Anyagok
sejtkultúra
Humán melanoma Mel Z, Mel IL, Mel MTP sejtek szerzett a tumor anyag kezelés alatt álló betegeknél a N. N. Blokhin Nemzeti Orvosi Kutatások Központja oncology50. A BJ-5ta fibroblasztok és mellrák SK-BR-3 sejtek ATCC-ből származtak. A többi sejtet Dr. E. Svirchevskaya és E. Kovalenko (Shemyakin-Ovchinnikov bioorganikus Kémiai Intézet RAS, Moszkva, Oroszország). Minden sejtet RPMI-1640 növekedési közegben termesztettek, 10% FBS, 2 μМ L-glutamin, 100 µg/mL sztreptomicin és 100 U/mL penicillin hozzáadásával, 37 °C-on, 5% CO2 nedvesített légkörben. A táptalajt 3-4 naponta cserélték. A melanintartalmat úgy becsülték meg, hogy a DMSO sejtlizátumokban (106 sejt / ml) abszorpciós spektrumot egy Cary 50 UV-Vis spektrofotométerrel mérték.
citometria
Sejtek betakarították a Versene megoldás, pelletált centrifugálással 300 g, 5 perc újraszuszpendált a RPMI-1640 média nélkül szérum, hogy a végső koncentrációja 106 sejt / ml. Ezután a sejtszuszpenzió 100 µl-ét átvisszük a fényvédett csövekbe az áramlási citometriához. Az FMN megfelelő munkamegoldásait RPMI – 1640 közegben közvetlenül a kísérletek előtt készítettük el. Ezeket az FMN-oldatokat adták a csövekhez, a végső FMN-koncentráció pedig 10 µM, 30 µM és 100 µM volt. Ezután a sejteket sötétben inkubáltuk CO2 inkubátorban 30 percig. Az inkubáció végén minden csőhöz 1 ml hideg PBS-t adtunk, a sejteket 5 percig centrifugáltuk (300 g, 4 °c). A felülúszót eltávolították, és a sejteket 300 µl hideg PBS-ben reszuszpendálták, majd jégre helyezték. A fluoreszcenciát a novocyte 2000r (ACEA Biosciences) és a NovoExpress V. 1.2.4 szoftver segítségével vizsgálták. A fluoreszcenciát a FITC fluoreszcenciának megfelelő csatornán mértük, és minden egyes minta esetében legalább 10 000 eseményt vizsgáltunk. Megbecsülni a felhalmozási szintje FMN a sejtek, az átlagos fluoreszcencia értékek minden egyes minta határozták meg, majd a relatív fluoreszcencia szint (F) kiszámítása a következő képlet alapján:
Confocal mikroszkópia
Sejtek szétszórták a 96-hát lemezek (5 × 103 sejt / hát), majd egyik napról a másikra inkubációs. Ezután 100 µL megfelelő FMN (10 µM, 30 µM és 100 µM) munkaoldatot adtak RPMI-1640 közegben a sejtekhez, majd a lemezt sötétben egy CO2 inkubátorban 30 percig inkubáltuk. Ezután a sejteket 3-szor hideg PBS-vel mossuk, majd 15 percig Hoechst 33258 festékkel (50 µM) festjük. Az optikai képeket és a fluoreszcencia intenzitási adatokat az InCell Analyzer 6000 és a Cell Analyzer Workstation software v. 3.7.3 (GE Healthcare, USA) segítségével szerezték be.
Citotoxicitási vizsgálatok
a sejteket egy 96-kútba (5 × 103 sejt / kút) vetették be, majd egy éjszakán át inkubálták. Az FMN megfelelő munkamegoldásait teljes rpmi – 1640 közegben közvetlenül a kísérletek előtt készítettük el. Ezután a tápközeget kivettük a 96-os lemezből, és mindegyik kútba FMN-oldatot (100 µl) adtunk. Az FMN fotoaktiváció indukálásához a lemezeket 450 nm–es fénnyel, 0,2 J/cm2-7 J/cm2 besugárzási dózissal kezelték. A kezelés nélküli sejteket kontrollként alkalmazták (100%). A sejtek életképességét 48 órás inkubáció után MTT-vizsgálattal határozták meg. Ebből a célból a sejteket MTT-oldattal (0,5 mg/ml RPMI-1640-ben) kezelték 3 órán keresztül. Ezután a közeget 100 µl DMSO-val helyettesítettük a képződött formazánkristályok feloldása érdekében. Az optikai sűrűséget (OD) 570 nm-en Varioskan Flash reader (Thermo Scientific, USA) segítségével mértük. A sejtek életképességét (V) az FMN-kezelés után % – ban fejeztük ki a kontrollhoz képest a következő egyenlet szerint:
az FMN fotoprodukciók citotoxicitásának meghatározására az FMN megfelelő munkamegoldásait teljes rpmi-1640 közegben besugározták 450 nm-en (5 J / cm2), majd egy éjszakán át inkubálták. Ezután ezeket az FMN aliquotokat (100 µl) adták a sejtekhez, majd 48 órán keresztül inkubálták.
A ROS-mediált fototoxicitás meghatározására FMN-oldat aliquotokat (100 µl) adtak minden kútba, és 450 nm (5 J/cm2) fénnyel kezelték. Az FMN-tartalmú táptalajt a kezelés után azonnal eltávolították, és a sejteket friss rpmi-1640 közegben 48 órán keresztül inkubálták.
apoptózis és nekrózis vizsgálat
a sejteket egy 96-kútlemezbe (5 × 103 sejt / kút) vetettük be, majd egy éjszakán át inkubáltuk. Ezután 100 µL megfelelő FMN (10 µM, 30 µM és 100 µM) munkaoldatot adtak RPMI-1640 közegben a sejtekhez, majd a lemezt sötétben egy CO2 inkubátorban 30 percig inkubáltuk. Ezt követően a sejteket 450 nm-es lézerrel besugároztuk 5 J/cm2 dózisban. Ezután a sejteket következetesen hideg PBS-vel és kötő pufferrel mostuk, majd 15 percig kötő pufferben szobahőmérsékleten Anexin V-FITC-vel, propidium-jodiddal (PI) és Hoechst 33258-mal festettük. Az optikai képeket és a fluoreszcencia intenzitási adatokat az InCell Analyzer 6000 és a Cell Analyzer Workstation software v. 3.7.3 (GE Healthcare, USA) segítségével szerezték be.
Elektródagyártás
a szén nanoelektródákat 0,1 M NaOH, 10 mM KCl oldatban Martuk 30-40 ciklus alatt 10 másodpercig, hogy üreg keletkezzen a szénfelszínben. Az alkalmazott potenciális volt, V-alakú, amplitúdó, 1,5–2 V. Platinum lerakódás végzett söpör végig a potenciális 0-tól -1500 mV vs Ag/AgCl tartalmazó oldatban 2 mM chloroplatinic sav (H2PtCl6, Sigma). Az 1 mM-es ferrocén metanolban (FcMeOH, Sigma) lévő ciklikus voltammogramokat a kezdeti szénelektródához, a nanokavitációjú elektródhoz és a platinához kaptuk a gyártási folyamat vezérléséhez. A Pt lerakódása csak kissé növelte a nanoelektród hatékony geometriai felületét (amint azt az 1 mM-es FcMeOH oxidációs voltammogram is bizonyítja), de drámai módon növelte katalitikus aktivitását a ROS redukció felé. A nanoelektródot 600 mV-os, Ag/AgCl-rel polarizálták (a H2O2 diffúzió-korlátozott kimutatására), majd manuálisan közelítették meg az egyetlen rákos sejt folyadékához vagy felületéhez. A kalibráláshoz különböző koncentrációjú H2O2 (Sigma) oldatokat használtunk 10-7-10-4 M tartományban.
ROS mérés elektrokémiai szondával
az eredményeket úgy kaptuk meg, ahogy korábban leírtuk47 néhány változtatással. Így az ebben a munkában használt elektródák bevezetett módosítása a platina jobb tapadása a szénelektródához, mivel a szénréteg üregét a Pt lerakódás előtt maratják. Kereskedelmi forgalomban kapható lemez, alakú szén nanoelektródák izolált kvarc (ICAPPIC Limited, UK) átmérője 100-500 nm, használták a termelés érzékelők ROS kimutatására. Az elektróda viszonylag inert szénfelülete tovább funkcionalizálódott a redox-aktív fajok kimutatására. Az elektrodepozitált platina réteg fokozza az elektrokatalitikus aktivitást azáltal, hogy drasztikusan csökkenti a reaktív oxigénfajok csökkentésével előállított túlpotenciált. Annak érdekében, hogy fokozzuk a platina tapadását a széndugóhoz, nanokavitációt gravíroztunk a szénelektródába. Elektrokémiai módszert alkalmaztunk apró bevágások létrehozására a szén nanoelektródák hegyében51. A platina nanoszenzorok gyártása két lépcsőben történt: rézkarc lúgos oldatban és platinizációban. Minden fázist pontosan elektrokémiai mérésekkel vezéreltek. Hisszük, hogy a nanoelektród érzékeny mind a rövid életű, mind a hosszú élettartamú ROS formákra. Nemrégiben bebizonyítottuk, hogy a flavin-mononukleotid (FMN) vizes oldatában a szingulett oxigéntermelést kék fény Besugárzás indukálja. Ezen eredmény alapján demonstráljuk (kiegészítő adatok 9) a +800 mV vs Ag/AgCl polarizált szén nanoelektród reakcióját az FMN vizes oldatában történő ROS-termelésre kék fény besugárzás alatt.
a sejteket Petri-csészébe vetettük, majd egy éjszakán át inkubáltuk. Ezután a sejteket 30 percig inkubáltuk 100 µM FMN sötétségben, majd 3-szor mossuk PBS-vel. Ezután a platinizált nanoelektródot óvatosan vezették be a pontos mikromanipulátor használatával az egyetlen cellába optikai vezérlés alatt fordított mikroszkóppal. Az elektródák manipulálásához és beállításához mikromanipulátor PatchStar-t (Scientifica, UK) használtunk. Ciklikus voltammetriás adatokat gyűjtöttünk a 2400-as patch-clamp erősítő modellel (A-M Systems, USA). A jel rögzítése többfunkciós I/O USB-6211 (National instruments, USA) és winwcp számítógépes programmal történt. Minden mérést a Nikon (Japán) fordított mikroszkóp asztalán végeztünk. Minden mérésnél Ag / AgCl elektródát használtunk referenciaelektródaként.
ros mérés fluoreszkáló szondával
a citoplazmatikus ROS értékelését CellROX mélyvörös fluoreszkáló szondával (molekuláris szondák/Thermo) végezték. Röviden, A Mel IL és az M-3 melanoma sejteket (5 × 103) 96-kútlemezbe (nunc, Dánia) vetették be, és 2,5 µM mélyvörös Cellroxot inkubáltak teljes rpmi-1640 közegben 30 percig, majd háromszor PBS-ben mosták. Ezután 100 µL megfelelő munkaoldatot (10 µM, 30 µM és 100 µM) adtak a sejtekhez Rpmi-1640 közegben, Fenolvörös nélkül, majd a lemezt sötétben inkubáltuk CO2 inkubátorban 30 percig. Ezt követően a sejteket 450 nm-es lézerrel besugároztuk 5 J/cm2 dózisban. A sejtmagokat további 50 µM Hoechst 33258 festékoldattal festették 15 percig. Az InCell Analyzer 6000 és a Cell Analyzer Workstation V. 3.7.3 (GE Healthcare, USA) segítségével szerezték be a Mel IL és a375 melanoma sejtek optikai képeit és mélyvörös fluoreszcencia intenzitási adatait.
Melanin tartalom meghatározása
a melanin spektrofotometriás meghatározására rutinvizsgálatot alkalmazunk kisebb változásokkal52. Négy melanoma sejtvonal: Mel MTP, Mel IL, Mel Z, a375 és két normál (humán keratinocyták HaCaT és emberi bőr fibroblasztok BJ-5ta) sejtvonalat számoltunk és pelletáltunk annak érdekében, hogy a végső koncentráció 2 × 106 sejt/ml legyen. Az intracelluláris melanintartalom meghatározásához a sejtpelleteket 1 m NaOH-ban oldottuk fel, amely 10% (v/v) DMSO-t tartalmaz, és 80 °C-on inkubáltuk 1 órán keresztül. Inkubálás után a lizátumokat centrifugáltuk (3000 g 5 percig), az abszorbanciát pedig sejtmentes közegben 405 nm-en mértük. Az összes eredményt a fibroblasztok melanintartalmára normalizált abszorbancia intenzitás átlagos értékeként fejezzük ki ± standard deviáció (SD) három független kísérletben. Statisztikai elemzést végeztünk GraphPad Prism verzió 5.0 (GraphPad Software, La Jolla California USA).
Állat-kísérletek
Terápia elsődleges daganatok
Férfi Balb/c nu/nu egerek éves 6-7 hét vásárolt állat gazdaság Shemyakin–Ovchinnikov Intézet Előadások Kémia, orosz tudományos Akadémia, mely alatt ellenőrzött környezeti feltételek szellőztetett állat kabinet Egy-Box 80 (Noroit, Franciaország) a 12 h-sötét-fény ciklus hozzáférést engedélyezett steril víz SPF-egér chow szabadon. Minden állatkísérletet az állatkísérletekre vonatkozó európai és orosz nemzeti iránymutatásoknak megfelelően végeztek, és az FSBSI “N. N. Blokhin NMRCO” Állat-és etikai felülvizsgálati bizottsága jóváhagyta, hivatkozási száma 2017-034.
xenograft egérmodell létrehozásához a Mel IL és az A375 sejteket versén oldattal szüretelték, 300 g-os centrifugálással 5 percen át, és rpmi-1640 közegben szérum nélkül reszuszpendálták. A Melanoma sejt szuszpenziót összekeverték (1:1 térfogat) a Matrigellel (BD Biosciences) és a kapott sejtszuszpenziót (injekciónként 2 × 106 sejt) szubkután ültették be az egerek jobb oldalába, hogy biztosítsák a tumor sikeres indítását és a tumor növekedésének mérését.
az FMN alkalmazása a beoltást követő 10. napon kezdődött, amikor a tumor mérete elérte a 100-120 mm3-t. Az FMN-oldatot (150 µl, 10 µg/ml) intravénásan injektáltuk az egerekbe egy retro-orbitális sinuson keresztül, a daganatokat kék fénnyel besugároztuk 450 nm-en 15 percig a 20 J/cm2 végső dózisig.
a Tumor térfogatát a szokásos kalipációs módszerrel becsülték meg, és a következő képlettel számították ki, feltételezve hemi-ellipszoid alakot:
a fotoaktivált FMN tumorellenes aktivitását a tumor növekedésének gátlási sebességének (TGI%) értékelésével határoztuk meg:
Fotodinámiás kezelés a távoli daganatok
használtuk a C57BL/6 egerek 6-7 hetes korban, vásárolt állat gazdaság Shemyakin–Ovchinnikov Intézet Előadások Kémia, orosz tudományos Akadémia. Minden állatkísérletet az állatkísérletekre vonatkozó európai és orosz nemzeti iránymutatásoknak megfelelően végeztek, és az FSBI “N. N. Állat-és etikai felülvizsgálati bizottsága jóváhagyta. Blokhin NMRCO”, hivatkozási szám 2017-034.
A B16-F10 egér melanoma sejtjeit versén oldattal szüretelték, 300 g-os centrifugálással 5 percen át, és rpmi-1640 közegben szérum nélkül reszuszpendálták. A Melanoma sejt szuszpenziót (1: 1 térfogat) összekeverték a Matrigellel (BD Biosciences), és a kapott sejtszuszpenziót (injekciónként 5 × 105 sejt) szubkután ültették be az egerek jobb és bal oldalába, hogy biztosítsák a tumor sikeres indítását és a tumor növekedésének mérését.
Adminisztráció FMN kezdődött a nap 4 a beadás után, amikor a daganat mérete elérte a 60 ± 16 mm3 FMN megoldás (150 µl, 10 mg/ml) volt fecskendeznek az egerek intravénásan keresztül egy retro-orbitális sinus, a daganatok volt, kiégett a kék-fény, 450 nm-en 15 percig, hogy az utolsó adag 20 J/cm2. Két kontrollcsoportot használtunk: FMN injekció fény besugárzás nélkül; lézeres besugárzás FMN injekció nélkül. A fotoaktivált FMN Tumor térfogatát és tumorellenes aktivitását a fent leírtak szerint becsülték.
hematoxilin és eozin festés
az állatokat a PDT után 24 órán belül a nyaki diszlokáció áldozta fel. Az összes betakarított daganatot 4% paraformaldehiddel rögzítették 24 órán keresztül, majd paraffinnal beágyazták. A (4 µm vastag) szövetrészeket hematoxilinnel és eozinnal festették.
statisztikai elemzés
minden kísérletet három példányban végeztek, hacsak másként nem jelezzük, és minden kísérletet háromszor egymástól függetlenül megismételtünk. Az adatok átlag ± SD-ben vannak kifejezve. A különbségeket statisztikailag szignifikánsnak tekintették, ha a P értékek 0,05-nél kisebbek voltak. Minden statisztikai elemzést GraphPad Prism szoftverrel (GraphPad Software, La Jolla, San Diego, CA, USA) végeztünk.