| Taq polymerase, exonuclease | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|
 Full Taq DNA polymerase bound to a DNA octamer
|
||||||
| Identifiers | ||||||
| Symbol | Taq-exonuc | |||||
| Pfam | PF09281 | |||||
| InterPro | IPR015361 | |||||
| SCOP2 | 1qtm / SCOPe / SUPFAM | |||||
| Available protein structuri: | Pfam | PDB | pdbsum | |||
Taq pola are o structură generală similară cu cea a E. coli Pola. Domeniul exonuclează de mijloc 3′-5′ responsabil pentru corectură a fost schimbat dramatic și nu este funcțional. Are un domeniu funcțional de exonuclează 5′-3′ la terminalul amino, descris mai jos. Celelalte două domenii acționează în coordonare, prin mișcare de domeniu cuplată.
exonuclează domainEdit
Taq polimeraza exonuclează este un domeniu găsit în amino-terminalul ADN polimerazei Taq I (termostabil). Presupune un motiv asemănător ribonucleazei H. Domeniul conferă 5′ -3 ‘ activitate exonuclează polimerazei.
spre deosebire de același domeniu din E. coli, care ar degrada primerii și trebuie îndepărtat prin digestie pentru utilizarea PCR, nu se spune că acest domeniu degradează grundul. Această activitate este utilizată în sonda TaqMan: pe măsură ce se formează firele fiice, sondele complementare șablonului vin în contact cu polimeraza și sunt despicate în bucăți fluorescente.
legarea cu DNAEdit
polimeraza Taq este legată la locul său activ de polimerază cu capătul contondent al ADN-ului duplex. Deoarece polimeraza Taq este în contact cu ADN-ul legat, lanțurile sale laterale formează legături de hidrogen cu purinele și pirimidinele ADN-ului. Aceeași regiune a polimerazei Taq care s-a legat de ADN se leagă și de exonuclează. Aceste structuri legate de polimeraza Taq au interacțiuni diferite.
Mutanțiedit
un experiment de mutageneză direcționat pe site care îmbunătățește activitatea exonucleazei vestigale 3′-5′ cu un factor de 2 a fost raportat, dar nu s-a raportat niciodată dacă acest lucru scade rata de eroare. Urmând o linie similară de gândire, proteinele chimera au fost realizate de domeniile de culegere a cireșelor din E. coli, Taq și T. neapolitana polimeraza I. schimbarea domeniului vestigal cu unul funcțional din E. coli a creat o proteină cu capacitate de citire a probelor, dar o temperatură optimă mai scăzută și o termostabilitate scăzută.
au fost produse versiuni ale polimerazei fără domeniul exonucleazei 5′-3′, dintre care Klentaq sau fragmentul Stoffel sunt cele mai cunoscute. Lipsa completă a activității exonucleazei face ca aceste variante să fie potrivite pentru primerii care prezintă structură secundară, precum și pentru copierea moleculelor circulare. Alte variații includ utilizarea Klentaq cu o polimerază de înaltă fidelitate, o Termosequenază care recunoaște substraturi precum T7 ADN polimeraza face, mutanți cu toleranțe mai mari la inhibitori sau versiuni „etichetate în domeniu” care au un motiv suplimentar de helix-ac de păr-helix în jurul sitului catalitic pentru a ține ADN-ul mai strâns în ciuda condițiilor adverse.
semnificație în detectarea bolii
datorită îmbunătățirilor Taq polimeraza furnizate în replicarea ADN-ului PCR: specificitate mai mare, mai puține produse nespecifice și procese și echipamente mai simple, a fost esențial în eforturile depuse pentru detectarea bolilor. „Utilizarea reacției în lanț a polimerazei (PCR) în diagnosticul bolilor infecțioase a dus la capacitatea de a diagnostica precoce și de a trata în mod corespunzător bolile datorate agenților patogeni fastidioși, de a determina susceptibilitatea antimicrobiană a organismelor cu creștere lentă și de a stabili cantitatea de infecție.”Implementarea polimerazei Taq a salvat nenumărate vieți. A servit un rol esențial în detectarea multora dintre cele mai grave boli din lume, inclusiv: tuberculoză, faringită streptococică, pneumonie atipică, SIDA, rujeolă, hepatită și infecții urogenitale ulcerative. PCR, metoda utilizată pentru a recrea copii ale probelor specifice de ADN, face posibilă detectarea bolii prin direcționarea unei secvențe ADN specifice a unui agent patogen vizat din proba unui pacient și amplificarea urmelor secvențelor indicative prin copierea lor de până la miliarde de ori. Deși aceasta este cea mai precisă metodă de detectare a bolii, în special pentru HIV, nu este efectuată la fel de des ca testele alternative, inferioare, din cauza costului relativ ridicat, a forței de muncă și a timpului necesar.
dependența de polimeraza Taq ca catalizator pentru procesul de replicare PCR a fost evidențiată în timpul pandemiei COVID-19 din 2020. Lipsa enzimei necesare a afectat capacitatea țărilor din întreaga lume de a produce Truse de testare pentru virus. Fără polimeraza Taq, procesul de detectare a bolii este mult mai lent și obositor.
În ciuda avantajelor utilizării polimerazei Taq în detectarea bolii PCR, enzima nu este lipsită de deficiențele sale. Boli retrovirale: HIV, HTLV-1 și HTLV-II; adesea includ mutații de la guanină la adenină în genomul lor. Mutații precum acestea sunt cele care permit testele PCR să detecteze bolile, dar rata de fidelitate relativ scăzută a polimerazei Taq face ca aceeași mutație G-to-A să apară și, eventual, să producă un rezultat fals pozitiv al testului.