Sujets
Trente et un hommes en bonne santé entraînés en résistance (22,1 ± 5,0 ans, 180 ± 0,1 cm, 86,1 ± 13,0 kg, 18,1 ± 6,4% de graisse corporelle) ont été informés du protocole d’étude approuvé par le Conseil d’examen institutionnel de l’Université Baylor avant la participation. L’état de la formation a été autodéclaré, et les personnes qui n’avaient pas au moins un an d’expérience avant d’étudier ont été exclues. De plus, les sujets ont été exclus s’ils: 1) avaient des antécédents de maladie métabolique, d’hypertension, hépatorénale, musculo-squelettique, auto-immune ou neurologique; 2) prenaient actuellement des médicaments thyroïdiens, antihyperlipidémiques, hypoglycémiques, antihypertensifs ou androgènes; et 3) avaient pris des suppléments nutritionnels pouvant affecter la masse musculaire et / ou les niveaux d’hormones anaboliques / cataboliques dans les trois mois suivant le début de l’étude.
Tests de base
Les sujets éligibles ont été familiarisés avec le protocole d’étude via une explication verbale et écrite du plan d’étude. Les sujets ont signé une déclaration de consentement éclairé et ont complété leurs antécédents personnels et médicaux tout en effectuant un test de capacité anaérobie Wingate avant le test de base. Les sujets ont reçu l’instruction de s’abstenir de faire de l’exercice intense pendant 48 heures et de jeûner pendant 10 heures avant le test de base (c’est-à-dire le jour 0) qui a eu lieu 3 à 4 jours après la familiarisation pour permettre l’enregistrement de l’apport alimentaire. Cette étude a utilisé un plan d’étude parallèle en double aveugle, contrôlé par placebo, selon lequel les sujets étaient appariés uniformément en grappes en fonction de l’âge et de la masse corporelle.
Protocole expérimental
Pendant les jours 0, 25 et 50, chaque sujet a été signalé au laboratoire après un jeûne de 10 heures. La taille a été mesurée à l’aide d’une anthropométrie standard et la masse corporelle totale a été mesurée à l’aide d’une balance électronique à jauge de contrainte numérique Healthometer calibrée (Bridgeview, IL) avec une précision de ± 0,02 kg. La composition corporelle a ensuite été déterminée à l’aide d’un absorbptiomètre à rayons X à double énergie (DXA) Hologic Discovery W calibré (Hologic Inc., Bedford, MA), tandis que la pression artérielle et la fréquence cardiaque au repos ont été déterminées à l’aide de procédures standard. Les sujets ont ensuite donné environ 25 ml de sang à jeun en utilisant des techniques de ponction veineuse standard pour les panneaux de chimie hématologique et clinique et plus tard l’analyse des cytokines et des hormones. Deux tubes de vacutainer de séparation sérique de 10 ml et un tube de vacutainer K3 EDTA de 5 ml ont été insérés successivement dans le porte-vacutainer pour la collecte de sang à l’aide de techniques de phlébotomie à échantillons multiples. Le sang total a été immédiatement analysé pour une numération globulaire complète tandis que les tubes de vacutainer sérique ont été centrifugés à température ambiante pendant 15 min à 1 500 g, le surnageant sérique a été transféré dans des tubes de microcentrifugation et les échantillons de sérum ont été stockés à -20 ° C pour des analyses hormonales et métabolites ultérieures. Les jours 0 et 50 seulement, les sujets ont donné environ 60 mg de muscle squelettique du vastus lateralis en utilisant la technique de biopsie de Bergstrom. La résistance du haut et du bas du corps a été évaluée à l’aide de procédures de test standard 1RM avec un développé couché et une machine de traîneau de hanche à 35 ° (Nebula, Versailles, OH). Fiabilité Test-retest de ces tests de résistance sur des sujets formés à la résistance dans notre laboratoire ont donné une fiabilité élevée pour le développé couché (r = 0,94) et la presse à jambes (r = 0,91). Après la détermination du traîneau de hanche 1RM, les sujets se sont reposés 10 minutes avant de terminer un test de capacité anaérobie Wingate de 30 secondes sur un ergomètre à cycle informatisé (Lode Excalibur, Lode, Groningue, Pays-Bas) pour évaluer la puissance anaérobie du bas du corps. Ce test consistait à faire sprinter chaque sujet de manière globale sur l’ergomètre du vélo pendant 30 secondes contre une charge de travail standard de 0,075 kg · kg-1 de poids corporel. La fiabilité test-retest de la puissance de crête absolue et de la puissance moyenne dans notre laboratoire a également donné des valeurs de fiabilité élevées (r = 0,69 et r = 0.95, respectivement, P< 0,05).
Biopsies musculaires percutanées
Des biopsies musculaires ont été effectuées les jours 0 et 50 précédant tous les tests de résistance afin d’éviter une éventuelle perturbation myofibrillaire due à l’exercice. Les sujets ont reçu l’ordre de s’abstenir de faire de l’exercice 48 heures avant chaque biopsie musculaire. Le muscle a été extrait de la partie latérale du vastus lateralis à mi-chemin entre la rotule et la crête iliaque de la jambe dominante à l’aide d’une aiguille de biopsie de 5 mm avec aspiration appliquée. Brièvement, 1,5 ml de 1.0% de lidocaïne HCl a été injecté par voie sous-cutanée avant de faire une petite incision pilote. À l’aide de procédures de double coupe et d’aspiration appliquée, l’échantillon a d’abord fait enlever toute la graisse et le tissu conjonctif visibles avant d’être congelé à l’éclair dans de l’azote liquide. Tous les échantillons ont ensuite été stockés à -80°C jusqu’à des analyses ultérieures.
Protocole de supplémentation et suivi alimentaire
En double aveugle, les sujets ont ingéré quatre gélules de 250 mg contenant un placebo d’huile de maïs ou un AA (Facteur X, Nutrition moléculaire, Jupiter, FL) pendant les 50 jours suivant les tests de base. Les suppléments ont été préparés sous forme de capsules et emballés dans des flacons génériques par Molecular Nutrition. La conformité a été contrôlée en demandant aux sujets de retourner les flacons de supplément vides après 25 et 50 jours de supplémentation. Conformément aux directives précédentes et dans le but de s’assurer que l’apport énergétique et protéique était suffisant pour faciliter l’hypertrophie musculaire, tous les sujets ont reçu l’instruction d’augmenter l’apport calorique d’environ 500 kcal · jour-1 tout en maintenant un apport protéique estimé de 2 g · kg-1 · jour-1 par rapport à l’analyse diététique de base. Les sujets ont reçu une poudre de remplacement de repas disponible dans le commerce (Lean Body, Labrada Nutrition, Houston, TX) contenant environ 290 kilocalories, 24 g de glucides, 45 g de protéines et 1 g de matières grasses par portion dans le but de répondre aux besoins en énergie et en protéines mentionnés ci-dessus. Selon l’apport en protéines de base, les sujets ont été invités à ingérer 1 à 2 paquets du supplément de remplacement de repas le matin et / ou immédiatement après chaque entraînement. De plus, les sujets ont été invités à éviter la consommation régulière d’aliments connus pour être riches en acides gras ω-3, notamment l’huile de poisson, l’huile de lin, le poisson d’eau froide, l’huile d’olive, l’huile de sésame, le beurre d’arachide, la N-acétyl-cystéine, l’acide linoléique conjugué, ainsi que des médicaments anti-inflammatoires, notamment l’acétaminophène, l’ibuprofène, l’aspirine et d’autres anti-inflammatoires non stéroïdiens. Apport alimentaire ainsi que linoléique (18: 2, ω-6), linolénique (18:3, ω-3) et la consommation d’AA ont été surveillées avec des rappels alimentaires de 4 jours aux jours 0, 25 et 50 et évaluées à l’aide du logiciel de nutrition Food Processor III (ESHA Nutrition Research, Salem, OR).
Protocole d’entraînement à la résistance
Sur une période de 50 jours, les sujets ont suivi un programme d’entraînement à la résistance à périodisation linéaire à corps divisé en 4 jours· semaine 1. Les ascenseurs du haut du corps comprenaient un développé couché, une traction au lat, une presse aux épaules, des rangées assises, des épaules, des mouches thoraciques, des boucles de biceps et des pressions sur les triceps, tandis que les ascenseurs du bas du corps comprenaient une presse aux jambes, une extension du dos, des remontées, des boucles de jambes, une extension de jambe, des augmentations de talon et des craquements abdominaux deux fois par semaine. Les sujets ont effectué 3 séries de 10 répétitions avec autant de poids qu’ils pouvaient soulever par série (c’est-à-dire 60 à 80% de 1RM). Les périodes de repos entre les exercices ne dépassaient pas 3 minutes, tandis que le repos entre les séries ne dépassait pas 2 minutes. La formation a été dispensée au centre de la vie étudiante de l’université, documentée dans les journaux de formation et approuvée par des membres du personnel désignés pour vérifier la conformité et suivre les progrès. Ce protocole a été démontré dans des recherches antérieures pour favoriser des gains significatifs de force musculaire, d’endurance musculaire et de masse sans graisse.
Analyses de sérum et de sang total
Des échantillons de sérum et de sang total ont été utilisés pour évaluer l’innocuité clinique pendant les protocoles de supplémentation. Serum samples were assayed for comprehensive metabolic panels including glucose, total protein, blood urea nitrogen (BUN), creatinine, BUN/creatinine ratio, uric acid, aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), creatine kinase (CK), lactate dehydrogenase (LDH), gamma-glutamyl transpeptidase (GGT), albumin, globulin, sodium, chloride, calcium, carbon dioxide, total bilirubin, alkaline phosphatase (ALP), triglycerides, cholesterol, HDL and LDL using a Dade Dimension XL clinical chemistry system (Dade Behring Inc., Newark, DE). La numération globulaire complète, y compris la numération globulaire, l’hémoglobine, l’hématocrite, le volume cellulaire moyen, l’hémoglobine corpusculaire moyenne, la concentration d’hémoglobine corpusculaire moyenne, la largeur de distribution des globules rouges, la numération globulaire blanche, les neutrophiles, les lymphocytes, les monocytes, les éosinophiles et les basophiles ont été analysés par cytométrie en flux à l’aide du Cell-DYN 1800 (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). Essai pour tester la fiabilité (à l’intérieur et entre) de la réalisation de ces essais variait de 2 à 6% pour les essais individuels avec un coefficient de variation moyen (C V) de 3,0%. Des échantillons ont été prélevés en double pour vérifier les résultats si les valeurs observées étaient en dehors des valeurs témoins et/ou des normes cliniques conformément aux procédures standard.
Des échantillons de sérum ultérieurs ont ensuite été analysés pour le cortisol (CORT), la testostérone libre (fTEST), la testostérone totale (tTEST), l’interleukine-6 (IL-6), la prostaglandine E2 (PGE2) et la prostaglandine F2a (PGF2a). Des dosages d’immunoabsorbants enzymatiques commerciaux ont été utilisés pour analyser les concentrations sériques de PGF2a, PGE2 et IL-6 (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) et CORT, fTEST et tTEST (Diagnostic Systems Laboratories, Webster, TX). Le C V de la réalisation de ces essais basés sur l’EIE variait de 3,0 à 5,0%.
Isolement de l’ARN total
L’ARN cellulaire total a été extrait de l’homogénéat d’échantillons de biopsie avec une solution monophasique de phénol et d’isothiocyanate de guanidine contenue dans le TRI-réactif (Sigma Chemical Co., Saint-Louis, MO). Les concentrations totales d’ARN de chaque échantillon ont été déterminées par spectrophotométrie avec une densité optique de 260 nm (OD260), la concentration finale étant ajustée à 200 ng. µl-1 en diluant les extraits bruts d’ARN total dans du H2O exempt de nucléase traité par DEPC. Il a été démontré que cette procédure donne de l’ARN non dégradé, exempt d’ADN et de protéines, comme l’indiquent les bandes d’ARN ribosomiques 28S et 18S proéminentes, ainsi qu’un rapport OD260 / OD280 d’environ 2,0. Les échantillons d’ARN ont été stockés à -80°C jusqu’à des analyses ultérieures.
Transcription inverse et synthèse d’ADN clonal
Les solutions standardisées d’ARN cellulaire total ont été transcrites inverse pour synthétiser l’ADN clonal (ADNc) comme décrit précédemment. En bref, un mélange réactionnel de transcription inverse a été incubé à 42 °C pendant 40 minutes, chauffé à 85 °C pendant 5 minutes, puis refroidi rapidement sur de la glace donnant le produit ADNc. Les concentrations initiales des modèles d’ADNc ont été normalisées à 200 ng * µl-1 avant l’amplification en temps réel de la réaction en chaîne de la polymérase (RT-PCR) en détectant les produits synthétisés d’ADNc bruts par spectrophotométrie à une longueur d’onde de 260 nm et en les diluant dans du H2O sans nucléase. Les solutions d’ADNc normalisées ont été congelées à -80 ° C jusqu’à ce que la RT-PCR en temps réel soit effectuée.
RT-PCR
Des paires d’amorces d’oligonucléotides anti-sens et de sens ont été construites à l’aide du logiciel Beacon Designer disponible dans le commerce (Bio-Rad, Hercules, CA) à partir de séquences d’ARNm connues publiées dans la base de données de nucléotides GenBank et synthétisées commercialement (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). Les amorces oligonucléotides anti-sens 5′ et 3′ suivantes ont été utilisées pour isoler les trois isoformes du CMH adultes (Type I, IIa et IIx) : ARNm du CMH de type I (amorce 5′: bases 776-796, amorce 3′: bases 1398-1378, GenEMBL AC X06976), ARNm du CMH de type IIa (amorce 5′: bases 1785-1805, amorce 3′ : bases 2440-2420, GenEMBL AC AF111784), ARNm MHC de type IIx (amorce 5′ : bases 1138-1158, amorce 3′ : bases 1746-1726, GenEMBL AC AF111785). Ces amorces amplifient des fragments de 141, 145 et 148 paires de bases, respectivement, pour le CMH de type I, IIa, IIx. la β-actine a été utilisée comme étalon de référence externe pour détecter le changement relatif de la quantité d’ARNm cible en raison de sa considération comme gène d’entretien exprimé de manière constitutive, Ces amorces de β-actine amplifient un fragment de PCR de 135 paires de bases. Deux cents ng d’ADNc ont été ajoutés à chacune des quatre réactions de PCR pour le CMH de type I, -IIa, et -IIx, et la β-actine. Plus précisément, chaque réaction de PCR contenait les mélanges suivants: 2 µl de matrice d’ADNc ont été ajoutés ainsi que 12,5 µl de Supermix vert 2× SYBR (Bio-Rad, Hercules, CA), 1,5 µl d’amorces sens et anti-sens et 7,5 µl de dH2O sans nucléase]. Chaque réaction de PCR a été amplifiée avec un thermocycleur (Bio Rad, Hercules, CA) et la séquence d’amplification a impliqué une étape de dénaturation à 95 ° C pendant 30 secondes, un recuit d’amorce à 55 ° C pendant 30 secondes et une extension à 72 ° C pendant 60 secondes. La RT-PCR a été réalisée sur 40 cycles, la fluorescence émise par le fluorophore vert SYBR étant mesurée après chaque cycle. Une émission de fluorescence se produit en raison de l’intégration du vert SYBR dans l’ADNc double brin produit lors de la réaction de PCR. Toutes les valeurs de CT ont été évaluées dans la partie linéaire de l’amplification et une analyse de la courbe de fusion de l’ADN a été effectuée après l’amplification pour s’assurer que les produits à gène unique étaient amplifiés en l’absence d’amorces-dimères. La quantification de tout l’ARNm a été exprimée par rapport à l’expression de la β-actine. Une comparaison des rapports de valeurs CT a été utilisée pour comparer les changements dans l’expression génique basale entre les groupes AA et PLA. Une électrophorèse sur gel d’agarose utilisant des aliquotes de 25 µl des mélanges réactionnels de PCR finalisés a été réalisée en 1.gels d’agarose à 5% utilisant un tampon 1 × acide Tris-Borique-EDTA (TBE) et éclairés avec un transilluminateur UV (Chemi-Doc XRS, Bio-Rad, Hercules, CA) pour vérifier l’amplification positive de l’ARNm cible (données non représentées). Le C V pour le CMH I, IIa et IIx était de 2,06 %, 3,18 % et 2,73 %, respectivement.
Quantification des protéines musculaires totales
La protéine totale restante de la procédure d’isolement de l’ARN total a été isolée avec de l’isopropanol, de l’éthanol et du chlorhydrate de guanidine 0,3 M. La protéine myofibrillaire a été isolée avec 0.dodécylsulfate de sodium (SDS) à 1%, avant que la teneur en protéines ne soit déterminée par spectrophotométrie à l’aide d’un test de Bradford à une longueur d’onde de 595 nm. Une courbe standard a été générée en utilisant (r2 = 0,98, P< 0,001) de l’albumine sérique bovine comme étalon et représentée par rapport au poids humide des muscles. Chaque échantillon de protéines a ensuite été dilué à 50 µg de protéines par tampon SDS de 30 µl pour un immunoblot ultérieur. Le C V pour la protéine myofibrillaire était de 2,03%.
Quantification de l’isoforme de la protéine MHC
La composition des isoformes de la protéine MHC dans chaque échantillon d’homogénat musculaire a été déterminée par page SDS automatisée à l’aide de puces Experion Pro260 (Bio-Rad, Hercules, CA). Environ 6 µl d’aliquotes de chaque échantillon ont été pipetés dans chaque puits d’échantillon sur la puce électronique. Chaque échantillon inconnu a été préparé à partir de 4 µl de la dilution protéique de chaque sujet (soit 4 µl de l’échelle de poids moléculaire), de 2 µl de tampon d’échantillon avec du β-mercaptoéthanol et de 84 µl d’eau désionisée. D’après les résultats de Gazith et de ses collègues, les trois isoformes du CMH devraient migrer dans la région de 200 à 210 kilodaultons à l’intérieur du gel de polyacrylamide par rapport à l’échelle de poids moléculaire. Les gels ont été visualisés numériquement par le logiciel Experion (Bio-Rad, Hercules, CA) et les concentrations de CMH dans chaque échantillon ont été évaluées en comparant la densité arbitraire de chaque isoforme de CMH aux densités arbitraires de marqueurs de poids moléculaire avec des concentrations connues. Le C V des bandes protéiques ≥10 kD était ≤1,1%.
Immunoblotting des protéines
La quantification des récepteurs PGF2a (FP) et PGE2 (EP3) a été réalisée à température ambiante en extrayant la protéine musculaire totale de l’homogénéat et en transférant 50 µg de protéine totale sur des membranes de nitrocellulose à l’aide d’un système de transfert de protéines Bio-Dot (Bio-Rad, Hercules, CA). Les membranes bloquées ont été incubées avec une solution de blocage pendant 1 heure sur un rocker orbital, décantées et les membranes ont été incubées avec une solution de lavage TTBS pendant 5 minutes pour un total de trois lavages. Les membranes ont été incubées avec des anticorps polyclonaux spécifiques anti-récepteur FP et anti-récepteur EP3 (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI), dilués à 4 µg·ml-1, pendant 1 à 2 heures sur un rocker orbital. Des solutions d’anticorps primaires ont ensuite été décantées et les membranes lavées avec une solution de TTBS pendant 5 minutes sur une bascule orbitale pour un total de trois lavages. La solution de lavage TTBS a été décantée et les membranes ont été incubées avec une solution d’anticorps anti-lapin de chèvre biotinylée secondaire (Bio-Rad, Hercules, CA) pendant 1 heure sur un rocker orbital. En continuant, la solution d’anticorps anti-lapin de chèvre biotinylée secondaire a été décantée et les membranes incubées dans une solution de lavage TTBS pour un total de trois lavages à 5 minutes par lavage. Les membranes ont été incubées avec une solution de complexe de phosphatase alcaline streptavidine-biotinylée (Bio-Rad, Hercules, CA) pendant 1 heure sur une bascule orbitale. Enfin, la solution de complexe de phosphatase alcaline streptavidine-biotinylée a été décantée et les membranes lavées trois fois avec une solution de TTBS à 5 minutes par lavage sur un agitateur orbital. Une solution de développement de la couleur contenant du BCIP/NBT (Bio-Rad, Hercules, CA) a été ajoutée et le développement de la couleur a été surveillé pendant 30 à 60 minutes. Le développement de la couleur a été stoppé par incubation de la membrane dans du H2O distillé en double pendant 10 minutes sur un rocker orbital. Les membranes bloquées ont été numérisées par densitométrie à l’aide d’un système d’imagerie Chemi-Doc XRS (Bio-Rad, Hercules, CA) et la densité de bande a été exprimée en unités de densité intégrées par rapport au poids musculaire.
Analyse statistique
Des analyses statistiques ont été effectuées à l’aide de SPSS (version 14.0, SPSS Inc., Chicago, IL). Les variables de sang total, de sérum, de performance et de composition corporelle ont été analysées à l’aide d’une analyse de variance (ANOVA) 2 × 3 (groupe × séance de test) avec des tests univariés à mesures répétées. Les niveaux de protéines des récepteurs MHC, FP et EP3 ont été analysés à l’aide d’ANOVA séparées de 2 × 2 (groupe × séance de test) avec des mesures répétées. De plus, dans le cas d’un effet principal significatif pour le groupe, des ANOVAs unidirectionnelles avec des mesures répétées sur les séances de test ont été effectuées pour chaque groupe afin d’évaluer les différences entre les tests. Des tests t indépendants ont été utilisés pour analyser les modifications de l’expression de l’ARNm du CMH après 50 jours de supplémentation. En plus de l’analyse du score brut, une analyse du score delta (c.-à-d. les valeurs du jour 0 soustraites du jour 25 et / ou 50) a été effectuée pour les variables présentant des variations étrangères entre les groupes au jour 0. Comme mentionné avec les scores bruts, une analyse de variance (ANOVA) à 2 × 3 (séance de test de groupe ×) avec des tests univariés à mesures répétées a été utilisée pour analyser les scores delta pour la composition corporelle, les variables de performance et les concentrations hormonales, tandis qu’une ANOVA à mesures répétées à 2 × 2 a été utilisée pour analyser tous les scores delta intramusculaires. Dans des circonstances où des variances égales au sein des groupes ne pouvaient pas être présumées, le facteur de correction de l’epsilon de Hunyhs-Feldt a été utilisé pour ajuster les ratios du groupe F. Dans des circonstances où des tendances statistiques semblaient exister (P = 0,05 à 0.10), les tailles d’effet ont également été signalées sous forme d’Eta partielle au carré (np2). On a déterminé que les tailles d’effet au carré de l’Eta partielle étaient faibles (np2 ≤ 0,01), moyennes (np2 = 0,06), fortes = (np2 = 0,14) comme décrit précédemment. La signification pour toutes les analyses statistiques a été déterminée en utilisant un niveau alpha de 0,05. Il convient de noter qu’une analyse de puissance a priori de la conception a indiqué qu’une taille n de 15 participants par traitement donnerait une puissance élevée (> 0,8) pour des valeurs delta variables de critère de 0,75 à 1,25. Il convient également de noter que l’analyse post hoc des valeurs aberrantes à l’aide de diagrammes à boîtes a été effectuée dans des circonstances où il y avait des interactions significatives entre le groupe et le temps pour s’assurer qu’il n’y avait pas de valeurs aberrantes. Toutes les données sont déclarées sous forme de moyennes ± écarts types (SD).