Materialien
Zellkultur
Menschliche Melanom-Mel-Z-, Mel-IL- und Mel-MTP-Zellen wurden aus dem Tumormaterial von Patienten erhalten, die sich einer Behandlung im Nationalen medizinischen Forschungszentrum von N.N. Blokhin in onkologie50. BJ-5ta Fibroblasten und Brustkrebs SK-BR-3 Zellen wurden von ATCC. Die anderen Zellen wurden freundlicherweise von Dr. E. Svirchevskaya und E. Kovalenko (Shemyakin – Ovchinnikov Institut für Bioorganische Chemie RAS, Moskau, Russland). Alle Zellen wurden in RPMI-1640-Wachstumsmedium gezüchtet, das mit 10% FBS, 2 Μ-L-Glutamin, 100 µg / ml Streptomycin und 100 U / ml Penicillin bei 37 ° C in einer mit 5% CO2 befeuchteten Atmosphäre ergänzt wurde. Das Medium wurde alle 3-4 Tage ausgetauscht. Der Melaningehalt wurde durch Messung des Absorptionsspektrums in DMSO-Zelllysaten (106 Zellen pro ml) unter Verwendung eines UV-Vis-Spektralphotometers Cary 50 geschätzt.
Durchflusszytometrie
Die Zellen wurden mit Versenlösung geerntet, durch Zentrifugation bei 300 g für 5 min pelletiert und in RPMI-1640-Medien ohne Serum auf die Endkonzentration von 106 Zellen pro ml resuspendiert. Anschließend wurden 100 µl der Zellsuspension in die lichtgeschützten Röhrchen zur Durchflusszytometrie überführt. Entsprechende Arbeitslösungen von FMN in RPMI-1640-Medium wurden unmittelbar vor den Experimenten hergestellt. Diese FMN-Lösungen wurden in die Röhrchen gegeben, und die endgültige FMN-Konzentration betrug 10 µM, 30 µM und 100 µM. Anschließend wurden die Zellen im Dunkeln in einem CO2-Inkubator für 30 Minuten inkubiert. Am Ende der Inkubation wurde in jedes Röhrchen 1 ml kaltes PBS gegeben und die Zellen 5 min zentrifugiert (300 g, 4°C). Der Überstand wurde entfernt und die Zellen in 300 µl kaltem PBS resuspendiert und auf Eis überführt. Die Fluoreszenz wurde mit einem Durchflusszytometer NovoCyte 2000R (ACEA Biosciences) und der Software NovoExpress v.1.2.4 untersucht. Die Fluoreszenz wurde auf einem Kanal gemessen, der der FITC-Fluoreszenz entsprach, und für jede Probe wurden mindestens 10.000 Ereignisse untersucht. Um das Akkumulationsniveau von FMN in den Zellen abzuschätzen, wurden die mittleren Fluoreszenzwerte in jeder Probe bestimmt, und dann wurde das relative Fluoreszenzniveau (F) gemäß der folgenden Formel berechnet:
Konfokale Mikroskopie
Die Zellen wurden in 96-Well-Platten (5 × 103 Zellen pro Well) ausgesät, gefolgt von einer Inkubation über Nacht. Dann wurden 100 µL geeigneter Arbeitslösungen von FMN (10 µM, 30 µM und 100 µM) in RPMI-1640-Medium zu den Zellen gegeben und die Platte wurde im Dunkeln in einem CO2-Inkubator für 30 Minuten inkubiert. Danach wurden die Zellen 3 mal mit kaltem PBS gewaschen und zusätzlich 15 min mit Hoechst 33258 Farbstoff (50 µM) gefärbt. Optische Bilder und Fluoreszenzintensitätsdaten wurden mit dem InCell Analyzer 6000 und in der Cell Analyzer Workstation Software v.3.7.3 (GE Healthcare, USA) erfasst.
Zytotoxizitätsstudien
Die Zellen wurden in einer 96-Well-Platte (5 × 103 Zellen pro Well) ausgesät, gefolgt von einer Inkubation über Nacht. Geeignete Arbeitslösungen von FMN in vollem RPMI-1640-Medium wurden unmittelbar vor den Experimenten hergestellt. Dann wurde das Medium von der 96-Well-Platte entfernt und FMN-Lösungsaliquots (100 µl) wurden in jede Vertiefung gegeben. Zur Induktion der FMN-Photoaktivierung wurden die Platten mit Licht bei 450 nm, Bestrahlungsdosis 0,2 J/cm2–7 J/cm2 behandelt. Zellen ohne Behandlung wurden als Kontrollen verwendet (100%). Die Zellviabilität wurde durch MTT-Assay nach 48 h Inkubation bestimmt. Dazu wurden Zellen 3 h lang mit MTT-Lösung (0,5 mg/ml in RPMI-1640) behandelt. Anschließend wurde das Medium durch 100 µl DMSO ersetzt, um gebildete Formazan-Kristalle aufzulösen. Die optische Dichte (OD) bei 570 nm wurde mit dem Varioskan Flash Reader (Thermo Scientific, USA) gemessen. Die Lebensfähigkeit von Zellen (V) nach FMN-Behandlung wurde im Vergleich zur Kontrolle gemäß folgender Gleichung in % ausgedrückt:
Um die Zytotoxizität von FMN-Photoprodukten zu bestimmen, wurden geeignete Arbeitslösungen von FMN in vollem RPMI-1640-Medium bei 450 nm (5 J / cm2) bestrahlt und über Nacht inkubiert. Anschließend wurden diese FMN-Aliquots (100 µl) zu den Zellen gegeben und 48 h inkubiert. Der MTT-Assay wurde wie oben beschrieben durchgeführt.
Um die ROS-vermittelte Phototoxizität zu bestimmen, wurden FMN-Lösungsaliquots (100 µl) in jede Vertiefung gegeben und mit Licht bei 450 nm (5 J/ cm2) behandelt. FMN-haltige Medien wurden unmittelbar nach der Behandlung entfernt und die Zellen wurden in frischen RPMI-1640-Medien für 48 h inkubiert.
Apoptose- und Nekrose-Assay
Die Zellen wurden in 96-Well-Platten (5 × 103 Zellen pro Well) ausgesät, gefolgt von einer Inkubation über Nacht. Dann wurden 100 µL geeigneter Arbeitslösungen von FMN (10 µM, 30 µM und 100 µM) in RPMI-1640-Medium zu den Zellen gegeben und die Platte wurde im Dunkeln in einem CO2-Inkubator für 30 Minuten inkubiert. Danach wurden Zellen mit einem 450 nm Laser in einer Dosis von 5 J/cm 2 bestrahlt. Anschließend wurden die Zellen konsequent mit kaltem PBS und Bindungspuffer gewaschen und mit Annexin V-FITC, Propidiumiodid (PI) und Hoechst 33258 bei Raumtemperatur in Bindungspuffer für 15 min gefärbt. Optische Bilder und Fluoreszenzintensitätsdaten wurden mit dem InCell Analyzer 6000 und in der Cell Analyzer Workstation Software v.3.7.3 (GE Healthcare, USA) erfasst.
Elektrodenherstellung
Die Kohlenstoff-Nanoelektroden wurden in einer 0,1 M NaOH, 10 mm KCl-Lösung während 30-40 Zyklen für jeweils 10 Sekunden geätzt, um einen Hohlraum in der Kohlenstoffoberfläche zu erzeugen. Das angelegte Potential war V-förmig mit einer Amplitude von 1,5–2 V. Die Platinabscheidung wurde durchgeführt, indem das Potential von 0 auf -1500 mV vs Ag / AgCl in einer Lösung, die 2 mM Chloroplatinsäure (H2PtCl6, Sigma) enthielt, geschwenkt wurde. Die cyclischen Voltammogramme in 1 mM Ferrocenmethanol (FcMeOH, Sigma) wurden für die anfängliche Kohlenstoffelektrode, für die Elektrode mit Nanokavitäten und mit Platin zur Steuerung des Produktionsprozesses erhalten. Die Absetzung von Pint erhöhte nur etwas die effektive geometrische Fläche der nanoelectrode (wie durch das voltammogram für die Oxidation von 1 Millimeter FcMeOH gezeigt), aber erhöhte drastisch seine katalytische Tätigkeit in Richtung zur ROS-Reduzierung. Die Nanoelektrode wurde bei 600 mV vs Ag/AgCl (für den diffusionslimitierten Nachweis von H2O2) polarisiert und manuell an die Flüssigkeit oder die Oberfläche der einzelnen Krebszelle angefahren. Für die Kalibrierung verwendeten wir Lösungen mit unterschiedlicher Konzentration von H2O2 (Sigma) im Bereich von 10-7-10-4 M.
ROS-Messung mit elektrochemischer Sonde
Die Ergebnisse wurden wie zuvor beschrieben erhalten47 mit einigen Änderungen. Somit ist die Hauptmodifikation der in dieser Arbeit verwendeten Elektroden die bessere Haftung von Platin an der Kohlenstoffelektrode aufgrund des Ätzens eines Hohlraums in der Kohlenstoffschicht vor der Pt-Abscheidung. Kommerziell erhältliche scheibenförmige, in Quarz isolierte Kohlenstoff-Nanoelektroden (ICAPPIC Limited, UK) mit einem Durchmesser von 100-500 nm wurden zur Herstellung von Sensoren zur ROS-Detektion verwendet. Die relativ inerte Kohlenstoffoberfläche der Elektrode wurde für den Nachweis redoxaktiver Spezies weiter funktionalisiert. Eine galvanisch abgeschiedene Platinschicht verstärkt die elektrokatalytische Aktivität, indem sie das durch die Reduktion reaktiver Sauerstoffspezies erzeugte Überpotential drastisch reduziert. Um die Haftung des Platins am Kohlenstoffstopfen zu verbessern, haben wir eine Nanokavität in die Kohlenstoffelektrode geätzt. Wir haben eine elektrochemische Methode verwendet, um winzige Kerben in den Spitzen von Kohlenstoff-Nanoelektroden zu erzeugen51. Die Herstellung von Platin-Nanosensoren erfolgte in zwei Stufen: Ätzen in alkalischer Lösung und Platinisierung. Alle Stufen wurden durch elektrochemische Messungen präzise gesteuert. Wir glauben, dass die Nanoelektrode sowohl für kurzlebige als auch für langlebige ROS-Formen empfindlich ist. Kürzlich haben wir gezeigt, dass die Singulett-Sauerstoffproduktion in wässriger Lösung von Flavinmononukleotid (FMN) durch Blaulichtbestrahlung induziert wird. Basierend auf diesem Ergebnis zeigen wir (Ergänzende Daten 9) Reaktion von Kohlenstoff-Nanoelektrode polarisiert bei + 800 mV vs Ag / AgCl auf ROS-Produktion in wässriger Lösung von FMN unter Blaulichtbestrahlung.
Die Zellen wurden in einer Petrischale ausgesät, gefolgt von einer Inkubation über Nacht. Anschließend wurden die Zellen 30 min mit 100 µM FMN in Dunkelheit inkubiert und 3 mal mit PBS gewaschen. Dann wurde die platinierte Nanoelektrode sorgfältig eingeführt, indem man den genauen Mikromanipulator in die einzelne Zelle unter optischer Kontrolle mit umgekehrtem Mikroskop verwendete. Für die Elektrodenmanipulation und -einstellung verwendeten wir den Mikromanipulator PatchStar (Scientifica, UK). Wir sammelten eine zyklische voltammetrische Daten mit Patch-Clamp-Verstärker Modell 2400 (A-M Systems, USA). Die Aufzeichnung des Signals wurde mit dem multifunktionalen E / A-Gerät USB-6211 (National Instruments, USA) und dem Computerprogramm WinWCP durchgeführt. Alle Messungen wurden auf dem Tisch des invertierten Mikroskops Nikon (Japan) durchgeführt. Bei allen Messungen wurde eine Ag/AgCl-Elektrode als Referenzelektrode verwendet.
ROS-Messung mit Fluoreszenzsonde
Die Auswertung des zytoplasmatischen ROS erfolgte mit CellROX Deep Red fluorescent probe (Molecular Probes/Thermo). Kurz gesagt, Mel IL- und M-3-Melanomzellen (5 × 103) wurden in 96-Well-Platten (Nunc, Dänemark) ausgesät und mit 2,5 µM CellROX Deep Red in vollen RPMI-1640-Medien für 30 min inkubiert und dreimal in PBS gewaschen. Dann wurden 100 µL geeigneter Arbeitslösungen (10 µM, 30 µM und 100 µM) von FMN in RPMI-1640-Medium ohne Phenolrot zu den Zellen gegeben und die Platte wurde im Dunkeln in einem CO2-Inkubator für 30 Minuten inkubiert. Danach wurden Zellen mit einem 450 nm Laser in einer Dosis von 5 J/cm 2 bestrahlt. Zellkerne wurden zusätzlich mit 50 µM Hoechst 33258 Farbstofflösung für 15 min angefärbt. Optische Bilder und CellROX Deep Red Fluoreszenz Intensitätsdaten von Mel IL und A375 Melanomzellen wurden mit InCell Analyzer 6000 und in Cell Analyzer Workstation Software v.3.7.3 (GE Healthcare, USA) aufgenommen.
Melaningehaltsbestimmung
Wir verwenden Routine-Assay für Spektrophotometrie Melaninbestimmung mit geringfügigen Veränderungen52. Vier Melanomzelllinien: Mel MTP, Mel IL, Mel Z, A375 und zwei normale (humane Keratinozyten HaCaT und humane Hautfibroblasten BJ-5ta) Zelllinien wurden gezählt und pelletiert, um eine Endkonzentration von 2 × 106 Zellen / ml zu erhalten. Zur Bestimmung des intrazellulären Melaningehalts wurden Zellpellets in 1 M NaOH mit 10% (v/v) DMSO gelöst und 1 h bei 80°C inkubiert. Nach Inkubation wurden die Lysate zentrifugiert (3000 g für 5 min) und die Extinktion in zellfreien Medien bei 405 nm gemessen. Alle Ergebnisse werden als Mittelwert der Absorptionsintensitäten ausgedrückt, die auf den Melaningehalt in Fibroblasten ± Standardabweichung (SD) von drei unabhängigen Experimenten normalisiert sind. Die statistische Auswertung erfolgte mit GraphPad Prism Version 5.0 (GraphPad Software, La Jolla California USA).
Tierversuche
Therapie von Primärtumoren
Männliche Balb / c nu / nu–Mäuse im Alter von 6-7 Wochen wurden von der Animal Farm des Shemyakin-Ovchinnikov-Instituts für Bioorganische Chemie, Russische Akademie der Wissenschaften, gekauft und unter kontrollierten Umweltbedingungen in einem belüfteten Tierkabinett A-Box 80 (Noroit, Frankreich) bei einem 12-Stunden-Dunkel-Licht-Zyklus untergebracht und ermöglichten den freien Zugang zu sterilem Wasser und SPF-Mausfutter. Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den europäischen und russischen nationalen Richtlinien für Tierversuche durchgeführt und vom Tier- und Ethikprüfungsausschuss des FSBSI „N.N. Blokhin NMRCO“, Referenznummer 2017-034, genehmigt.
Zur Etablierung eines Xenograft-Mausmodells wurden Mel IL- und A375-Zellen mit Versenlösung geerntet, durch Zentrifugation bei 300 g für 5 min pelletiert und in RPMI-1640-Medien ohne Serum resuspendiert. Melanomzellsuspension wurde gemischt (1:1 Volumen) mit Matrigel (BD Biosciences), und die erhaltene Zellsuspension (2 × 106 Zellen pro Injektion) wurde subkutan in die rechte Flanke der Mäuse implantiert, um eine erfolgreiche Tumorinitiierung und Tumorwachstumsmessungen sicherzustellen.
Die Verabreichung von FMN begann am Tag 10 nach der Inokulation, als die Tumorgröße 100-120 mm3 erreichte. FMN-Lösung (150 µl, 10 µg / ml) wurde den Mäusen intravenös durch einen retroorbitalen Sinus injiziert, und die Tumore wurden mit Blaulicht bei 450 nm für 15 min bis zur Enddosis von 20 J / cm2 bestrahlt.
Das Tumorvolumen wurde nach der Standardmethode der Kalipation geschätzt und nach der folgenden Formel berechnet, wobei eine Halbellipsoidform angenommen wurde:
Die Antitumoraktivität von photoaktiviertem FMN wurde bestimmt, indem die Tumorwachstumshemmungsrate (TGI%) berechnet wurde als:
Photodynamische Therapie von entfernten Tumoren
Wir verwendeten C57BL / 6–Mäuse im Alter von 6-7 Wochen, die von der Tierfarm des Shemyakin-Ovchinnikov-Instituts für Bioorganische Chemie der Russischen Akademie der Wissenschaften gekauft wurden. Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den europäischen und russischen nationalen Richtlinien für Tierversuche durchgeführt und vom Tier- und Ethikprüfungsausschuss des FSBI „N.N. Blokhin NMRCO“, Referenznummer 2017-034.
B16-F10-Mausmelanomzellen wurden mit Versenlösung geerntet, durch Zentrifugation bei 300 g für 5 min pelletiert und in RPMI-1640-Medien ohne Serum resuspendiert. Melanomzellsuspension wurde gemischt (1:1 Volumen) mit Matrigel (BD Biosciences), und die erhaltene Zellsuspension (5 × 105 Zellen pro Injektion) wurde subkutan in die rechte und linke Flanke der Mäuse implantiert, um eine erfolgreiche Tumorinitiierung und Tumorwachstumsmessungen sicherzustellen.Die Verabreichung von FMN begann am Tag 4 nach der Inokulation, als die Tumorgröße 60 ± 16 mm3 erreichte. FMN-Lösung (150 µl, 10 mg / ml) wurde den Mäusen intravenös durch einen retroorbitalen Sinus injiziert, und die Tumoren wurden 15 min lang mit Blaulicht bei 450 nm bis zur endgültigen Dosis von 20 J / cm2 bestrahlt. Es wurden zwei Kontrollgruppen verwendet: FMN-Injektion ohne Lichtbestrahlung; Laserbestrahlung ohne FMN-Injektion. Das Tumorvolumen und die Antitumoraktivität von photoaktiviertem FMN wurden wie oben beschrieben geschätzt.
Hämatoxylin- und Eosinfärbung
Tiere wurden 24 Stunden nach der PDT durch zervikale Dislokation geopfert. Alle geernteten Tumore wurden mit 4% Paraformaldehyd für 24 h fixiert und anschließend mit Paraffin eingebettet. Gewebeschnitte (4 µm dick) wurden mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt.
Statistische Analyse
Alle Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt, sofern nicht anders angegeben, und jedes Experiment wurde unabhängig voneinander dreimal wiederholt. Die Daten werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt. Unterschiede wurden als statistisch signifikant angesehen, wenn die P-Werte kleiner als 0,05 waren. Alle statistischen Analysen wurden mit GraphPad Prism Software (GraphPad Software, La Jolla, San Diego, CA, USA) durchgeführt.