Témata
Třicet-jedno zdravé, odpor vycvičení muži (22.1 ± 5.0 let, 180 ± 0,1 cm, 86.1 ± 13.0 kg, 18.1 ± 6.4% tělesného tuku) byly informovány o protokolu studie schválené Institucionální Review Board na Baylor University před účastí. Status školení byl hlášen sám, a jednotlivci, kteří před studiem postrádali alespoň jeden rok zkušeností, byli vyloučeni. Kromě toho, že předměty byly vyloučeny, pokud: 1) měl v minulosti metabolismu, hypertenze, hepatorenální, pohybového aparátu, autoimunitní, nebo neurologické onemocnění; 2) v současné době štítné žlázy, antihyperlipidemic, hypoglykemické, anti-hypertenzní, nebo androgenní léky; a 3) měl brát výživové doplňky, které mohou ovlivnit svalové hmoty a/nebo anabolické/katabolický hormon úrovně do tří měsíců od zahájení studie.
základní testování
způsobilé subjekty byly seznámeny s protokolem studie prostřednictvím ústního a písemného vysvětlení návrhu studie. Subjekty podepsali informovaný souhlas prohlášení a vyplněný osobní a zdravotní anamnézy a zároveň absolvování Wingate anaerobní test kapacity před základní testování. Subjekty byly instruovány, aby se zdržely namáhavého cvičení po dobu 48 hodin a rychle po dobu 10 hodin před základním testováním (tj. Tato studie zaměstnán dvojitě slepé, placebem kontrolovaná, paralelní studie, kdy pacienti byli rovnoměrně uzavřeno do skupin podle věku a tělesné hmotnosti.
Experimentální protokol
ve dnech 0, 25 a 50 každý předmět uvádí do laboratoře po 10-hodinové rychle. Výška byla měřena pomocí standardní antropometrie a celková tělesná hmotnost byla měřena pomocí kalibrovaného Healthometer digitální tenzometr elektronické stupnice (Bridgeview, IL) s přesností ± 0,02 kg. Složení těla bylo poté stanoveno pomocí kalibrovaného zařízení pro rentgenový absorpciometr Hologic Discovery W s duální energií (DXA) (Holog Inc., Bedford, MA), zatímco krevní tlak a klidová srdeční frekvence byly stanoveny standardními postupy. Předměty pak daroval přibližně 25 ml krve nalačno pomocí standardní techniky napíchnutí žíly pro hematologické, klinické chemie panely a později cytokiny a hormonální analýzu. Dvě 10 ml séra separační vacutainer zkumavky a jeden 5 ml K3 EDTA vacutainer zkumavky byly vloženy do držáku vacutainer pro odběr krve postupně za použití více vzorků flebotomie techniky. Plná krev byla ihned analyzována pro kompletní krevní obraz, zatímco sérum vacutainer trubky byly odstředěny při pokojové teplotě po dobu 15 min při 1500 g, sérum, supernatant byl převeden do mikrocentrifugační zkumavky a vzorky séra byly skladovány při -20°C pro následné hormonální a metabolit analýzy. Ve dnech 0 a 50 jen, předměty daroval přibližně 60 mg kosterního svalu z vastus lateralis pomocí Bergstrom biopsie technika. Síla horní a dolní části těla byla hodnocena pomocí standardních 1RM zkušebních postupů s bench press a 35° hip sáňkařským strojem (Nebula, Versailles, OH). Test-retest spolehlivost těchto zkoušek pevnosti na odpor vyškolených subjektů v naší laboratoři přinesly vysokou spolehlivost pro bench press (r = 0.94) a leg press (r = 0.91). Po stanovení hip sáně 1RM, předmětů spočívala 10 minut před dokončením 30 sekund, Wingate anaerobní test kapacity na počítačové cyklu ergometru (Lode Excalibur, Lode, Groningen, Nizozemsko) posoudit dolní části těla anaerobní výkon. Tento test spočíval v tom, že každý předmět sprintu v all Out módu na ergometru kola po dobu 30 sekund proti standardní pracovní zátěži 0, 075 kg * kg-1 tělesné hmotnosti. Spolehlivost testu-opakovaný test absolutního špičkového výkonu a průměrného výkonu v naší laboratoři také přinesl vysoké hodnoty spolehlivosti (r = 0,69 a r = 0.95, respektive P < 0.05).
Perkutánní svalové biopsie
Svalové biopsie byla přijata v den 0 a 50 před všechny síly, testování, aby se zabránilo potenciální myofibrilárního narušení v důsledku cvičení . Subjekty byly instruovány, aby se zdržely cvičení 48 hodin před každou svalovou biopsií. Sval byl extrahován z laterální části vastus lateralis uprostřed mezi čéškou a iliakálním hřebenem dominantní nohy pomocí 5 mm bioptické jehly s aplikovaným odsáváním . Stručně, 1,5 ml 1.0% lidokain HCl byl injikován subkutánně před provedením malého pilotního řezu. Pomocí double-chop postupy a aplikuje sání, první exemplář měl všechny viditelného tuku a pojivové tkáně odstraněny před flash zmrazené v tekutém dusíku. Všechny vzorky byly následně skladovány při -80°C až do pozdějších analýz.
Doplnění protokolu a dietní monitorování
double-blind módy, předměty požití čtyři 250 mg tobolky obsahující kukuřičný olej placebo nebo AA (X-Faktor, Molekulární Výživy, Jupiter, FL) více než 50 dnů po základní testování. Doplňky byly připraveny ve formě tobolek a baleny do generických lahví molekulární výživou. Dodržování bylo sledováno tím, že subjekty vrátily prázdné doplňkové lahve po 25 a 50 dnech suplementace. V souladu s předchozími pokyny a ve snaze zajistit příjem energie a bílkovin byly dostatečné k usnadnění svalové hypertrofie, všechny předměty byly nařídil zvýšit kalorický příjem přibližně o 500 kcal·den-1 a zároveň zachování odhadovaný příjem bílkovin 2 g·kg-1·den-1, když ve srovnání s výchozí úrovní dietní analýzy . Předměty byly poskytovány komerčně-k dispozici jídlo, náhradní prášek (Štíhlé Tělo, Labrada Nutrition, Houston, TX) obsahující přibližně 290 kcal, 24 g sacharidů, 45 g bílkovin a 1 g tuku na porci ve snaze vyhovět výše uvedené energie a požadavky na bílkoviny. V závislosti na výchozím příjmu bílkovin bylo subjektům řečeno, aby požili 1 až 2 balíčky doplňku stravy ráno a / nebo bezprostředně po každém tréninku . Navíc, pacienti byli poučeni, aby se zabránilo pravidelné konzumaci potravin známo, že být vysoký obsah ω-3 mastných kyselin, včetně rybí olej, lněný olej, studené vody, ryby, olivový olej, sezamový olej, arašídové máslo, N-acetyl-cystein, konjugovaná kyselina linolová, stejně jako anti-pobuřující léky, včetně paracetamol, ibuprofen, aspirin a další nesteroidní protizánětlivé léky . Dietní příjem, stejně jako linoleová (18: 2, ω-6), linolenová (18:3, ω-3), a AA příjem byly sledovány 4-denní dietní připomíná ve dnech 0, 25 a 50 a vyhodnocena pomocí Potravin Procesor III Výživa Software (ESA Výživa Výzkum, Salem, NEBO).
Odpor školení protokol
Více než 50-ti denní období, předměty úspěšně absolvováno, 4 den·týden-1 split-tělo, lineární periodizace odpor-vzdělávací program. Horní část těla výtahy zahrnuty bench press, lat pull, ramenní tisku, sedící řádky, ramenní pokrčením ramen, hrudi mouchy, biceps kadeře, triceps press-downs, zatímco spodní část těla výtahy zahrnuty leg press, zadní rozšíření, step ups, zakopávání, předkopávání, výpony, a břišní drtí dvakrát za týden. Subjekty provedly 3 sady po 10 opakováních s takovou hmotností, jakou by mohly zvednout na sadu (tj. Doba odpočinku mezi cvičeními nepřesáhla 3 minuty, zatímco zbytek mezi sadami nepřesáhl 2 minuty. Výcvik byl prováděn na univerzitě je studentský život centru, dokumentované v tréninkové záznamy, a podepsal určený zaměstnanci k ověření souladu a sledovat pokrok. Tento protokol byl prokázán v předchozím výzkumu, který podporuje významné zvýšení svalové síly, svalové vytrvalosti a hmotnosti bez tuku .
analýzy séra a plné krve
vzorky séra a plné krve byly použity k vyhodnocení klinické bezpečnosti během suplementačních protokolů. Serum samples were assayed for comprehensive metabolic panels including glucose, total protein, blood urea nitrogen (BUN), creatinine, BUN/creatinine ratio, uric acid, aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), creatine kinase (CK), lactate dehydrogenase (LDH), gamma-glutamyl transpeptidase (GGT), albumin, globulin, sodium, chloride, calcium, carbon dioxide, total bilirubin, alkaline phosphatase (ALP), triglycerides, cholesterol, HDL and LDL using a Dade Dimension XL clinical chemistry system (Dade Behring Inc., Newark, DE). Kompletní krevních buněk, včetně červených krvinek, hemoglobin, hematokrit, střední objem buněk, střední korpuskulární hemoglobin zlý korpuskulární koncentrace hemoglobinu, červených krvinek rozdělení šířky, počty bílých krvinek, neutrofilů, lymfocytů, monocytů, eosinofilů a bazofilů byly analyzovány pomocí průtokové cytometrie za použití Cell-DYN 1800 (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). Test pro testování spolehlivosti (v rámci a mezi) provádění těchto testů se pohyboval od 2 do 6% pro jednotlivé testy s průměrným variačním koeficientem (C V ) 3,0%. Vzorky byly provozovány ve dvou vyhotoveních ověřit výsledky, pokud pozorované hodnoty byly mimo kontrolu hodnoty a/nebo klinické normy, podle standardních postupů.
Následující vzorky séra byly později testovány pro kortizol (CORT), volného testosteronu (fTEST), celkového testosteronu (tTEST), interleukin-6 (IL-6), prostaglandinu E2 (PGE2) a prostaglandinu F2a (PGF2a). Komerční enzym immunoabsorbent testy byly použity k analýze sérových koncentrací PGF2a, PGE2, IL-6 (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) a CORT, fTEST, a tTEST (Diagnostic Systems Laboratories, Webster, TX). CV provádění těchto testů založených na EIA se pohybovala od 3,0 do 5,0%.
Total RNA isolation
Celková buněčná RNA byla extrahována z homogenátu z biopsie vzorků s monofázický roztok fenolu a guanidine isothiokyanátem obsažené v TRI-reagent (Sigma Chemical Co. St .Louis, MO). Celková koncentrace RNA z každého vzorku byly stanoveny spektrofotometricky s optickou hustotu 260 nm (OD260), s konečnou koncentraci upraví na 200 ng·µl-1 zředěním surové celkové RNA výtažky do DEPC-treated nuclease-free H2O. Tento postup bylo prokázáno, že výnos un-degradované RNA, bez DNA a bílkovin, jak je uvedeno významných 28S a 18S ribozomální RNA kapely, stejně jako OD260/OD280 poměr přibližně 2.0 . Vzorky RNA byly skladovány při -80°C až do pozdějších analýz.
Reverzní transkripce a klonální syntézu DNA
standardizované řešení celkové buněčné RNA byla přepsána reverzní syntetizovat klonální DNA (cDNA), jak je popsáno dříve . Stručně řečeno, reverzní transkripce reakční směsi byly inkubovány při 42°C po dobu 40 minut, zahřeje na 85°C po dobu 5 minut, a pak se rychle ochladí na ledu získávání cDNA produktu. Začíná cDNA templátu koncentrace byly standardizovány do 200 ng·µl-1 před real-time polymerázové řetězové reakce (RT-PCR) amplifikace detekce surové cDNA syntetizované produkty spektrofotometricky při vlnové délce 260 nm a zředěním je v nuclease-free H2O. Standardizované cDNA řešení byly zmrazeny na -80°C až do real-time RT-PCR byla provedena.
RT-PCR
Anti-smysl a smysl oligonukleotidových primer párů, které byly konstruovány s použitím komerčně dostupné Beacon Designer software (Bio-Rad, Hercules, CA) od známých mRNA sekvence publikované v GenBank nukleotidové databáze a komerčně syntetizované (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). Následujících 5′ smysl a 3′ anti-sense oligonukleotidových primerů byly použity k izolaci tři dospělé izoformy MHC (Typ I, IIa, IIx): Typ I MHC mRNA (5′ primer: základy 776-796, 3′ primer: základy 1398-1378, GenEMBL AC X06976), Typ IIa MHC mRNA (5′ primer: základy 1785-1805, 3′ primer: základy 2440-2420, GenEMBL AC AF111784), Typ IIx MHC mRNA (5′ primer: základy 1138-1158, 3′ primer: základy 1746-1726, GenEMBL AC AF111785). Tyto primery zesilují fragmenty 141, 145 a 148 párů bází pro typ I, IIa, IIx MHC. β-aktin byl použit jako externí referenční standard pro detekci relativní změny v množství cílových mRNA vzhledem k jeho projednání jako konstitutivně exprimovaných housekeeping genu , Tyto β-aktin primery amplifikují PCR fragment 135 párů bází. Dvě stě ng cDNA bylo přidáno ke každé ze čtyř PCR reakcí pro MHC typu I, -IIa a-IIx a β-aktin. Konkrétně, každá PCR reakce obsahuje následující směsi: 2 µl cDNA templátu byl přidán spolu s 12.5 µl 2× SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA) , 1.5 µl sense a anti-sense primery a 7,5 µl nuclease-free dH2O]. Každá PCR reakce byl zesílen s thermal cycler (Bio-Rad, Hercules, CA) a amplifikace sekvence podílí krok denaturace při 95°C po dobu 30 sekund, penetrace žíhání při teplotě 55°C po dobu 30 sekund, a extenze při 72°C po dobu 60 sekund . RT-PCR byla provedena po 40 cyklech s měřením emitované fluorescence ze SYBR zeleného fluoroforu po každém cyklu. K emisi fluorescence dochází v důsledku integrace SYBR zeleně do dvouvláknové cDNA produkované během PCR reakce. Všechny hodnoty CT byly hodnoceny v lineární části amplifikace a po amplifikaci byla provedena analýza křivky tání DNA, aby se zajistilo, že produkty jednoho genu byly amplifikovány bez primerových dimerů. Kvantifikace všech mRNA byla vyjádřena ve vztahu k expresi β-aktinu. Srovnání hodnotových poměrů CT bylo použito k porovnání změn v bazální genové expresi mezi skupinami AA a PLA. Elektroforéza agarózového gelu za použití 25 µl alikvotů finalizovaných reakčních směsí PCR byla provedena v 1.5% agarózového gelu pomocí 1× Tris-kyselina Boritá-EDTA (TBE) pufru a osvětlené s UV transilluminator (Chemicko-Doc XRS, Bio-Rad, Hercules, CA) k ověření pozitivní amplifikace cílové mRNA (údaje nejsou uvedeny) . CV pro MHC I, IIa a IIx byly 2,06%, 3,18% a 2,73%.
kvantifikace celkového svalového proteinu
celkový protein zbývající z celkového postupu izolace RNA byl izolován isopropanolem, ethanolem a 0,3 M hydrochloridem guanidinu. Myofibrilární protein byl izolován 0.1% sodný dodecyl sulfát (SDS) , před tím obsah bílkovin stanoven spektrofotometricky pomocí Bradford assay při vlnové délce 595 nm. Standardní křivka byla generována pomocí (r2 = 0.98, P < 0.001) bovinní sérum albumin jako standard a relativní zastoupení svalové mokré hmotnosti . Každý vzorek proteinu byl následně zředěn na 50 µg proteinu na 30 µl SDS pufru pro následné imunoblotování. C V pro myofibrilární protein byl 2,03% .
kvantifikace izoformy MHC proteinu
složení izoformy MHC proteinu v každém vzorku svalového homogenátu bylo stanoveno automatizovanou SDS-PAGE pomocí čipů Experion Pro260 (Bio-Rad, Hercules, CA). Přibližně 6 µl alikvotů z každého vzorku bylo pipetováno do každé jamky vzorku na mikročipu. Každý neznámý vzorek byl připraven ze 4 µl proteinu ředění z každého předmětu (nebo 4 µl molekulové hmotnosti žebřík), 2 µl vzorkového pufru s β-merkaptoethanolu, a 84 µl de-ionizované vody. Na základě zjištění Gazitha a kolegů se očekávalo, že všechny tři izoformy MHC migrují v oblasti 200-210 kiloDaulton v polyakrylamidovém gelu vzhledem k žebříku molekulové hmotnosti. Gely byly digitálně vizualizovat pomocí Experion software (Bio-Rad, Hercules, CA) a MHC koncentrace v každém vzorku byly hodnoceny porovnáním libovolné hustoty každé izoformy MHC do libovolné hustoty z molární hmotnosti markerů se známou koncentrací. CV proteinových pásem ≥10 kD byly ≤1,1%.
Protein imunoblotingu
PGF2a (FP) a PGE2 (EP3) receptor kvantifikace byla provedena při pokojové teplotě extrakcí celkové svalové bílkoviny z homogenátu a slot-blot 50 µg celkového proteinu na nitrocelulózové membrány pomocí Bio-Dot blotting protein system (Bio-Rad, Hercules, CA). Ve vysušeném stavu membrány byly inkubovány s blokováním roztoku po dobu 1 hodiny na orbitální rocker, dekantuje a membrány byly inkubovány s TTBS promývacího roztoku po dobu 5 minut, pro celkem tři myje. Membrány byly inkubovány se specifickými anti-FP receptor a anti-EP3 receptoru polyklonální protilátky (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI), zředěný na 4 µg·ml-1, pro 1 až 2 hodin na orbitální rocker. Primární roztoky protilátek byly poté dekantovány a membrány promyty roztokem TTBS po dobu 5 minut na orbitálním kolébce pro celkem tři promývání. V TTBS promývací roztok byl dekantován a membrány byly inkubovány se sekundární biotinylated kozí anti-králičí protilátka řešení (Bio-Rad, Hercules, CA) na 1 hodinu na orbitální rocker. Pokračování, sekundární biotinylated kozí anti-králičí protilátky, roztok byl dekantován a membrány inkubovány v TTBS promývací roztok pro celkem tři myje za 5 minut na jedno praní. Membrány byly inkubovány roztokem komplexu streptavidin-biotinylované alkalické fosfatázy (Bio-Rad, Hercules, CA) po dobu 1 hodiny na orbitálním kolébce. Konečně, streptavidin-biotinylated alkalické fosfatázy komplexní roztok byl dekantován a membrány promyty třikrát s TTBS řešení na 5 minut za wash na orbitální třepačce. Byl přidán roztok pro vývoj barev obsahující BCIP/NBT (Bio-Rad, Hercules, CA) a vývoj barev byl sledován po dobu 30 – 60 minut. Vývoj barev byl zastaven inkubací membrány ve dvojitě destilovaném H2O po dobu 10 minut na orbitálním kolébce. Blotovány membrány byly digitalizovány pomocí denzitometrie pomocí Chemicko-Doc XRS imaging system (Bio-Rad, Hercules, CA) a kapela hustota byla vyjádřena v integrované jednotky hustoty vzhledem k hmotnosti svalů.
Statistická analýza
statistické analýzy byly provedeny pomocí SPSS (verze 14.0, SPSS Inc., Chicago, IL). Proměnné složení celé krve, séra, výkonu a těla byly analyzovány pomocí analýzy rozptylu 2 × 3 (skupina × testing session) (ANOVA) s opakovanými měřeními jednorozměrné testy. Hladiny proteinu MHC, FP a EP3 receptoru byly analyzovány pomocí samostatné 2 × 2 (skupina × testovací relace) ANOVA s opakovanými opatřeními. Navíc v případě významného hlavního účinku pro skupinu byly pro každou skupinu provedeny jednosměrné ANOVAs s opakovanými opatřeními na testovacích relacích, aby se vyhodnotily rozdíly mezi testy. Nezávislé t-testy byly použity k analýze změn v expresi MHC mRNA po 50 dnech suplementace. Den 0 hodnoty odečtené od dne 25 a/nebo 50) byla provedena pro proměnné, které vykazovaly cizí rozdíly mezi skupinami v den 0. Jak bylo uvedeno s syrové skóre, 2 × 3 (skupina x testovací sezení) analýza rozptylu (ANOVA) s opakovanými měřeními jednorozměrných testů byl použit k analýze delta skóre pro složení těla, výkon proměnných, a koncentrace hormonů vzhledem k tomu, že 2 × 2 opakovaná měření ANOVA byla použita pro analýzu všech intramuskulární delta skóre. Za okolností, kdy nebylo možné předpokládat stejné odchylky v rámci skupin, byl pro úpravu v rámci F-poměrů skupiny použit korekční faktor Epsilon Hunyhs-Feldt. Za okolností, kdy se zdálo, že existují statistické trendy (tj. P = 0,05 až 0.10), velikosti účinků byly také hlášeny jako parciální Eta na druhou (np2). Parciální velikosti efektu Eta na druhou byly stanoveny jako slabé (np2 ≤ 0,01), střední (np2 = 0,06), silné = (np2 = 0,14), jak bylo popsáno výše . Významnost pro všechny statistické analýzy byla stanovena pomocí alfa hladiny 0,05. Je třeba poznamenat, že a priori power analýza návrhu je uvedeno, že n-velikost 15 účastníků na léčbu by výnos vysoký výkon (> 0.8) pro kritérium proměnná delta hodnoty 0,75-1,25. Je třeba také poznamenat, že post hoc outlier analýza pomocí krabicové grafy byly provedeny v případech, kdy došlo k významným skupina x čas interakce, aby zajistily, že jsou žádné chyby přítomen. Všechna data jsou uváděna jako prostředek ± směrodatné odchylky (SD).