Sujetos
Treinta y un hombres sanos entrenados en resistencia (22,1 ± 5,0 años, 180 ± 0,1 cm, 86,1 ± 13,0 kg, 18,1 ± 6,4% de grasa corporal) fueron informados del protocolo del estudio aprobado por la Junta de Revisión Institucional en la Universidad de Baylor antes de participar. El estado de entrenamiento fue autoinformado, y se excluyeron los individuos que carecían de al menos un año de experiencia antes del estudio. Además, se excluyó a los sujetos si: 1) tenían antecedentes de enfermedades metabólicas, hipertensivas, hepatorrenales, musculoesqueléticas, autoinmunes o neurológicas; 2) estaban tomando medicamentos tiroideos, antihiperlipidémicos, hipoglucémicos, antihipertensivos o androgénicos; y 3) habían tomado suplementos nutricionales que pudieran afectar la masa muscular y/o los niveles de hormonas anabolizantes/catabólicas dentro de los tres meses posteriores al inicio del estudio.
Pruebas basales
Los sujetos elegibles se familiarizaron con el protocolo del estudio a través de una explicación verbal y escrita del diseño del estudio. Los sujetos firmaron una declaración de consentimiento informado y completaron historias personales y médicas al mismo tiempo que completaban una prueba de capacidad anaeróbica de Wingate antes de la prueba de referencia. Se instruyó a los sujetos a abstenerse de hacer ejercicio extenuante durante 48 horas y ayunar durante 10 horas antes de la prueba de referencia (es decir, el día 0), que se produjo 3-4 días después de la familiarización para permitir el registro de la ingesta dietética. Este estudio empleó un diseño de estudio paralelo, doble ciego, controlado con placebo, en el que los sujetos se emparejaron uniformemente en grupos de acuerdo con la edad y la masa corporal.
Protocolo experimental
Durante los días 0, 25 y 50, cada sujeto informó al laboratorio después de un ayuno de 10 horas. La altura se midió mediante antropometría estándar y la masa corporal total se midió mediante una escala electrónica calibrada de galgas extensométricas digitales (Bridgeview, IL) con una precisión de ± 0,02 kg. A continuación, se determinó la composición corporal mediante un absorbómetro de rayos X de doble energía (DXA) calibrado de Hologic Discovery W (Hologic Inc., Bedford, MA), mientras que la presión arterial y la frecuencia cardíaca en reposo se determinaron mediante procedimientos estándar. Luego, los sujetos donaron aproximadamente 25 ml de sangre en ayunas utilizando técnicas estándar de punción venosa para análisis hematológicos, de química clínica y análisis de citoquinas y hormonas posteriores. Se insertaron dos tubos vacutainer de separación sérica de 10 ml y un tubo vacutainer K3 EDTA de 5 ml en el soporte del vacutainer para la recolección de sangre en sucesión utilizando técnicas de flebotomía de múltiples muestras. La sangre entera se analizó inmediatamente para un recuento sanguíneo completo, mientras que los tubos vacutainer séricos se centrifugaron a temperatura ambiente durante 15 minutos a 1.500 g, el sobrenadante sérico se transfirió a tubos microcentrífugos y las muestras de suero se almacenaron a -20°C para análisis hormonales y de metabolitos posteriores. Solo en los días 0 y 50, los sujetos donaron aproximadamente 60 mg de músculo esquelético del vasto lateral utilizando la técnica de biopsia de Bergstrom. La resistencia de la parte superior e inferior del cuerpo se evaluó utilizando procedimientos de prueba estándar de 1RM con press de banca y máquina de trineo de cadera de 35° (Nebula, Versailles, OH). La confiabilidad de estas pruebas de resistencia en sujetos entrenados en resistencia en nuestro laboratorio ha arrojado una alta confiabilidad para la prensa de banco (r = 0.94) y la prensa de piernas (r = 0.91). Después de determinar el trineo de cadera 1RM, los sujetos descansaron 10 minutos antes de completar una prueba de capacidad anaeróbica alada de 30 segundos en un cicloergómetro computarizado (Lode Excalibur, Lode, Groningen, Países Bajos) para evaluar la potencia anaeróbica de la parte inferior del cuerpo. Esta prueba consistió en que cada sujeto sprint en una moda en la bicicleta ergométrica durante 30 segundos contra un estándar de carga de trabajo de 0.075 kg·kg-1 de peso corporal. La fiabilidad de las pruebas de repetición de pruebas para la potencia máxima absoluta y la potencia media en nuestro laboratorio también ha arrojado valores de alta fiabilidad (r = 0,69 y r = 0.95, respectivamente, P < 0,05).
Biopsias musculares percutáneas
Las biopsias musculares se tomaron los días 0 y 50 antes de todas las pruebas de fuerza para evitar posibles alteraciones miofibrilares debidas al ejercicio . Se instruyó a los sujetos a abstenerse de hacer ejercicio 48 horas antes de cada biopsia muscular. Se extrajo músculo de la porción lateral del vasto lateral a mitad de camino entre la rótula y la cresta ilíaca de la pierna dominante utilizando una aguja de biopsia de 5 mm con succión aplicada . Brevemente, 1,5 ml de 1.Se inyectó HCl de lidocaína al 0% por vía subcutánea antes de realizar una pequeña incisión piloto. Usando procedimientos de doble corte y succión aplicada, la muestra primero tuvo que extraer toda la grasa visible y el tejido conectivo antes de ser congelada flash en nitrógeno líquido. Todas las muestras se almacenaron posteriormente a -80°C hasta análisis posteriores.
Protocolo de suplementación y monitoreo dietético
De manera doble ciego, los sujetos ingirieron cuatro cápsulas de 250 mg que contenían un placebo de aceite de maíz o AA (Factor X, Nutrición Molecular, Júpiter, FL) durante 50 días después de la prueba de referencia. Los suplementos se prepararon en forma de cápsula y se envasaron en frascos genéricos por Molecular Nutrition. El cumplimiento se supervisó haciendo que los sujetos devolvieran botellas vacías de suplementos después de 25 y 50 días de suplementación. De acuerdo con las directrices anteriores y en un esfuerzo por garantizar que la ingesta de energía y proteínas fuera adecuada para facilitar la hipertrofia muscular, se instruyó a todos los sujetos a aumentar la ingesta calórica en aproximadamente 500 kcal·día-1, manteniendo al mismo tiempo una ingesta estimada de proteínas de 2 g·kg-1·día-1 en comparación con el análisis dietético basal . A los sujetos se les proporcionó un polvo sustitutivo de comidas disponible comercialmente (Lean Body, Labrada Nutrition, Houston, TX) que contenía aproximadamente 290 kilocalorías, 24 g de carbohidratos, 45 g de proteínas y 1 g de grasa por porción en un intento de satisfacer los requisitos de energía y proteínas mencionados anteriormente. Dependiendo de la ingesta inicial de proteínas, se les dijo a los sujetos que ingirieran de 1 a 2 paquetes del suplemento de reemplazo de comida por la mañana y/o inmediatamente después de cada entrenamiento . Además, se instruyó a los sujetos a evitar el consumo regular de alimentos que se sabe que son altos en ácidos grasos ω-3, incluidos el aceite de pescado, el aceite de linaza, el pescado de agua fría, el aceite de oliva, el aceite de sésamo, la mantequilla de maní, la N-acetil-cisteína, el ácido linoleico conjugado, así como medicamentos antiinflamatorios que incluyen paracetamol, ibuprofeno, aspirina y otros medicamentos antiinflamatorios no esteroideos . Ingesta dietética, así como linoleico (18: 2, ω-6), linolénico (18:3, ω-3), y la ingesta de AA se monitorizaron con retiros dietéticos de 4 días en los días 0, 25 y 50 y se evaluaron utilizando el Software de nutrición de Procesador de Alimentos III (ESHA Nutrition Research, Salem, OR).
Protocolo de entrenamiento de resistencia
Durante un período de 50 días, los sujetos completaron un programa de entrenamiento de resistencia de periodización lineal de cuerpo dividido de 4 días·semana-1. Los levantamientos de la parte superior del cuerpo incluyeron press de banca, tirón de lats, press de hombros, filas sentadas, encogimiento de hombros, moscas en el pecho, rizos de bíceps y flexiones de tríceps, mientras que los levantamientos de la parte inferior del cuerpo incluyeron prensa de piernas, extensión de espalda, aumento de pasos, rizos de piernas, extensión de piernas, elevación del talón y abdominales dos veces por semana. Los sujetos realizaron 3 series de 10 repeticiones con tanto peso como pudieron levantar por serie (es decir, 60-80% de 1RM). Los períodos de descanso entre ejercicios no excedieron los 3 minutos, mientras que el descanso entre sesiones no excedió los 2 minutos. La capacitación se llevó a cabo en el centro de vida estudiantil de la universidad, se documentó en registros de capacitación y fue firmada por miembros del personal designados para verificar el cumplimiento y monitorear el progreso. Este protocolo se ha demostrado en investigaciones anteriores para promover ganancias significativas en la fuerza muscular, la resistencia muscular y la masa libre de grasa .
Análisis de suero y sangre total
Se utilizaron muestras de suero y sangre total para evaluar la seguridad clínica durante los protocolos de suplementación. Serum samples were assayed for comprehensive metabolic panels including glucose, total protein, blood urea nitrogen (BUN), creatinine, BUN/creatinine ratio, uric acid, aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), creatine kinase (CK), lactate dehydrogenase (LDH), gamma-glutamyl transpeptidase (GGT), albumin, globulin, sodium, chloride, calcium, carbon dioxide, total bilirubin, alkaline phosphatase (ALP), triglycerides, cholesterol, HDL and LDL using a Dade Dimension XL clinical chemistry system (Dade Behring Inc., Newark, DE). Se analizaron recuentos completos de glóbulos rojos, hemoglobina, hematocrito, volumen celular medio, hemoglobina corpuscular media, concentración de hemoglobina corpuscular media, ancho de distribución de glóbulos rojos, recuentos de glóbulos blancos, neutrófilos, linfocitos, monocitos, eosinófilos y basófilos mediante citometría de flujo utilizando el Cell-DYN 1800 (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). La confiabilidad de prueba a prueba (dentro y entre) de la realización de estos ensayos varió de 2 a 6% para ensayos individuales con un coeficiente de variación promedio (C V ) de 3,0%. Las muestras se procesaron por duplicado para verificar los resultados si los valores observados estaban fuera de los valores de control y / o las normas clínicas de acuerdo con los procedimientos estándar.
Posteriormente se analizaron muestras de suero para cortisol( CORT), testosterona libre (fTEST), testosterona total (tTEST), interleucina-6 (IL-6), prostaglandina E2 (PGE2) y prostaglandina F2a (PGF2a). Se utilizaron ensayos de inmunoabsorbentes enzimáticos comerciales para analizar las concentraciones séricas de PGF2a, PGE2 e IL-6 (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) y CORT, fTEST y tTEST (Laboratorios de Sistemas de Diagnóstico, Webster, TX). La Cv de realizar estos ensayos basados en EIA osciló entre el 3,0 y el 5,0%.
Aislamiento total de ARN
El ARN celular total se extrajo del homogeneizado de muestras de biopsia con una solución monofásica de isotiocianato de fenol y guanidina contenida en el TRI-reactivo (Sigma Chemical Co. En saint Louis, MO) . Las concentraciones totales de ARN de cada muestra se determinaron espectrofotométricamente con una densidad óptica de 260 nm (OD260), con una concentración final ajustada a 200 ng·µl-1 diluyendo los extractos totales crudos de ARN en H2O libre de nucleasas tratado con DEPC. Se ha demostrado que este procedimiento produce ARN no degradado, libre de ADN y proteínas, como lo indican las bandas prominentes de ARN ribosómico 28S y 18S, así como una relación OD260/OD280 de aproximadamente 2,0 . Las muestras de ARN se almacenaron a -80°C hasta análisis posteriores.
Transcripción inversa y síntesis de ADN clonal
Las soluciones estandarizadas de ARN celular total se transcribieron inversamente para sintetizar ADN clonal (ADNc) como se describió anteriormente . En resumen, se incubó una mezcla de reacción de transcripción inversa a 42°C durante 40 minutos, se calentó a 85°C durante 5 minutos y luego se enfrió rápidamente en hielo para obtener el producto de ADNc. Las concentraciones iniciales del modelo de ADNc se estandarizaron a 200 ng·µl-1 antes de la amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) mediante la detección espectrofotométrica de productos sintetizados de ADNc crudo a una longitud de onda de 260 nm y su dilución en H2O libre de nucleasas. Las soluciones de ADNc estandarizadas se congelaron a -80°C hasta que se realizó la RT-PCR en tiempo real.
RT-PCR
Los pares de cebadores anti-sensoriales y oligonucleótidos sensoriales se construyeron utilizando el software de diseño de balizas disponible comercialmente (Bio-Rad, Hercules, CA) a partir de secuencias de ARNm conocidas publicadas en la base de datos de nucleótidos GenBank y sintetizadas comercialmente (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). Para aislar las tres isoformas MHC adultas (Tipo I, IIa y IIx), se utilizaron los siguientes cebadores oligonucleótidos de 5′ de sentido y 3′ de anti-sentido: ARNm MHC de tipo I (cebador de 5′: bases 776-796, cebador de 3′: bases 1398-1378, GenEMBL AC X06976), ARNm MHC de tipo IIa (cebador de 5′ : bases 1785-1805, imprimación de 3 pies: bases 2440-2420, GenEMBL AC AF111784), ARNm MHC Tipo IIx (imprimación de 5 pies: bases 1138-1158, imprimación de 3 pies: bases 1746-1726, GenEMBL AC AF111785). Estos cebadores amplifican fragmentos de 141, 145 y 148 pares de bases, respectivamente, para MHC de tipo I, IIa y IIx. la β-actina se utilizó como un estándar de referencia externo para detectar cambios relativos en la cantidad de ARNm diana debido a su consideración como un gen de limpieza expresado constitutivamente , Estos cebadores de β-actina amplifican un fragmento de PCR de 135 pares de bases. Se agregaron doscientos ng de ADNc a cada una de las cuatro reacciones de PCR para MHC Tipo I, -IIa, y-IIx, y β-actina. En concreto, cada reacción de PCR contenía las siguientes mezclas: se añadieron 2 µl de plantilla de ADNc junto con 12,5 µl de 2× SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA) , 1,5 µl de cebadores sensoriales y antisensores y 7,5 µl de dH2O libre de nucleasas]. Cada reacción de PCR se amplificó con un termociclador (Bio Rad, Hercules, CA) y la secuencia de amplificación involucró un paso de desnaturalización a 95°C durante 30 segundos, recocido de imprimación a 55°C durante 30 segundos y extensión a 72°C durante 60 segundos . La RT-PCR se realizó durante 40 ciclos con fluorescencia emitida desde el fluoróforo verde SYBR que se midió después de cada ciclo. Se produce una emisión de fluorescencia debido a la integración del verde SYBR en el ADNc de doble cadena producido durante la reacción de PCR. Todos los valores de TC se evaluaron en la porción lineal de amplificación y se realizó un análisis de curva de fusión de ADN después de la amplificación para asegurar que los productos de un solo gen se amplificaron en ausencia de dímeros de imprimación. La cuantificación de todo el ARNm se expresó en relación con la expresión de β-actina. Para comparar los cambios en la expresión génica basal entre los grupos AA y PLA, se utilizó una comparación de los cocientes de valores de TC. En 1 se realizó electroforesis en gel de agarosa utilizando alícuotas de 25 µl de las mezclas de reacción PCR finalizadas.Geles de agarosa al 5% con tampón de ácido Tris-bórico-EDTA (TBE) de 1× e iluminados con transiluminador UV (Chemi-Doc XRS, Bio-Rad, Hercules, CA) para verificar la amplificación positiva del ARNm objetivo (datos no mostrados) . El C V para CMH I, IIa y IIx fue de 2,06%, 3,18% y 2,73%, respectivamente .
Cuantificación total de proteínas musculares
La proteína total restante del procedimiento de aislamiento de ARN total se aisló con isopropanol, etanol y clorhidrato de guanidina de 0,3 M. La proteína miofibrilar se aisló con 0.dodecil sulfato de sodio al 1% (SDS), antes de que se determine el contenido de proteínas espectrofotométricamente utilizando un ensayo de Bradford a una longitud de onda de 595 nm. Se generó una curva estándar utilizando (r2 = 0,98, P < 0,001) albúmina sérica bovina como estándar y representada en relación con el peso húmedo muscular . Cada muestra de proteína se diluyó posteriormente a 50 µg de proteína por tampón SDS de 30 µl para inmunoblotar posteriormente. La C V para la proteína miofibrilar fue de 2,03%.
Cuantificación de isoformas de proteínas MHC
La composición de isoformas de proteínas MHC dentro de cada muestra de homogeneizado muscular se determinó mediante SDS-PAGE automatizado utilizando chips Experion Pro260 (Bio-Rad, Hercules, CA). Se pipetearon aproximadamente 6 µl de alícuotas de cada muestra en cada pozo de muestra en el microchip. Cada muestra desconocida se preparó a partir de 4 µl de la dilución de proteínas de cada sujeto (o 4 µl de la escala de peso molecular), 2 µl de tampón de muestra con β-mercaptoetanol y 84 µl de agua desionizada. Según los hallazgos de Gazith y sus colegas, se esperaba que las tres isoformas MHC migraran en la región de 200-210 kilodaultones dentro del gel de poliacrilamida en relación con la escala de peso molecular. Los geles fueron visualizados digitalmente por el software Experion (Bio-Rad, Hercules, CA) y las concentraciones de MHC en cada muestra se evaluaron comparando la densidad arbitraria de cada isoforma de MHC con las densidades arbitrarias de marcadores de peso molecular con concentraciones conocidas. El C V de las bandas proteicas ≥10 kD fue ≤1,1%.La cuantificación de receptores de PGF2a (FP) y PGE2 (EP3) se realizó a temperatura ambiente extrayendo proteína muscular total del homogeneizado y transfiriendo 50 µg de proteína total a membranas de nitrocelulosa mediante un sistema de transferencia de proteína Bio-Dot (Bio-Rad, Hercules, CA). Las membranas secadas se incubaron con solución de bloqueo durante 1 hora en un eje de balancín orbital, se decantaron y las membranas se incubaron con una solución de lavado TTBS durante 5 minutos para un total de tres lavados. Las membranas se incubaron con anticuerpos policlonales específicos del receptor anti-FP y del receptor anti-EP3 (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI), diluidos a 4 µg·ml-1, durante 1 a 2 horas en un balancín orbital. A continuación, se decantaron las soluciones de anticuerpos primarios y se lavaron las membranas con solución TTBS durante 5 minutos en un eje de balancín orbital para un total de tres lavados. La solución de lavado TTBS se decantó y las membranas se incubaron con una solución de anticuerpos biotinilados secundarios de cabra contra conejo (Bio-Rad, Hercules, CA) durante 1 hora en un balancín orbital. Continuando, se decantó la solución de anticuerpos biotinilados secundarios de cabra contra conejo y se incubaron las membranas en una solución de lavado TTBS durante un total de tres lavados a 5 minutos por lavado. Las membranas se incubaron con una solución de complejo de fosfatasa alcalina biotinilada por estreptavidina (Bio-Rad, Hercules, CA) durante 1 hora en un eje de balancín orbital. Finalmente, se decantó la solución de complejo de fosfatasa alcalina biotinilada de estreptavidina y se lavaron las membranas tres veces con solución TTBS a 5 minutos por lavado en un agitador orbital. Se añadió una solución de desarrollo de color que contenía BCIP/NBT (Bio-Rad, Hercules, CA) y se supervisó el desarrollo de color durante 30 a 60 minutos. El desarrollo del color se detuvo incubando la membrana en H2O de doble destilación durante 10 minutos en un balancín orbital. Las membranas blotadas se digitalizaron mediante densitometría utilizando un sistema de imágenes Chemi-Doc XRS (Bio-Rad, Hercules, CA) y la densidad de banda se expresó en unidades de densidad integradas en relación con el peso muscular.
Análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron con el programa SPSS (versión 14.0, SPSS Inc., Chicago, IL). Las variables de sangre total, suero, rendimiento y composición corporal se analizaron mediante análisis de varianza (ANOVA) de 2 × 3 (grupo × sesión de prueba) con pruebas univariadas de medidas repetidas. Los niveles de proteínas del receptor MHC, FP y EP3 se analizaron utilizando ANOVA 2 × 2 (grupo × sesión de prueba) por separado con medidas repetidas. Además, en el caso de un efecto principal significativo para el grupo, se realizaron ANOVAs unidireccionales con medidas repetidas en sesiones de prueba para cada grupo para evaluar las diferencias entre las pruebas. Se utilizaron pruebas t independientes para analizar los cambios en la expresión del ARNm del CMH después de 50 días de suplementación. Además del análisis de puntuación bruta, se realizó un análisis de puntuación delta (es decir, valores del día 0 restados del día 25 y/o 50) para las variables que mostraron una variación extraña entre los grupos en el día 0. Como se mencionó con las puntuaciones brutas, se utilizó un análisis de varianza (ANOVA) de 2 × 3 (grupo × sesión de prueba) con pruebas univariadas de medidas repetidas para analizar las puntuaciones delta de la composición corporal, las variables de rendimiento y las concentraciones hormonales, mientras que se utilizó un ANOVA de medidas repetidas de 2 × 2 para analizar todas las puntuaciones delta intramusculares. En circunstancias en las que no se podían asumir variaciones iguales dentro de los grupos, se utilizó el factor de corrección de epsilon de Hunyhs-Feldt para ajustar la relación F dentro del grupo. En circunstancias en las que parecía haber tendencias estadísticas (p = 0,05 a 0).10), los tamaños de los efectos también se notificaron como Eta parcial al cuadrado (np2). Se determinó que los tamaños de efecto cuadrado Eta parcial eran débiles (np2 ≤ 0,01), medios (np2 = 0,06), fuertes = (np2 = 0,14) como se describió anteriormente . La significación para todos los análisis estadísticos se determinó utilizando un nivel alfa de 0,05. Cabe señalar que un análisis de potencia a priori del diseño indicó que un tamaño n de 15 participantes por tratamiento produciría una potencia alta (> 0,8) para los valores delta de la variable de criterio de 0,75 a 1,25. También debe tenerse en cuenta que el análisis de valores atípicos a posteriori, utilizando gráficos de cajas, se realizó en circunstancias en las que hubo interacciones significativas de grupo × tiempo para garantizar que no hubiera valores atípicos presentes. Todos los datos se notifican como medias ± desviaciones estándar (DE).