Materialen
Cel cultuur
de Menselijke melanoom Mel Z, Mel IL, en Mel MTP-cellen werden verkregen van de tumor materiaal van patiënten die een behandeling op de N. N. Blokhin National Medical Research Center van oncology50. BJ – 5ta fibroblasten en borstkanker SK-BR – 3 cellen waren van ATCC. De andere cellen werden vriendelijk verstrekt door Drs. E. Svirchevskaya en E. Kovalenko (Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry RAS, Moskou, Rusland). Alle cellen werden gekweekt in RPMI-1640 groeimedium aangevuld met 10% FBS, 2 μМ L-glutamine, 100 µg/mL streptomycine en 100 U / mL penicilline bij 37 °C in een 5% CO2 bevochtigde atmosfeer. Het medium werd om de 3-4 dagen vervangen. Het melaninegehalte werd geschat door het absorptiespectrum in DMSO-cellysaten (106 cellen per ml) te meten met behulp van een Cary 50 UV-Vis spectrofotometer.
Flow cytometry
cellen werden geoogst met Versene-oplossing, gepelleteerd door centrifugeren bij 300 g gedurende 5 minuten, en geresuspendeerd in rpmi-1640 media zonder serum tot de uiteindelijke concentratie van 106 cellen per ml. Dan, werden 100 µl van de celsuspensie overgebracht naar de licht-beschermde buizen voor cytometry stroom. Passende werkoplossingen van FMN in rpmi-1640 medium werden onmiddellijk voorafgaand aan de experimenten voorbereid. Deze FMN-oplossingen werden toegevoegd aan de buizen en de uiteindelijke FMN-concentratie was 10 µM, 30 µM en 100 µM. Daarna werden de cellen gedurende 30 minuten in het donker geïncubeerd in een CO2-incubator. Aan het einde van de incubatie werd 1 ml koude PBS toegevoegd aan elke buis en werden de cellen gedurende 5 minuten gecentrifugeerd (300 g, 4 °C). De bovenstaande vloeistof werd verwijderd en de cellen werden geresuspendeerd in 300 µl koude PBS en overgebracht naar ijs. De fluorescentie werd onderzocht met behulp van een flowcytometer Novocyt 2000R (Acea Biosciences) en NovoExpress v. 1.2.4-software. De fluorescentie werd gemeten op een kanaal dat aan FITC-fluorescentie beantwoordt, en minstens 10.000 gebeurtenissen werden onderzocht voor elke steekproef. Om het accumulatieniveau van FMN in de cellen te schatten, werden de mediane fluorescentiewaarden in elk monster bepaald en vervolgens werd het relatieve fluorescentieniveau (F) berekend volgens de volgende formule:
confocale microscopie
cellen werden gezaaid in 96-wells platen (5 × 103 cellen per putje), gevolgd door incubatie gedurende de nacht. Vervolgens werden 100 µL geschikte werkoplossingen van FMN (10 µM, 30 µM, en 100 µM) in rpmi-1640-medium toegevoegd aan cellen en werd de plaat in het donker in een CO2-incubator gedurende 30 minuten geïncubeerd. Daarna werden de cellen 3 maal gewassen met koude PBS en bovendien 15 minuten lang gekleurd met Hoechst 33258 kleurstof (50 µM). Optische beelden en fluorescentie intensiteitsgegevens werden verkregen met behulp van InCell Analyzer 6000 en in Cell Analyzer Workstation software v.3.7.3 (GE Healthcare, USA).
Cytotoxiciteitsstudies
cellen werden gezaaid in een 96-wells plaat (5 × 103 cellen per putje), gevolgd door een nachtelijke incubatie. Passende werkoplossingen van FMN in volledig rpmi-1640 medium werden onmiddellijk voorafgaand aan de experimenten voorbereid. Vervolgens werd het medium uit de 96-wells plaat verwijderd en werden in elk putje FMN-oplossingsaliquots (100 µl) toegevoegd. Om FMN-fotoactivering te induceren, werden de platen behandeld met licht bij 450 nm, bestralingsdosis 0,2 J / cm2-7 J / cm2. Cellen zonder enige behandeling werden gebruikt als controlegroep (100%). De levensvatbaarheid van de cellen werd bepaald door middel van een MTT-test na 48 uur incubatie. Hiervoor werden cellen behandeld met MTT-oplossing (0,5 mg / ml in RPMI-1640) gedurende 3 uur. vervolgens werd het medium vervangen door 100 µl DMSO om gevormde formazan-kristallen op te lossen. De optische dichtheid (od) bij 570 nm werd gemeten met Varioskan Flash reader (Thermo Scientific, USA). De levensvatbaarheid van cellen (V) na FMN-behandeling werd uitgedrukt in % in vergelijking met de controle volgens de volgende vergelijking:
om ROS-gemedieerde fototoxiciteit te bepalen, werden FMN-oplossingsaliquots (100 µl) toegevoegd in elk putje en behandeld met licht bij 450 nm (5 J/cm2). FMN-bevattende media werd onmiddellijk na de behandeling verwijderd en cellen werden geïncubeerd in verse rpmi-1640 media gedurende 48 uur. MTT assay werd uitgevoerd zoals hierboven beschreven.
apoptose en necrose assay
cellen werden gezaaid in 96-wells platen (5 × 103 cellen per putje), gevolgd door een nachtelijke incubatie. Vervolgens werden 100 µL geschikte werkoplossingen van FMN (10 µM, 30 µM, en 100 µM) in rpmi-1640-medium toegevoegd aan cellen en werd de plaat in het donker in een CO2-incubator gedurende 30 minuten geïncubeerd. Daarna werden de cellen met een laser van 450 nm met een dosis van 5 J/cm2 bestraald. Vervolgens werden de cellen consequent gewassen met koude PBS en bindende buffer en gekleurd met Annexin V-FITC, propidium jodide (PI), en Hoechst 33258 bij kamertemperatuur in bindende buffer gedurende 15 min. Optische beelden en fluorescentie intensiteitsgegevens werden verkregen met behulp van InCell Analyzer 6000 en in Cell Analyzer Workstation software v.3.7.3 (GE Healthcare, USA).
Elektrodeproductie
De koolstofnano-elektroden werden geëtst in een 0,1 M NaOH, 10 mM KCL-oplossing gedurende 30-40 cycli gedurende 10 seconden elk om een holte in het koolstofoppervlak te creëren. Het toegepaste potentiaal was V-vormig met een amplitude van 1,5–2 V. platina-depositie werd uitgevoerd door het potentiaal af te vegen van 0 tot -1500 mV vs Ag/AgCl in een oplossing die 2 mM chloroplatininezuur (H2ptcl6, Sigma) bevat. De cyclische voltammogrammen in 1 mM ferroceenmethanol (Fcmeoh, Sigma) werden verkregen voor de initiële koolstofelektrode, voor de elektrode met nanocaviteiten en met platina om het productieproces te controleren. De depositie van Pt slechts licht verhoogde de effectieve geometrische oppervlakte van de nano-elektrode (zoals blijkt uit het voltammogram voor de oxidatie van 1 mM FcMeOH), maar dramatisch verhoogde zijn katalytische activiteit in de richting van Ros reductie. De nano-elektrode werd gepolariseerd bij 600 mV vs Ag/AgCl (voor de diffusie-beperkte detectie van H2O2) en handmatig benaderd naar de vloeistof of het oppervlak van de enige kankercel. Voor de kalibratie gebruikten we oplossingen met verschillende concentratie van H2O2 (Sigma) in het bereik van 10-7-10-4 M.
ROS meting met elektrochemische sonde
de resultaten werden verkregen zoals het eerder werd beschreven 47 met enkele wijzigingen. Zo is de geïntroduceerde wijziging van elektroden die in dit werk worden gebruikt, de betere hechting van platina aan koolstofelektrode als gevolg van het etsen van een holte in koolstoflaag vóór Pt-afzetting. In de handel verkrijgbare schijf, gevormde koolstof nano-elektroden geïsoleerd in quartz (ICAPPIC Limited, UK) met een diameter van 100-500 nm, werden gebruikt voor de productie van sensoren voor ROS detectie. Het relatief inerte koolstofoppervlak van de elektrode werd verder gefunctionaliseerd voor de detectie van redox-actieve soorten. Een elektrodeposited platina laag verbetert de elektrokatalytische activiteit door drastisch verminderen van de overpotentiaal geproduceerd door de vermindering van reactieve zuurstof species. Om de hechting van het platina aan de koolstofplug te verbeteren, hebben we een nanocavity geëtst in de koolstofelektrode. We hebben een elektrochemische methode gebruikt om kleine inkepingen te maken in de toppen van koolstofnano-elektrodes51. De vervaardiging van platina nanosensors werd uitgevoerd in twee stadia: het etsen in alkalische oplossing en platinisatie. Alle fasen werden nauwkeurig geregeld door elektrochemische metingen. Wij geloven dat de nano-elektrode gevoelig is voor zowel kortlevende als langlevende Ros-vormen. Onlangs hebben we aangetoond dat de singlet zuurstofproductie in waterige oplossing van flavine mononucleotide (FMN) wordt veroorzaakt door blauw licht bestraling. Op basis van dit resultaat tonen we (aanvullende gegevens 9) de reactie van koolstof nano-elektrode gepolariseerd bij +800 mV vs Ag/AgCl op ROS productie in waterige oplossing van FMN Onder blauw licht bestraling.
cellen werden ingezaaid in een petrischaal, gevolgd door een nachtelijke incubatie. Vervolgens werden de cellen gedurende 30 min met 100 µM FMN in duisternis uitgebroed en 3 keer met PBS gewassen. Dan, werd platinized Nano-elektrode zorgvuldig geà ntroduceerd door de nauwkeurige micromanipulator in de enige cel onder optische controle met omgekeerde microscoop te gebruiken. Voor elektrode manipulatie en afstelling gebruikten we micromanipulator PatchStar (Scientifica, UK). We verzamelden cyclische voltammetrische gegevens met patch-clamp versterker model 2400 (A-M Systems, USA). De opname van het signaal werd uitgevoerd met multifunctioneel I / O apparaat USB-6211 (National instruments, USA) en computerprogramma WinWCP. Alle metingen werden uitgevoerd op de tafel van de omgekeerde microscoop Nikon (Japan). Bij alle metingen werd Ag / AgCl-elektrode gebruikt als referentie-elektrode.
ROS-meting met fluorescentiesonde
evaluatie van het cytoplasmatische ROS werd uitgevoerd met CellROX dieprode fluorescentiesonde (moleculaire Probes / Thermo). Kort, Mel IL en M-3 melanoomcellen (5 × 103) werden gezaaid in 96-wells platen (nunc, Denemarken) en geïncubeerd met 2,5 µM van CellROX diep rood in volledige rpmi-1640 media gedurende 30 minuten en gewassen in PBS drie keer. Vervolgens werden 100 µL geschikte werkoplossingen (10 µM, 30 µM en 100 µM) FMN in rpmi-1640 medium zonder Fenolrood toegevoegd aan cellen en werd de plaat in het donker in een CO2-incubator gedurende 30 minuten geïncubeerd. Daarna werden de cellen met een laser van 450 nm met een dosis van 5 J/cm2 bestraald. Celkernen werden bovendien gekleurd met 50 µM van Hoechst 33258 kleurstofoplossing gedurende 15 minuten. Optische beelden en CellROX dieprode fluorescentie intensiteitsgegevens van Mel IL en a375 melanoomcellen werden verkregen met behulp van InCell Analyzer 6000 en in Cell Analyzer Workstation software v.3.7.3 (GE Healthcare, USA).
bepaling van het melaninegehalte
we gebruiken routinematige bepaling voor spectrofotometrie bepaling van melanine met kleine wijzigingen52. Vier cellijnen van het melanoom: Mel MTP, Mel IL, Mel Z, A375 en twee normale cellijnen (menselijke keratinocyten HaCaT en menselijke huidfibroblasten BJ-5ta) werden geteld en gepelleteerd om een uiteindelijke concentratie van 2 × 106 cellen/ml te hebben. Voor de bepaling van het intracellulaire melaninegehalte werden celkorrels opgelost in 1 M NaOH met 10% (v/v) DMSO en gedurende 1 uur geïncubeerd bij 80 °C. Na incubatie werden de lysaten gecentrifugeerd (3000 g gedurende 5 min) en werd de absorptie gemeten in celvrije media bij 405 nm. Alle resultaten worden uitgedrukt als Gemiddelde waarde van de absorptieintensiteit die is genormaliseerd aan het melaninegehalte in fibroblasten ± standaarddeviatie (SD) van drie onafhankelijke experimenten. Statistische analyse werd uitgevoerd met GraphPad Prism versie 5.0 (GraphPad Software, La Jolla California USA).
dierproeven
therapie van primaire tumoren
mannelijke Balb/c nu / nu muizen van 6-7 weken werden gekocht bij animal farm van het Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, en gehuisvest onder gecontroleerde omgevingsomstandigheden in geventileerd dierenkast A-Box 80 (Noroit, Frankrijk) bij een 12 uur donker-licht cyclus en kregen vrij toegang tot steriel water en SPF-muis chow. Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de Europese en Russische nationale richtlijnen voor dierproeven en werden goedgekeurd door de animal and ethics review committee van de FSBSI “N. N. Blokhin NMRCO”, referentienummer 2017-034.
om een xenotransplantaatmuismodel vast te stellen, werden Mel IL-en A375-cellen geoogst met Versene-oplossing, gepelleteerd door centrifugering bij 300 g gedurende 5 minuten en geresuspendeerd in rpmi-1640 media zonder serum. Melanoomcelsuspensie werd gemengd (1:1 volume) met Matrigel (Biowetenschappen van BD), en de verkregen celsuspensie (2 × 106 cellen per injectie) werd subcutaan in de rechterflank van de muizen geïmplanteerd om succesvolle tumorinitiatie en tumorgroeimetingen te verzekeren.
toediening van FMN begon op dag 10 na inoculatie toen de tumorgrootte 100-120 mm3 bereikte. FMN-oplossing (150 µl, 10 µg / ml) werd intraveneus geïnjecteerd in de muizen via een retro-orbitale sinus, en de tumoren werden doorstraald met blauw licht bij 450 nm gedurende 15 minuten tot de uiteindelijke dosis van 20 J/cm2.
tumorvolume werd geschat met behulp van de standaard kalipatiemethode en werd berekend met de volgende formule, uitgaande van een Hemi-ellipsoïde vorm:
antitumoractiviteit van fotoactivated FMN werd bepaald door de tumorgroeiremming (TGI%) te evalueren, berekend als:
fotodynamische therapie van verre tumoren
We gebruikten c57bl/6 muizen op de leeftijd van 6-7 weken, gekocht bij Animal Farm van Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences. Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de Europese en Russische nationale richtlijnen voor dierproeven en werden goedgekeurd door de animal and ethics review committee van de FSBI ” N. N. Blokhin NMRCO”, referentienummer 2017-034.
B16-F10 muizenmelanoomcellen werden geoogst met Versene-oplossing, gepelleteerd door centrifugeren bij 300 g gedurende 5 minuten en geresuspendeerd in rpmi-1640 media zonder serum. Melanoomcelsuspensie werd gemengd (1: 1 volume) met Matrigel (Bd Biosciences), en de verkregen celsuspensie (5 × 105 cellen per injectie) werd subcutaan in de rechter-en linkerflank van de muizen geïmplanteerd om succesvolle tumorinitiatie en tumorgroeimetingen te garanderen.
toediening van FMN begon op dag 4 na inoculatie toen de tumorgrootte 60 ± 16 mm3 FMN-oplossing (150 µl, 10 mg/ml) bereikte en intraveneus via een retro-orbitale sinus in de muizen werd geïnjecteerd, en de tumoren gedurende 15 minuten met blauw licht bij 450 nm werden bestraald tot de uiteindelijke dosis van 20 J/cm2. Er werden twee controlegroepen gebruikt: FMN-injectie zonder lichtbestraling; laserbestraling zonder FMN-injectie. Tumorvolume en antitumoractiviteit van fotoactivated FMN werd geschat zoals het hierboven werd beschreven.
hematoxyline en eosine kleuring
dieren werden gedood door cervicale dislocatie in 24 uur na PDT. Alle geoogste tumoren werden bevestigd met 4% paraformaldehyde gedurende 24 uur en vervolgens ingebed met paraffine. Weefselsecties (4 µm dik) werden gekleurd met hematoxyline en eosine.
statistische analyse
alle experimenten werden uitgevoerd in drievoud, tenzij anders aangegeven, en elk experiment werd driemaal onafhankelijk herhaald. De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. Verschillen werden statistisch significant geacht wanneer P-waarden lager waren dan 0,05. Alle statistische analyses werden uitgevoerd met GraphPad Prism software (GraphPad Software, La Jolla, San Diego, CA, USA).