materiały
kultura komórkowa
czerniaka ludzkiego Mel z, Mel IL i Mel MTP uzyskano z materiału nowotworowego pacjentów poddawanych leczeniu w Narodowym Centrum Badań Medycznych Onkologii im. N. N. Blokhina 50. Fibroblasty BJ-5ta i komórki raka piersi SK-BR-3 pochodziły z ATCC. Pozostałe komórki zostały uprzejmie dostarczone przez Dr. E. Svirchevskaya i E. Kovalenko (Shemyakin – Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry RAS, Moskwa, Rosja). Wszystkie komórki hodowano w pożywce wzrostowej rpmi-1640 uzupełnionej 10% FBS, 2 μМ L-glutaminy, 100 µg/mL streptomycyny i 100 U/mL penicyliny w temperaturze 37 °C w 5% nawilżonej atmosferze CO2. Podłoże wymieniano co 3-4 dni. Zawartość melaniny oszacowano mierząc widmo absorpcji w lizatach komórek DMSO (106 komórek na ml) przy użyciu spektrofotometru Cary 50 UV-Vis.
cytometria przepływowa
komórki zebrano roztworem Versenu, granulowano przez odwirowanie w 300 g przez 5 minut i zawieszono w pożywce RPMI-1640 bez surowicy do końcowego stężenia 106 komórek na ml. Następnie 100 µl zawiesiny komórkowej przeniesiono do rurek zabezpieczonych światłem w celu przeprowadzenia cytometrii przepływowej. Bezpośrednio przed eksperymentami przygotowano odpowiednie roztwory robocze FMN w pożywce RPMI-1640. Te roztwory FMN dodano do rurek, a końcowe stężenie FMN wynosiło 10 µM, 30 µM i 100 µM. Następnie komórki inkubowano w ciemności w inkubatorze CO2 przez 30 minut. Pod koniec inkubacji do każdej probówki Dodano 1 ml zimnego PBS i komórki odwirowywano (300 g, 4 °C) przez 5 minut. Supernatant usunięto i komórki ponownie zawieszono w 300 µl zimnego PBS i przeniesiono do lodu. Fluorescencję badano za pomocą cytometru przepływowego NovoCyte 2000r (ACEA Biosciences) i oprogramowania NovoExpress V. 1. 2. 4. Fluorescencję mierzono na kanale odpowiadającym fluorescencji FITC i zbadano co najmniej 10 000 zdarzeń dla każdej próbki. Aby oszacować poziom akumulacji FMN w komórkach, określono medianę wartości fluorescencji w każdej próbce, a następnie obliczono względny poziom fluorescencji (F) według następującego wzoru:
mikroskopia konfokalna
komórki wysiewano w 96-studzienkowych płytkach (5 × 103 komórki na studzienkę), a następnie przez noc inkubowano. Następnie do komórek dodano 100 µL odpowiednich roztworów roboczych FMN (10 µM, 30 µM i 100 µM) w pożywce RPMI-1640 i płytkę inkubowano w ciemności w inkubatorze CO2 przez 30 minut. Następnie komórki przemywano 3 razy zimnym PBS i dodatkowo barwiono barwnikiem Hoechst 33258 (50 µM) przez 15 minut. Obrazy optyczne i dane o intensywności fluorescencji uzyskano za pomocą InCell Analyzer 6000 oraz w oprogramowaniu Cell Analyzer Workstation V. 3. 7 .3 (GE Healthcare, USA).
badania cytotoksyczności
komórki wysiewano w 96-studzienkowej płytce (5 × 103 komórki na studzienkę), a następnie przez noc inkubowano. Odpowiednie roztwory robocze FMN w pełnym pożywce RPMI-1640 zostały przygotowane bezpośrednio przed eksperymentami. Następnie nośnik usunięto z płytki 96-studzienkowej i dodano do każdej studzienki alikwoty roztworu FMN (100 µl). W celu wywołania fotoaktywacji FMN, płytki poddano działaniu światła o długości fali 450 nm, dawka napromieniowania 0,2 J / cm2–7 J / cm2. Jako grupę kontrolną (100%) wykorzystano komórki bez żadnego leczenia. Żywotność komórek oznaczano metodą MTT po 48 h inkubacji. W tym celu komórki potraktowano roztworem MTT (0,5 mg / ml w RPMI-1640) przez 3 godziny. następnie podłoże zastąpiono 100 µl DMSO w celu rozpuszczenia utworzonych kryształów formazanu. Gęstość optyczną (OD) Przy 570 nm mierzono za pomocą czytnika Flash Varioskan (Thermo Scientific, USA). Żywotność komórek (V) po leczeniu FMN wyrażono w % w porównaniu z kontrolą według następującego równania:
w celu określenia cytotoksyczności fotoproduktów FMN, odpowiednie roztwory robocze FMN w pełnym ośrodku RPMI-1640 napromieniowano przy 450 nm (5 J/cm2) i inkubowano przez noc. Następnie te alikwoty FMN (100 µl) dodano do komórek i inkubowano przez 48 godzin.
w celu określenia fototoksyczności pośredniczonej przez ROS, do każdej studzienki dodano alikwoty roztworu FMN (100 µl) i potraktowano światłem o długości fali 450 nm (5 J/cm2). Media zawierające FMN usunięto natychmiast po zabiegu i komórki inkubowano w świeżych pożywkach RPMI-1640 przez 48 godzin. test MTT przeprowadzono w sposób opisany powyżej.
test apoptozy i martwicy
komórki wysiewano w 96-studzienkowej płytce (5 × 103 komórki na studzienkę), a następnie przez noc inkubowano. Następnie do komórek dodano 100 µL odpowiednich roztworów roboczych FMN (10 µM, 30 µM i 100 µM) w pożywce RPMI-1640 i płytkę inkubowano w ciemności w inkubatorze CO2 przez 30 minut. Następnie komórki napromieniowano laserem 450 nm w dawce 5 J / cm2. Następnie komórki konsekwentnie przemyto zimnym PBS i buforem wiążącym i zabarwiono Aneksyną V-FITC, jodkiem propidium (PI) i Hoechst 33258 w temperaturze pokojowej w buforze wiążącym przez 15 minut. Obrazy optyczne i dane o intensywności fluorescencji uzyskano za pomocą InCell Analyzer 6000 oraz w oprogramowaniu Cell Analyzer Workstation V. 3. 7 .3 (GE Healthcare, USA).
produkcja elektrod
nanoelektrody węglowe wytrawiano w roztworze 0,1 M NaOH, 10 mM KCl podczas 30-40 cykli przez 10 sekund, aby utworzyć wnękę na powierzchni węgla. Zastosowany potencjał był w kształcie litery V z amplitudą 1,5-2 V. osadzanie platyny przeprowadzono przez zamiatanie potencjału od 0 do -1500 mV w stosunku do Ag / AgCl w roztworze zawierającym 2 mM kwas chloroplatynowy (H2ptcl6, Sigma). Cykliczne voltammogramy w 1 mM ferrocen metanolu (FcMeOH, Sigma) uzyskano dla elektrody węglowej początkowej, dla elektrody z nanocząsteczkami i z platyną do sterowania procesem produkcji. Osadzanie Pt tylko nieznacznie zwiększyło efektywną powierzchnię geometryczną nanoelektrody (o czym świadczy woltammogram dla utleniania 1 mM FcMeOH), ale znacznie zwiększyło jej aktywność katalityczną w kierunku redukcji ROS. Nanoelektrodę spolaryzowano przy 600 mV w stosunku do Ag / AgCl (dla wykrywania H2O2 ograniczonego dyfuzją) i ręcznie zbliżył się do cieczy lub powierzchni pojedynczej komórki nowotworowej. Do kalibracji wykorzystaliśmy roztwory o różnym stężeniu H2O2 (Sigma) w zakresie 10-7-10-4 M.
pomiar ROS za pomocą sondy elektrochemicznej
wyniki uzyskano zgodnie z opisem wcześniej47 z pewnymi zmianami. Wprowadzoną modyfikacją elektrod stosowanych w tej pracy jest więc lepsza przyczepność platyny do elektrody węglowej dzięki wytrawianiu wnęki w warstwie węglowej przed osadzaniem Pt. Do produkcji czujników do wykrywania ROS wykorzystano dostępne na rynku tarczowe nanoelektrody węglowe izolowane w kwarcu (ICAPPIC Limited, UK) o średnicy 100-500 nm. Stosunkowo obojętna powierzchnia węglowa elektrody została dodatkowo funkcjonalizowana w celu wykrycia gatunków aktywnych redoks. Elektrodeposytowana warstwa platyny zwiększa aktywność elektrokatalityczną, drastycznie redukując nadpotencjał wytwarzany przez redukcję reaktywnych form tlenu. Aby zwiększyć przyczepność platyny do korka węglowego, wytrawiliśmy nanocavity w elektrodzie węglowej. Zastosowaliśmy metodę elektrochemiczną do tworzenia drobnych nacięć w końcówkach nanoelektrod węglowych51. Wytwarzanie nanoczujników platyny odbywało się w dwóch etapach: trawienie w roztworze alkalicznym oraz platynowanie. Wszystkie etapy były precyzyjnie kontrolowane za pomocą pomiarów elektrochemicznych. Uważamy, że nanoelektroda jest wrażliwa zarówno na krótkotrwałe, jak i długowieczne formy ROS. Niedawno wykazaliśmy, że wytwarzanie tlenu singletowego w wodnym roztworze mononukleotydu flawiny (FMN) jest indukowane przez napromieniowanie światłem niebieskim. Na podstawie tego wyniku wykazujemy (dane uzupełniające 9) reakcję nanoelektrody węglowej spolaryzowanej przy +800 mV w stosunku do Ag / AgCl na produkcji ROS w roztworze wodnym FMN pod napromieniowaniem światłem niebieskim.
komórki wysiewano w szalce Petriego, a następnie przez noc inkubowano. Następnie komórki inkubowano przez 30 minut z 100 µM FMN w ciemności i przemyto 3 razy PBS. Następnie nanoelektrodę platynową wprowadzono ostrożnie za pomocą precyzyjnego mikromanipulatora do pojedynczej komórki pod kontrolą optyczną za pomocą mikroskopu odwróconego. Do manipulacji i regulacji elektrod użyliśmy mikromanipulatora PatchStar (Scientifica, UK). Zebraliśmy cykliczne dane woltamometryczne ze wzmacniaczem patch-clamp Model 2400 (A-M Systems, USA). Rejestracja sygnału została przeprowadzona za pomocą wielofunkcyjnego urządzenia We / Wy USB-6211 (National instruments, USA) oraz programu komputerowego WinWCP. Wszystkie pomiary wykonano na stole mikroskopu odwróconego Nikon (Japonia). We wszystkich pomiarach zastosowano elektrodę AG/AgCl jako elektrodę wzorcową.
pomiar ROS za pomocą sondy fluorescencyjnej
ocena cytoplazmatycznej ROS została przeprowadzona za pomocą sondy CellROX Deep Red fluorescent probe (Molecular Probe/Thermo). Krótko mówiąc, komórki Mel IL I m-3 czerniaka (5 × 103) wysiewano w 96-studzienkowych płytkach (Nunc, Dania) i inkubowano z 2,5 µM CellROX Deep Red w pełnych mediach RPMI-1640 przez 30 minut i trzykrotnie przemywano w PBS. Następnie do komórek dodano 100 µL odpowiednich roztworów roboczych (10 µM, 30 µM i 100 µM) FMN w pożywce rpmi-1640 bez Czerwieni fenolowej i płytkę inkubowano w ciemności w inkubatorze CO2 przez 30 minut. Następnie komórki napromieniowano laserem 450 nm w dawce 5 J / cm2. Jądra komórkowe dodatkowo barwiono 50 µM roztworem barwnika Hoechst 33258 przez 15 minut. Obrazy optyczne i dane o intensywności fluorescencji komórek czerniaka Mel IL i a375 pozyskano za pomocą InCell Analyzer 6000 oraz w oprogramowaniu Cell Analyzer Workstation V.3.7.3 (GE Healthcare, USA).
oznaczanie zawartości melaniny
stosujemy rutynowy test do spektrofotometrii oznaczanie melaniny z niewielkimi zmianami52. Cztery linie komórkowe czerniaka: Mel MTP, Mel IL, Mel Z, A375 i dwie normalne (ludzkie keratynocyty HaCaT i ludzkie fibroblasty skóry BJ-5ta) linie komórkowe policzono i granulowano w celu uzyskania końcowego stężenia 2 × 106 komórek/ml. W celu oznaczenia zawartości melaniny wewnątrzkomórkowej, granulki komórkowe rozpuszczono w 1 M NaOH zawierającym 10% (v/v) DMSO i inkubowano w temperaturze 80 °C przez 1 godzinę. Po inkubacji lizaty odwirowywano (3000 g przez 5 minut) i mierzono absorbancję w środowisku wolnym od komórek przy 405 nm. Wszystkie wyniki są wyrażone jako średnia wartość intensywności absorbancji znormalizowanej do zawartości melaniny w fibroblastach ± odchylenie standardowe (SD) w trzech niezależnych eksperymentach. Analiza statystyczna została przeprowadzona przy użyciu programu GraphPad Prism w wersji 5.0 (GraphPad Software, La Jolla California USA).
eksperymenty na zwierzętach
terapia guzów pierwotnych
samce myszy Balb/c nu / NU w wieku 6-7 tygodni zostały zakupione z hodowli zwierząt Instytutu Chemii Bioorganicznej im. Szemjakina–Owczinnikowa Rosyjskiej Akademii Nauk i umieszczone w kontrolowanych warunkach środowiskowych w wentylowanej szafce dla zwierząt a-Box 80 (Noroit, Francja) W 12-godzinnym cyklu ciemnego światła i umożliwiły swobodny dostęp do sterylnej wody i SPF-mouse chow. Wszystkie doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z europejskimi i rosyjskimi krajowymi wytycznymi dotyczącymi eksperymentów na zwierzętach i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. oceny zwierząt i etyki FSBSI „N. N. Blokhin Nmrco”, numer referencyjny 2017-034.
w celu ustalenia modelu myszy ksenogenicznej, komórki Mel IL i a375 zebrano roztworem Versenu, granulowano przez odwirowanie w 300 g przez 5 minut i zawieszono w pożywce rpmi-1640 bez surowicy. Zawiesina komórek czerniaka była mieszana (1:1 objętość) z Matrigel (BD Biosciences), a otrzymaną zawiesinę komórek (2 × 106 komórek na wstrzyknięcie) wszczepiono podskórnie w prawą stronę myszy, aby zapewnić pomyślne rozpoczęcie guza i pomiary wzrostu guza.
podawanie FMN rozpoczęło się 10 dnia po zaszczepieniu, gdy wielkość guza osiągnęła 100-120 mm3. Roztwór FMN (150 µl, 10 µg/ml) wstrzyknięto myszom dożylnie przez Zatokę retro-orbitalną, a guzy napromieniowano światłem niebieskim przy 450 nm przez 15 minut do końcowej dawki 20 J/cm2.
objętość guza oszacowano standardową metodą kalipacji i obliczono według następującego wzoru, przy założeniu kształtu Hemi-elipsoidy:
aktywność przeciwnowotworową fotoaktywowanej FMN oznaczano oceniając szybkość hamowania wzrostu guza (TGI%) obliczoną jako:
guzy odległe
użyliśmy myszy C57BL / 6 w wieku 6-7 tygodni, zakupionych z hodowli zwierząt Instytutu Chemii Bioorganicznej im. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z europejskimi i rosyjskimi krajowymi wytycznymi dotyczącymi eksperymentów na zwierzętach i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Blokhin NMRCO”, numer referencyjny 2017-034.
komórki czerniaka myszy B16-F10 pobrano roztworem Versene, granulowano przez odwirowanie w 300 g przez 5 minut i zawieszono w pożywce RPMI-1640 bez surowicy. Zawiesinę komórek czerniaka zmieszano (objętość 1: 1) z Matrigel (BD Biosciences), a otrzymaną zawiesinę komórek (5 × 105 komórek na wstrzyknięcie) wszczepiono podskórnie w prawą i lewą stronę myszy, aby zapewnić pomyślne rozpoczęcie guza i pomiary wzrostu guza.
podawanie FMN rozpoczęło się 4 dnia po zaszczepieniu, gdy wielkość guza osiągnęła 60 ± 16 mm3 roztwór FMN (150 µl, 10 mg/ml) wstrzyknięto myszom dożylnie przez Zatokę retro-orbitalną, a guzy napromieniowano światłem niebieskim przy 450 nm przez 15 minut do końcowej dawki 20 J/cm2. Zastosowano dwie grupy kontrolne: wstrzyknięcie FMN bez napromieniowania światłem; napromieniowanie laserowe bez wtrysku FMN. Oceniono objętość guza i aktywność przeciwnowotworową fotoaktywowanej FMN w sposób opisany powyżej.
hematoksylina i barwienie eozyną
Zwierzęta uśmiercano przez zwichnięcie szyjki macicy w ciągu 24 godzin po PDT. Wszystkie zebrane guzy utrwalano 4% paraformaldehydem przez 24 godziny, a następnie osadzano parafiną. Fragmenty tkanek (o grubości 4 µm) zabarwiono hematoksyliną i eozyną.
Analiza statystyczna
wszystkie eksperymenty przeprowadzono w trzech egzemplarzach, chyba że zaznaczono inaczej, a każdy eksperyment powtórzono trzy razy niezależnie. Dane są wyrażone jako średnia ± SD. Różnice uznano za istotne statystycznie, gdy wartości P były mniejsze niż 0, 05. Wszystkie analizy statystyczne przeprowadzono za pomocą oprogramowania GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, San Diego, CA, USA).