subiecți
treizeci și unu de bărbați sănătoși, instruiți în rezistență (22.1 5.0 ani, 180 0.1 cm, 86.1 13.0 kg, 18.1 6.4% grăsime corporală) au fost informați cu privire la Protocolul de studiu aprobat de Comitetul de evaluare instituțională la Universitatea Baylor înainte de participare. Statutul de formare a fost auto-raportat, iar persoanele care nu aveau cel puțin un an de experiență înainte de studiu au fost excluse. În plus, subiecții au fost excluși dacă: 1) au avut antecedente de boli metabolice, hipertensive, hepatorenale, musculo-scheletice, autoimune sau neurologice; 2) luau în prezent medicamente tiroidiene, antihiperlipidemice, hipoglicemice, antihipertensive sau androgenice; și 3) au luat suplimente nutritive care pot afecta masa musculară și/sau nivelurile de hormoni anabolici/catabolici în termen de trei luni de la începerea studiului.
testarea inițială
subiecții eligibili au fost familiarizați cu protocolul studiului printr-o explicație verbală și scrisă a proiectului studiului. Subiecții au semnat o declarație de consimțământ informat și au completat istoricul personal și medical, completând în același timp un test de capacitate anaerobă Wingate înainte de testarea inițială. Subiecții au fost instruiți să se abțină de la exerciții fizice intense timp de 48 de ore și să postească timp de 10 ore înainte de testarea inițială (adică ziua 0) care a avut loc la 3-4 zile după familiarizare pentru a permite înregistrarea aportului alimentar. Acest studiu a folosit un design de studiu dublu-orb, controlat cu placebo, paralel, prin care subiecții au fost potriviți uniform în grupuri în funcție de vârstă și masa corporală.
protocol Experimental
În zilele 0, 25 și 50 fiecare subiect raportat la laborator după un post de 10 ore. Înălțimea a fost măsurată cu ajutorul antropometriei standard, iar masa corporală totală a fost măsurată cu ajutorul unui cântar electronic calibrat de măsurare a tensiunii digitale (Bridgeview, IL) cu o precizie de 0,02 kg. Compoziția corpului a fost apoi determinată folosind un dispozitiv calibrat Hologic Discovery w dual-energy X-ray absorptiometer (DXA) (Hologic Inc., Bedford, MA), în timp ce tensiunea arterială și ritmul cardiac de repaus au fost determinate folosind proceduri standard. Subiecții au donat apoi aproximativ 25 ml de sânge De Post folosind tehnici standard de venipunctură pentru panouri hematologice, clinice de chimie și ulterior analiza citokinelor și hormonilor. Două tuburi vacutainer de separare serică de 10 ml și un tub vacutainer de 5 ml K3 EDTA au fost introduse în suportul vacutainer pentru recoltarea sângelui succesiv, utilizând tehnici multiple de flebotomie. Sângele integral a fost imediat analizat pentru o hemogramă completă în timp ce tuburile vacutainer serice au fost centrifugate la temperatura camerei timp de 15 min la 1.500 g, supernatantul seric a fost transferat în tuburi microcentrifuge, iar probele serice au fost depozitate la -20 centicc pentru analize hormonale și metabolite ulterioare. Numai în zilele 0 și 50, subiecții au donat aproximativ 60 mg de mușchi scheletici din vastus lateralis folosind tehnica biopsiei Bergstrom. Rezistența superioară și inferioară a corpului au fost evaluate folosind proceduri standard de testare 1RM cu o presă de banc și o mașină de sanie 35 de șold (Nebula, Versailles, OH). Test-retest fiabilitatea acestor teste de rezistență pe subiecți instruiți în rezistență în laboratorul nostru au dat o fiabilitate ridicată pentru presa de bancă (r = 0,94) și presa de picior (R = 0,91). După determinarea saniei de șold 1RM, subiecții s-au odihnit cu 10 minute înainte de a finaliza un test de capacitate anaerobă Wingate de 30 de secunde pe un ergometru computerizat cu ciclu (Lode Excalibur, Lode, Groningen, Olanda) pentru a evalua puterea anaerobă a corpului inferior. Acest test a constat în a avea fiecare subiect sprint într-un mod complet pe ergometrul bicicletei timp de 30 de secunde față de un volum de muncă standard de 0,075 kg·kg-1 din greutatea corporală. Fiabilitatea Test-retestare pentru puterea absolută de vârf și puterea medie în laboratorul nostru au dat, de asemenea, valori ridicate de fiabilitate (r = 0,69 și r = 0.95, respectiv, P< 0,05).
biopsii musculare percutanate
biopsiile musculare au fost luate în zilele 0 și 50 înainte de toate testele de rezistență pentru a evita potențialele perturbări miofibrilare datorate exercițiilor fizice . Subiecții au fost instruiți să se abțină de la exerciții fizice cu 48 de ore înainte de fiecare biopsie musculară. Mușchiul a fost extras din porțiunea laterală a vastus lateralis la jumătatea distanței dintre patella și creasta iliacă a piciorului dominant folosind un ac de biopsie de 5 mm cu aspirație aplicată . Pe scurt, 1,5 ml de 1.0% lidocaină HCl a fost injectat subcutanat înainte de a face o mică incizie pilot. Folosind proceduri de tăiere dublă și aspirație aplicată, specimenul a îndepărtat mai întâi toată grăsimea vizibilă și țesutul conjunctiv înainte de a fi înghețat flash în azot lichid. Toate probele au fost ulterior depozitate la -80 CTC până la analize ulterioare.
protocol de suplimentare și monitorizare dietetică
într-un mod dublu-orb, subiecții au ingerat patru capsule de 250 mg care conțineau un placebo de ulei de porumb sau AA (Factor X, nutriție moleculară, Jupiter, FL) peste 50 de zile după testarea inițială. Suplimentele au fost preparate sub formă de capsule și ambalate în sticle generice prin nutriție moleculară. Conformitatea a fost monitorizată prin faptul că subiecții au returnat sticlele goale de supliment după 25 și 50 de zile de suplimente. În conformitate cu ghidurile anterioare și în efortul de a se asigura că aportul de energie și proteine este adecvat pentru a facilita hipertrofia musculară, toți subiecții au fost instruiți să crească aportul caloric cu aproximativ 500 kcal·Ziua-1, menținând în același timp un aport estimat de proteine de 2 g·kg-1·Ziua-1 în comparație cu analiza dietetică inițială . Subiecților li s-a oferit o pulbere de înlocuire a mesei disponibilă în comerț (Lean Body, Labrada Nutrition, Houston, TX) care conține aproximativ 290 kilocalorii, 24 g de carbohidrați, 45 g de proteine și 1 g de grăsime pe porție, în încercarea de a satisface cerințele energetice și proteice menționate mai sus. În funcție de aportul inițial de proteine, subiecților li s-a spus să ingereze 1 până la 2 pachete de supliment de înlocuire a mesei dimineața și/sau imediat după fiecare antrenament . În plus, subiecții au fost instruiți să evite consumul regulat de alimente cunoscute a fi bogate în acizi grași 3-3, inclusiv ulei de pește, ulei de semințe de in, pește de apă rece, ulei de măsline, ulei de susan, unt de arahide, N-acetil-cisteină, acid linoleic conjugat, precum și medicamente antiinflamatorii, inclusiv acetaminofen, ibuprofen, aspirină și alte medicamente antiinflamatoare nesteroidiene . Aportul dietetic, precum și linoleic (18:2, x-6), linolenic (18:3, 3) și aportul AA au fost monitorizate cu rechemări dietetice de 4 zile în zilele 0, 25 și 50 și evaluate folosind software-ul nutrițional Food Processor III (ESHA Nutrition Research, Salem, OR).
protocol de antrenament de rezistență
pe o perioadă de 50 de zile, subiecții au finalizat un program de antrenament de rezistență cu periodizare liniară de 4 zile·săptămână-1. Ascensoarele superioare ale corpului au inclus presă pe bancă, tragere lat, presă pe umăr, rânduri așezate, umeri din umeri, muște în piept, bucle biceps și triceps apăsări, în timp ce ascensoarele inferioare ale corpului au inclus presă pentru picioare, extensie spate, urcări, bucle pentru picioare, extensie pentru picioare, ridicări ale călcâiului și abdomene abdominale de două ori pe săptămână. Subiecții au efectuat 3 seturi de 10 repetări cu o greutate cât mai mare pe set (adică 60-80% din 1RM). Perioadele de odihnă între exerciții nu au depășit 3 minute, în timp ce restul dintre seturi nu au depășit 2 minute. Instruirea a fost efectuată la Centrul de viață studențească al Universității, documentată în jurnalele de instruire și semnată de membrii personalului desemnat pentru a verifica conformitatea și a monitoriza progresul. Acest protocol a fost demonstrat în cercetările anterioare pentru a promova câștiguri semnificative în forța musculară, rezistența musculară și masa fără grăsimi .
analize serice și de sânge integral
probele serice și de sânge integral au fost utilizate pentru a evalua siguranța clinică în timpul protocoalelor de suplimentare. Serum samples were assayed for comprehensive metabolic panels including glucose, total protein, blood urea nitrogen (BUN), creatinine, BUN/creatinine ratio, uric acid, aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), creatine kinase (CK), lactate dehydrogenase (LDH), gamma-glutamyl transpeptidase (GGT), albumin, globulin, sodium, chloride, calcium, carbon dioxide, total bilirubin, alkaline phosphatase (ALP), triglycerides, cholesterol, HDL and LDL using a Dade Dimension XL clinical chemistry system (Dade Behring Inc., Newark, DE). Numărul total de celule sanguine, inclusiv numărul de celule roșii, hemoglobina, hematocritul, volumul mediu al celulelor, hemoglobina corpusculară medie, concentrația medie a hemoglobinei corpusculare, lățimea distribuției celulelor roșii, numărul de celule albe din sânge, neutrofilele, limfocitele, monocitele, eozinofilele și bazofilele au fost analizate prin citometrie în flux folosind Cell-DYN 1800 (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). Testul pentru a testa fiabilitatea (în interiorul și între) efectuării acestor teste a variat de la 2 la 6% pentru testele individuale cu un coeficient mediu de variație (C V ) de 3,0%. Probele au fost rulate în două exemplare pentru a verifica rezultatele dacă valorile observate au fost în afara valorilor de control și/sau a normelor clinice conform procedurilor standard.
probele de ser ulterioare au fost ulterior testate pentru cortizol (CORT), testosteron liber (fTEST), testosteron total (tTEST), interleukină-6 (IL-6), prostaglandină E2 (PGE2) și prostaglandină F2a (PGF2a). Testele imunoabsorbante ale enzimei comerciale au fost utilizate pentru a analiza concentrațiile serice ale PGF2a, PGE2 și IL-6 (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) și CORT, fTEST și tTEST (Diagnostic Systems Laboratories, Webster, TX). C V de efectuare a acestor teste bazate pe EIA a variat de la 3,0 la 5,0%.
izolarea totală a ARN-ului
ARN-ul celular total a fost extras din omogenatul probelor de biopsie cu o soluție monofazică de fenol și izotiocianat de guanidină conținută în TRI-reactiv (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Concentrațiile totale de ARN din fiecare probă au fost determinate spectrofotometric cu o densitate optică de 260 nm (OD260), cu concentrația finală ajustată la 200 ng·inqultl-1 prin diluarea extractelor totale brute de ARN în H2O fără nuclează tratat cu DEPC. S-a demonstrat că această procedură produce ARN nedegradat, fără ADN și proteine, așa cum este indicat de benzile ARN ribozomale proeminente 28S și 18S, precum și de un raport OD260/OD280 de aproximativ 2,0 . Probele de ARN au fost stocate la -80 int C până la analize ulterioare.
transcriere inversă și sinteză ADN clonală
soluțiile standardizate ale ARN celular total au fost transcrise invers pentru a sintetiza ADN clonal (ADNc) așa cum s-a descris anterior . Pe scurt, un amestec de reacție de transcripție inversă s-a incubat la 42 centi C timp de 40 minute, s-a încălzit la 85 centi C timp de 5 minute, apoi s-a răcit rapid pe gheață, obținându-se Produsul ADNc. Concentrațiile șablonului ADNc de pornire au fost standardizate la 200 ng·inqql-1 înainte de amplificarea reacției în lanț a polimerazei în timp real (RT-PCR) prin detectarea spectrofotometrică a produselor sintetizate de ADNc brute la o lungime de undă de 260 nm și diluarea lor în H2O fără nucleaze. soluțiile ADNc standardizate au fost înghețate la -80 CTC C până la efectuarea RT-PCR în timp real.
RT-PCR
perechile de primeri anti-sens și oligonucleotide de sens au fost construite folosind software-ul de proiectare a farurilor disponibil comercial (Bio-Rad, Hercules, CA) din secvențe cunoscute de ARNm publicate în baza de date nucleotidică GenBank și sintetizate comercial (Integrated ADN Technologies, Coralville, IA). Următorii primeri oligonucleotidici anti-sens 5′ și 3′ au fost utilizați pentru a izola cele trei izoforme MHC adulte (tip I, IIa și IIx): mRNA MHC de tip I (primer 5′: baze 776-796, primer 3′: baze 1398-1378, GenEMBL AC X06976), mRNA MHC de tip IIa (primer 5′: baze 1785-1805, 3 ‘grund: baze 2440-2420, GenEMBL AC AF111784), tip IIX MHC ARNm (5′ grund: baze 1138-1158, 3’ grund: baze 1746-1726, GenEMBL AC AF111785). Acești primeri amplifică fragmente de 141, 145 și, respectiv, 148 de perechi de baze pentru tipul I, IIA, IIX MHC. ca standard de referință extern pentru detectarea modificării relative a cantității de ARNm țintă , datorită considerării sale ca genă de menaj exprimată constitutiv, acești primeri de actină de la XV amplifică un fragment PCR de 135 de perechi de baze. Două sute de ng de ADNc au fost adăugate la fiecare dintre cele patru reacții PCR pentru MHC de tip I, -IIa, și-IIx, și actină de la XV. În mod specific, fiecare reacție PCR a conținut următoarele amestecuri: s-au adăugat 2 ect de șablon ADNc împreună cu 12,5 ect de 2 ect SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA) , 1,5 ect de primeri sense și anti-sense și 7,5 ect de nucleaze-free dH2O]. Fiecare reacție PCR a fost amplificată cu un cicler termic (Bio Rad, Hercules, CA), iar secvența de amplificare a implicat o etapă de denaturare la 95 ct timp de 30 secunde, recoacere grund la 55 ct timp de 30 secunde și extensie la 72 ct timp de 60 secunde . RT-PCR a fost efectuat pe parcursul a 40 de cicluri cu fluorescența emisă din fluoroforul verde SYBR fiind măsurată după fiecare ciclu. O emisie de fluorescență apare datorită integrării verde SYBR în ADNc dublu catenar produs în timpul reacției PCR. Toate valorile CT au fost evaluate în porțiunea liniară de amplificare și s-a efectuat o analiză a curbei de topire a ADN după amplificare pentru a se asigura că produșii genei unice au fost amplificați în absența primerilor-dimeri. Cuantificarea tuturor ARNm a fost exprimată în raport cu expresia de actină-actină. O comparație a raporturilor valorii CT a fost utilizată pentru a compara modificările expresiei genei bazale între grupurile AA și PLA. Electroforeza în gel de agaroză utilizând 25 de alicote de ecqql din amestecurile de reacție PCR finalizate a fost efectuată în 1.Geluri de agaroză 5% folosind 1 tampon tris-acid Boric-EDTA (TBE) și iluminate cu un transiluminator UV (Chemi-Doc XRS, Bio-Rad, Hercules, CA) pentru a verifica amplificarea pozitivă a ARNm țintă (datele nu sunt prezentate) . C V pentru MHC I, IIa și IIx au fost de 2,06%, 3,18% și, respectiv, 2,73%.
cantitatea totală de proteine musculare
proteina totală rămasă din procedura de izolare totală a ARN a fost izolată cu izopropanol, etanol și 0,3 M clorhidrat de guanidină. Proteina miofibrilară a fost izolată cu 0.1% dodecil sulfat de sodiu (SDS), înainte de a avea conținut de proteine determinat spectrofotometric folosind un test Bradford la o lungime de undă de 595 nm. O curbă standard a fost generată utilizând (r2 = 0,98, p< 0,001) albumină serică bovină ca standard și reprezentată în raport cu greutatea musculară umedă . Fiecare probă de proteine a fost ulterior diluată la 50 de hectolitri de proteine per 30 de centicli tampon SDS pentru imunoblotting ulterior. C V pentru proteina miofibrilară a fost de 2,03%.
cantitatea de izoformă a proteinei MHC
compoziția izoformelor proteinei MHC din fiecare probă de omogenat muscular a fost determinată prin SDS-PAGE automatizat folosind cipuri Experion Pro260 (Bio-Rad, Hercules, CA). Aproximativ 6 alicote de unqql din fiecare probă au fost pipetate în fiecare sondă de probă de pe microcip. Fiecare probă necunoscută a fost preparată din 4 ect. l din diluția proteică de la fiecare subiect (sau 4 ect.l din scara de greutate moleculară), 2 ect. l din proba tampon cu ect.-mercaptoetanol și 84 ect. l din apa deionizată. Pe baza constatărilor lui Gazith și ale colegilor , toate cele trei izoforme MHC erau de așteptat să migreze în regiunea de 200-210 kilodaultoni din gelul de poliacrilamidă în raport cu scara de greutate moleculară. Gelurile au fost vizualizate digital de software-ul Experion (Bio-Rad, Hercules, CA), iar concentrațiile MHC din fiecare probă au fost evaluate prin compararea densității arbitrare a fiecărei izoforme MHC cu densitățile arbitrare ale markerilor de greutate moleculară cu concentrații cunoscute. C V al benzilor proteice de la 10 kD au fost de la 1,1% la 1,1%.
immunoblotting proteic
cuantificarea receptorilor PGF2a (FP) și PGE2 (EP3) s-a efectuat la temperatura camerei prin extragerea proteinei musculare totale din omogenat și prin sugerea a 50 de kilograme de proteină totală în membrane de nitroceluloză utilizând un sistem bio-Dot protein blotting (Bio-Rad, Hercules, CA). Membranele șterse au fost incubate cu soluție de blocare timp de 1 oră pe un rocker orbital, decantate și membranele au fost incubate cu o soluție de spălare TTBS timp de 5 minute pentru un total de trei spălări. Membranele au fost incubate cu anticorpi policlonali specifici anti-receptor FP și anti-receptor EP3 (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI), diluați la 4 hectog·ml-1, timp de 1 până la 2 ore pe un rocker orbital. Soluțiile primare de anticorpi au fost apoi decantate și membranele spălate cu soluție TTBS timp de 5 minute pe un balansier orbital pentru un total de trei spălări. Soluția de spălare TTBS a fost decantată și membranele au fost incubate cu o soluție secundară de anticorpi anti-iepure de capră biotinilată (Bio-Rad, Hercules, CA) timp de 1 oră pe un rocker orbital. Continuând, soluția secundară de anticorpi anti-iepure biotinilați de capră a fost decantată și membranele incubate în soluție de spălare TTBS pentru un total de trei spălări la 5 minute pe spălare. Membranele au fost incubate cu o soluție complexă de fosfatază alcalină streptavidin-biotinilată (Bio-Rad, Hercules, CA) timp de 1 oră pe un rocker orbital. În cele din urmă, soluția complexă de fosfatază alcalină streptavidină-biotinilată a fost decantată și membranele spălate de trei ori cu soluție TTBS la 5 minute pe spălare pe un agitator orbital. S-a adăugat soluția de dezvoltare a culorii care conține BCIP/NBT (Bio – Rad, Hercules, CA) și dezvoltarea culorii a fost monitorizată pe parcursul a 30-60 de minute. Dezvoltarea culorii a fost oprită prin incubarea membranei în H2O dublu distilat timp de 10 minute pe un rocker orbital. Membranele șterse au fost digitalizate prin densitometrie folosind un sistem de imagistică Chemi-Doc XRS (Bio-Rad, Hercules, CA), iar densitatea benzii a fost exprimată în unități de densitate integrate în raport cu greutatea musculară.
analiza statistică
analizele statistice au fost efectuate folosind SPSS (versiunea 14.0, SPSS Inc., Chicago, IL). Variabilele de sânge integral, ser, performanță și compoziție corporală au fost analizate utilizând analiza varianței (ANOVA) 2-3 (sesiunea de testare a grupei de testare a grupei de testare a varianței) cu măsurători repetate teste univariate. Nivelurile proteinei MHC, FP și ep3 ale receptorilor au fost analizate utilizând ANOVA 2 2 (sesiune de testare a grupului XV) separate cu măsuri repetate. În plus, în cazul unui efect principal semnificativ pentru grup, s-au efectuat ANOVAs unidirecționale cu măsuri repetate asupra sesiunilor de testare pentru fiecare grup pentru a evalua orice diferențe între teste. Testele t independente au fost utilizate pentru a analiza modificările expresiei ARNm MHC după 50 de zile de suplimente. În plus față de analiza scorului brut, analiza scorului delta (adică valorile zilei 0 scăzute din ziua 25 și/sau 50) a fost efectuată pentru variabilele care au prezentat variații străine între grupuri în ziua 0. După cum s-a menționat în cazul scorurilor brute, a fost utilizată o analiză a varianței (ANOVA) de 2 XT3 (sesiune de testare a grupului XT) cu măsurători repetate teste univariate pentru a analiza scorurile delta pentru compoziția corporală, variabilele de performanță și concentrațiile hormonale, în timp ce a fost utilizată o analiză 2 XT3 a măsurătorilor repetate ANOVA pentru a analiza toate scorurile Delta intramusculare. În situațiile în care nu s-au putut presupune diferențe egale în cadrul grupurilor, factorul de corecție Hunyhs-Feldt epsilon a fost utilizat pentru a se ajusta în raporturile f ale grupului. În situațiile în care tendințele statistice păreau să existe (adică, P = 0,05 la 0.10), dimensiunile efectului au fost, de asemenea, raportate ca Eta parțială pătrată (np2). Dimensiunile parțiale ale efectului pătrat Eta au fost determinate a fi slabe (NP2 0,01), medii (NP2 = 0,06), puternice = (np2 = 0,14) așa cum s-a descris anterior . Semnificația pentru toate analizele statistice a fost determinată utilizând un nivel alfa de 0,05. Trebuie remarcat faptul că o analiză a puterii a priori a proiectului a indicat că o dimensiune n de 15 participanți pe tratament ar produce o putere mare (> 0,8) pentru valorile Delta variabile de criteriu de 0,75 până la 1,25. De asemenea, trebuie remarcat faptul că analiza outlier post-hoc folosind parcele cutie a fost efectuată în circumstanțe în care au existat interacțiuni semnificative în timp de grup pentru a se asigura că nu au existat valori aberante prezente. Toate datele sunt raportate ca mijloace de deviații standard (SD).