AgCl en una solución que contenía ácido cloroplatínico de 2 mM (H2PtCl6, Sigma). Se obtuvieron voltammogramas cíclicos en metanol de ferroceno de 1 mM (FcMeOH, Sigma) para el electrodo de carbono inicial, para el electrodo con nanocavidades y con platino para controlar el proceso de producción. La deposición de Pt solo aumentó ligeramente el área de superficie geométrica efectiva del nanoelectrodo (como lo demuestra el voltammograma para la oxidación de 1 mm FcMeOH), pero mejoró drásticamente su actividad catalítica hacia la reducción de ROS. El nanoelectrodo se polarizó a 600 mV vs Ag/AgCl (para la detección limitada por difusión de H2O2) y se acercó manualmente al líquido o a la superficie de una sola célula cancerosa. Para la calibración se utilizaron soluciones con diferentes concentraciones de H2O2 (Sigma) en el rango de 10-7-10-4 M.
Medición de ROS con sonda electroquímica
Los resultados se obtuvieron tal y como se describió anteriormente 47 con algunas alteraciones. Por lo tanto, la modificación introducida de los electrodos utilizados en este trabajo es la mejor adhesión del electrodo de platino al electrodo de carbono debido al grabado de una cavidad en la capa de carbono antes de la deposición de Pt. Los nanoelectrodos de carbono en forma de disco, disponibles comercialmente, aislados en cuarzo (ICAPPIC Limited, Reino Unido) con un diámetro de 100-500 nm, se utilizaron para la producción de sensores para la detección de ROS. La superficie de carbono relativamente inerte del electrodo se funcionalizó aún más para la detección de especies activas redox. Una capa de platino electrodepositado mejora la actividad electrocatalítica al reducir drásticamente el exceso de potencial producido por la reducción de especies reactivas de oxígeno. Para mejorar la adhesión del platino al tapón de carbono, grabamos una nanocavidad en el electrodo de carbono. Hemos utilizado un método electroquímico para crear pequeñas muescas en las puntas de los nanoelectrodes51 de carbono. La fabricación de nanosensores de platino se realizó en dos etapas: grabado en solución alcalina y platinización. Todas las etapas se controlaron con precisión mediante mediciones electroquímicas. Creemos que el nanoelectrodo es sensible tanto a las formas ROS de vida corta como a las de vida larga. Recientemente hemos demostrado que la producción de oxígeno singlete en solución acuosa de mononucleótido de flavina (FMN) es inducida por irradiación de luz azul. En base a este resultado, demostramos (datos complementarios 9) la respuesta del nanoelectrodo de carbono polarizado a +800 mV frente a Ag/AgCl en la producción de ROS en solución acuosa de FMN bajo irradiación de luz azul.
Las células se sembraron en una placa de Petri seguida de incubación nocturna. Luego, las células se incubaron durante 30 minutos con FMN de 100 µM en la oscuridad y se lavaron 3 veces con PBS. Luego, el nanoelectrodo platinado se introdujo cuidadosamente mediante el uso del micromanipulador preciso en la célula única bajo control óptico con microscopio invertido. Para la manipulación y ajuste de electrodos utilizamos micromanipulador PatchStar (Scientifica, Reino Unido). Recolectamos datos voltamperométricos cíclicos con amplificador de abrazadera de parche Modelo 2400 (A-M Systems, EE.UU.). La grabación de la señal se realizó con el dispositivo multifuncional de E/S USB-6211 (National instruments, EE.UU.) y el programa de computadora WinWCP. Todas las mediciones se realizaron en la mesa del microscopio invertido Nikon (Japón). En todas las mediciones se utilizó electrodo Ag/AgCl como electrodo de referencia.
Medición de ROS con sonda fluorescente
La evaluación del ROS citoplasmático se realizó utilizando la sonda fluorescente CellROX de color Rojo Profundo (Sondas Moleculares/Termo). Brevemente, se sembraron células de melanoma Mel IL y M-3 (5 × 103) en placas de 96 pocillos (Nunc, Dinamarca) y se incubaron con 2,5 µM de CellROX Deep Red en medios RPMI-1640 completos durante 30 minutos y se lavaron en PBS tres veces. A continuación, se añadieron 100 µL de soluciones de trabajo adecuadas (10 µM, 30 µM y 100 µM) de FMN en medio RPMI-1640 sin Rojo fenólico a las células y la placa se incubó en la oscuridad en una incubadora de CO2 durante 30 minutos. Después de eso, las células fueron irradiadas con láser de 450 nm a una dosis de 5 J/cm2. Los núcleos celulares se tiñeron adicionalmente con 50 µM de solución de tinte Hoechst 33258 durante 15 min. Se obtuvieron imágenes ópticas y datos de intensidad de fluorescencia de color rojo intenso CellROX de células de melanoma Mel IL y A375 utilizando InCell Analyzer 6000 y en el software para estaciones de trabajo Cell Analyzer v. 3.7.3 (GE Healthcare, EE. UU.).
Determinación del contenido de melanina
Utilizamos el ensayo de rutina para la determinación de melanina por espectrofotometría con cambios minúsculos52. Se contaron y peletearon cuatro líneas celulares de melanoma: Mel MTP, Mel IL, Mel Z, A375 y dos líneas celulares normales (queratinocitos humanos HaCaT y fibroblastos de piel humana BJ-5ta) para obtener una concentración final de 2 × 106 células/ml. Para la determinación del contenido de melanina intracelular, se disolvieron gránulos celulares en NaOH de 1 M con un contenido de DMSO del 10% (v/v) y se incubaron a 80 °C durante 1 h. Después de la incubación, los lisados se centrifugaron (3000 g durante 5 min) y la absorbancia se midió en medios libres de células a 405 nm. Todos los resultados se expresan como valor medio de las intensidades de absorbancia normalizadas al contenido de melanina en fibroblastos ± desviación estándar (DE) de tres experimentos independientes. El análisis estadístico se realizó con GraphPad Prism versión 5.0 (Software GraphPad, La Jolla California USA).
Experimentos con animales
Terapia de tumores primarios
Ratones macho Balb/c nu / nu de 6-7 semanas de edad se compraron en la granja de animales del Instituto de Química Bioorgánica Shemyakin–Ovchinnikov, Academia de Ciencias de Rusia, y se alojaron en condiciones ambientales controladas en el gabinete de ventilación para animales, caja A 80 (Noroit, Francia) a un ciclo de luz oscura de 12 h y se les permitió el acceso a agua estéril y comida de ratón con FPS libremente. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices nacionales europeas y rusas para la experimentación con animales y fueron aprobados por el comité de revisión ética y de animales del FSBSI «N. N. Blokhin NMRCO», número de referencia 2017-034.
Para establecer un modelo de ratón xenoinjerto, se recolectaron células Mel IL y A375 con solución Versene, se peletizaron por centrifugación a 300 g durante 5 min y se resuspendieron en medios RPMI-1640 sin suero. La suspensión de células de melanoma fue mixta (1:1 volumen) con Matrigel (BD Biosciences) y la suspensión celular obtenida (2 × 106 células por inyección) se implantó por vía subcutánea en el flanco derecho de los ratones para asegurar el inicio exitoso del tumor y las mediciones de crecimiento tumoral.
La administración de FMN comenzó el día 10 después de la inoculación, cuando el tamaño del tumor alcanzó los 100-120 mm3. La solución de FMN (150 µl, 10 µg/ml) se inyectó en los ratones por vía intravenosa a través de un seno retroorbital, y los tumores se irradiaron con luz azul a 450 nm durante 15 minutos hasta la dosis final de 20 J/cm2.
El volumen tumoral se estimó mediante el método estándar de clasificación y se calculó mediante la siguiente fórmula, asumiendo una forma hemi-elipsoide:
La actividad antitumoral del FMN fotoactivado se determinó mediante la evaluación de la tasa de inhibición del crecimiento tumoral (TGI%) calculada como:
Terapia fotodinámica de tumores distantes
Utilizamos ratones C57BL/6 a las 6-7 semanas de edad, comprados en la granja de animales del Instituto de Química Bioorgánica Shemyakin–Ovchinnikov, Academia Rusa de Ciencias. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices nacionales europeas y rusas para la experimentación con animales y fueron aprobados por el comité de revisión ética y de animales de la FSBI «N. N. Blokhin NMRCO», número de referencia 2017-034.
Las células de melanoma de ratón B16-F10 se recolectaron con solución Versene, se peletizaron por centrifugación a 300 g durante 5 minutos y se resuspendieron en medios RPMI-1640 sin suero. La suspensión de células de melanoma se mezcló (volumen 1:1) con Matrigel (BD Biosciences) y la suspensión de células obtenida (5 × 105 células por inyección) se implantó por vía subcutánea en el flanco derecho e izquierdo de los ratones para asegurar el inicio exitoso del tumor y las mediciones de crecimiento tumoral.
La administración de FMN comenzó el día 4 después de la inoculación, cuando el tamaño del tumor alcanzó 60 ± 16 mm3 de solución de FMN (150 µl, 10 mg/ml) se inyectó en los ratones por vía intravenosa a través de un seno retroorbitario, y los tumores se irradiaron con luz azul a 450 nm durante 15 min hasta la dosis final de 20 J / cm2. Se utilizaron dos grupos de control: inyección de FMN sin irradiación de luz; irradiación láser sin inyección de FMN. El volumen tumoral y la actividad antitumoral de la FMN fotoactivada se estimaron como se describió anteriormente.
Tinción de hematoxilina y eosina
Los animales fueron sacrificados por dislocación cervical en 24 horas después de la TFD. Todos los tumores recolectados se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 24 h y luego se incrustaron con parafina. Se teñieron secciones de tejido (4 µm de grosor) con hematoxilina y eosina.
Análisis estadístico
Todos los experimentos se realizaron por triplicado a menos que se indique lo contrario, y cada experimento se repitió tres veces de forma independiente. Los datos se expresan como media ± DE. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando los valores de P fueron menores de 0,05. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el software GraphPad Prism (Software GraphPad, La Jolla, San Diego, CA, EE.UU.).