Material
cellkultur
humant melanom Mel Z, Mel IL och Mel MTP-celler erhölls från tumörmaterialet hos patienter som genomgår behandling vid N. N. Blokhin National Medical Research Center Of oncology50. BJ – 5ta fibroblaster och bröstcancer SK-BR-3 celler var från ATCC. De andra cellerna tillhandahölls vänligt av Drs E. Svirchevskaya och E. Kovalenko (Shemyakin-Ovchinnikov Institutet för bioorganisk kemi RAS, Moskva, Ryssland). Alla celler odlades i rpmi-1640-tillväxtmedium kompletterat med 10% FBS, 2 kg L-glutamin, 100 kg/ml streptomycin och 100 U/ml penicillin vid 37 kg C i en 5% CO2 fuktad atmosfär. Mediet ersattes var 3-4 dagar. Melaninhalten uppskattades genom mätning av absorptionsspektret i DMSO-celllysater (106 celler per ml) med användning av en Cary 50 UV-Vis-spektrofotometer.
flödescytometri
celler skördades med Versenlösning, pelleterades genom centrifugering vid 300 g under 5 min och omsuspenderades i rpmi-1640-media utan serum till den slutliga koncentrationen av 106 celler per ml. Därefter överfördes 100 CGL av cellsuspensionen till de ljusskyddade rören för flödescytometri. Lämpliga arbetslösningar av FMN i rpmi-1640 medium bereddes omedelbart före experimenten. Dessa FMN-lösningar tillsattes till rören, och den slutliga FMN-koncentrationen var 10 kg, 30 kg och 100 kg. Därefter inkuberades cellerna i mörkret i en CO2-inkubator i 30 minuter. Vid slutet av inkubationen tillsattes 1 ml kalla PBS till varje rör, och cellerna centrifugerades (300 g, 4 ci C) under 5 min. Supernatanten avlägsnades och cellerna resuspenderades i 300 ci l av kalla PBS och överfördes till is. Fluorescens undersöktes med användning av en flödescytometer NovoCyte 2000r (ACEA Biosciences) och NovoExpress v. 1.2.4 programvara. Fluorescens mättes på en kanal motsvarande FITC-fluorescens och minst 10 000 händelser undersöktes för varje prov. För att uppskatta ackumuleringsnivån för FMN i cellerna bestämdes medianfluorescensvärdena i varje prov och sedan beräknades den relativa fluorescensnivån (F) enligt följande formel:
konfokal mikroskopi
-celler såddes i en 96-brunnsplattor (5 ml 103 celler per brunn) följt av inkubation över natten. Därefter tillsattes 100 CGR av lämpliga arbetslösningar av FMN (10 CGR, 30 CGR och 100 CGR) i rpmi-1640 medium till cellerna och plattan inkuberades i mörkret i en CO2-inkubator i 30 minuter. Därefter tvättades cellerna 3 gånger med kalla PBS och färgades dessutom med Hoechst 33258-färgämne (50 kvm) i 15 min. Optiska bilder och fluorescensintensitetsdata förvärvades med hjälp av InCell Analyzer 6000 och i Cell Analyzer Workstation software V. 3.7.3 (GE Healthcare, USA).
Cytotoxicitetsstudier
celler såddes i en 96-brunnsplatta (5 103 ci per brunn) följt av inkubation över natten. Lämpliga arbetslösningar av FMN i full rpmi-1640 medium bereddes omedelbart före experimenten. Därefter avlägsnades mediet från 96-brunnsplattan och FMN-lösningsaliquoter (100 occl) tillsattes i varje brunn. För att inducera FMN-fotoaktivering behandlades plattorna med ljus vid 450 nm, bestrålningsdos 0,2 J/cm2–7 J / cm2. Celler utan någon behandling användes som kontroller (100%). Cellens livskraft bestämdes genom MTT-analys efter 48 timmars inkubation. För detta ändamål behandlades celler med MTT-lösning (0,5 mg/ml i RPMI-1640) i 3 h. därefter ersattes mediet med 100 CGL DMSO för att lösa upp bildade formazan-kristaller. Den optiska densiteten (OD) vid 570 nm mättes med Varioskan Flash reader (Thermo Scientific, USA). Viabiliteten hos celler (V) efter FMN-behandling uttrycktes i % jämfört med kontrollen enligt följande ekvation:
syftar till att bestämma cytotoxiciteten hos FMN-fotoprodukter, lämpliga arbetslösningar av FMN i full RPMI-1640-medium bestrålades vid 450 nm (5 J/cm2) och inkuberades över natten. Därefter tillsattes dessa FMN-alikvoter (100 occl) till cellerna och inkuberades för 48 h. MTT-analys utfördes som beskrivits ovan.
i syfte att bestämma ROS-medierad fototoxicitet tillsattes FMN-lösningsaliquoter (100 Cgl) i varje brunn och behandlades med ljus vid 450 nm (5 J/cm2). FMN-innehållande media avlägsnades omedelbart efter behandlingen och celler inkuberades i färskt RPMI-1640-medium för 48 h. MTT-analys utfördes som beskrivits ovan.
apoptos-och nekrosanalys
celler såddes i en 96-brunnsplatta (5 ml 103 celler per brunn) följt av inkubation över natten. Därefter tillsattes 100 CGR av lämpliga arbetslösningar av FMN (10 CGR, 30 CGR och 100 CGR) i rpmi-1640 medium till cellerna och plattan inkuberades i mörkret i en CO2-inkubator i 30 minuter. Därefter bestrålades celler med 450 nm laser i en dos av 5 J / cm2. Därefter tvättades cellerna konsekvent med kall PBS och bindningsbuffert och färgades med Annexin V-FITC, propidiumjodid (PI) och Hoechst 33258 vid rumstemperatur i bindningsbuffert i 15 min. Optiska bilder och fluorescensintensitetsdata förvärvades med hjälp av InCell Analyzer 6000 och i Cell Analyzer Workstation software V. 3.7.3 (GE Healthcare, USA).
Elektrodproduktion
kolnanoelektroderna etsades i en 0,1 M NaOH, 10 mM KCl-lösning under 30-40 cykler i 10 sekunder vardera för att skapa en hålighet i kolytan. Den applicerade potentialen var V-formad med amplitud av 1,5-2 V. Platinaavsättning utfördes genom att sopa potentialen från 0 till -1500 MV vs Ag/AgCl i en lösning innehållande 2 mM kloroplatinsyra (H2PtCl6, Sigma). De cykliska voltammogrammen i 1 mM ferrocenmetanol (FcMeOH, Sigma) erhölls för den initiala kolelektroden, för elektroden med nanocavities och med platina för att styra produktionsprocessen. Deponeringen av Pt ökade endast den effektiva geometriska ytan av nanoelektroden (vilket framgår av voltammogrammet för oxidation av 1 mM FcMeOH), men dramatiskt förbättrade dess katalytiska aktivitet mot ROS-reduktion. Nanoelektroden polariserades vid 600 mV vs Ag / AgCl (för diffusionsbegränsad detektion av H2O2) och närmade sig manuellt vätskan eller ytan på den enda cancercellen. För kalibreringen använde vi lösningar med olika koncentrationer av H2O2 (Sigma) i intervallet 10-7-10-4 M.
ROS-mätning med elektrokemisk sond
resultaten erhölls som det beskrevs tidigare47 med vissa förändringar. Således är den införda modifieringen av elektroder som används i detta arbete den bättre vidhäftningen av platina till kolelektrod på grund av etsning av ett hålrum i kolskikt före Pt-avsättning. Kommersiellt tillgänglig disk, formade kolnanoelektroder isolerade i kvarts (ICAPPIC Limited, UK) med diameter 100-500 nm, användes för produktion av sensorer för ROS-detektering. Elektrodens relativt inerta kolyta funktionaliserades ytterligare för detektering av redoxaktiva arter. Ett elektrodepositerat platinaskikt förbättrar den elektrokatalytiska aktiviteten genom att drastiskt minska överpotentialen som produceras genom reduktion av reaktiva syrearter. För att förbättra vidhäftningen av platina till kolpluggen etsade vi en nanocavity i kolelektroden. Vi har använt en elektrokemisk metod för att skapa små skåror i spetsarna på kolnanoelektroder51. Tillverkning av platina nanosensorer utfördes i två steg: etsning i alkalisk lösning och platinisering. Alla steg kontrollerades exakt av elektrokemiska mätningar. Vi tror att nanoelektroden är känslig både för kortlivade och långlivade ROS-former. Nyligen visade vi att singlet-syreproduktionen i vattenlösning av flavinmononukleotid (FMN) induceras genom bestrålning av blått ljus. Baserat på detta resultat demonstrerar vi (kompletterande data 9) Svar av kolnanoelektrod polariserad vid +800 mV vs Ag/AgCl på ROS-produktion i vattenlösning av FMN under bestrålning av blått ljus.
celler såddes i en petriskål följt av inkubation över natten. Därefter inkuberades cellerna i 30 minuter med 100 CGM FMN i mörker och tvättades 3 gånger med PBS. Därefter infördes den platiniserade nanoelektroden noggrant genom att använda den exakta mikromanipulatorn i singelcellen under optisk kontroll med inverterat mikroskop. För elektrodmanipulation och justering använde vi mikromanipulator PatchStar (Scientifica, Storbritannien). Vi samlade en cyklisk voltammetrisk data med patch-clamp förstärkare Modell 2400 (A-M Systems, USA). Inspelning av signalen utfördes med multifunktionell I / O-enhet USB-6211 (National instruments, USA) och datorprogram WinWCP. Alla mätningar utfördes på bordet av inverterat mikroskop Nikon (Japan). I alla mätningar användes Ag / AgCl-elektrod som referenselektrod.
ROS-mätning med fluorescerande sond
utvärdering av cytoplasmatisk ROS utfördes med användning av CellROX Deep Red fluorescerande sond (molekylära Sonder / termo). I korthet såddes Mel IL-och m-3-melanomceller (5 kg 103) i 96-brunnsplattor (Nunc, Danmark) och inkuberades med 2,5 kg CellROX Deep Red i full rpmi-1640-media i 30 minuter och tvättades i PBS tre gånger. Därefter tillsattes 100 UCL av lämpliga arbetslösningar (10 ucrm, 30 ucrm och 100 ucrm) FMN i rpmi-1640 medium utan Fenolröd till celler och plattan inkuberades i mörkret i en CO2-inkubator i 30 minuter. Därefter bestrålades celler med 450 nm laser i en dos av 5 J / cm2. Cellkärnor färgades dessutom med 50 CGR Hoechst 33258 färglösning under 15 min. Optiska bilder och Cellrox djupröd fluorescensintensitetsdata för Mel IL och a375 melanomceller förvärvades med hjälp av InCell Analyzer 6000 och i cell Analyzer Workstation software V. 3.7.3 (GE Healthcare, USA).
bestämning av melanininnehåll
vi använder rutinanalys för spektrofotometri melaninbestämning med mindre förändringar52. Fyra melanomcellinjer: Mel MTP, Mel IL, Mel Z, A375 och två normala (humana keratinocyter HACAT och humana hudfibroblaster BJ-5ta) cellinjer räknades och pelleterades för att få en slutlig koncentration av 2 106 celler/ml. För bestämning av intracellulärt melanininnehåll löstes cellpellets i 1 M NaOH innehållande 10% (v/v) DMSO och inkuberades vid 80 C-C i 1 timme. Efter inkubation centrifugerades lysaterna (3000 g under 5 min) och absorbansen mättes i cellfritt medium vid 405 nm. Alla resultat uttrycks som medelvärde av absorbansintensiteter normaliserade till melaninhalten i fibroblaster kubi standardavvikelse (SD) av tre oberoende experiment. Statistisk analys utfördes med GraphPad Prism version 5.0 (GraphPad Software, La Jolla California USA).
djurförsök
terapi av primära tumörer
manliga Balb / c nu / nu-möss i åldern 6-7 veckor köptes från Animal farm of Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, och inrymdes under kontrollerade miljöförhållanden i ventilerat djurskåp A-Box 80 (Noroit, Frankrike) vid en 12 h mörkljuscykel och gav fritt tillgång till sterilt vatten och SPF-mus chow. Alla djurförsök utfördes i enlighet med europeiska och ryska nationella riktlinjer för djurförsök och godkändes av djur-och etikprövningsutskottet i FSBSI ”N. N. Blokhin NMRCO”, referensnummer 2017-034.
För att upprätta en xenograftmusmodell skördades Mel IL-och a375-celler med versen-lösning, pelleterades genom centrifugering vid 300 g i 5 minuter och resuspenderades i rpmi-1640-media utan serum. Melanomcellsuspension blandades (1:1 volym) med Matrigel (BD Biosciences) och den erhållna cellsuspensionen (2 106 CCR-celler per injektion) implanterades subkutant i musens högra flank för att säkerställa framgångsrik tumörinitiering och tumörtillväxtmätningar.
administrering av FMN startade dag 10 efter ympning när tumörstorleken nådde 100-120 mm3. FMN-lösning (150 CGL, 10 CG/ml) injicerades intravenöst i mössen genom en retro-orbital sinus, och tumörerna bestrålades med blått ljus vid 450 nm i 15 min till den slutliga dosen av 20 J/cm2.
tumörvolymen uppskattades med standardmetoden för kalipering och beräknades med följande formel, förutsatt en hemi-ellipsoid form:
antitumöraktivitet för fotoaktiverad FMN bestämdes genom att utvärdera tumörtillväxthämningshastigheten (TGI%) beräknad som:
fotodynamisk terapi av avlägsna tumörer
vi använde C57BL/6 möss vid 6-7 veckors ålder, köpt från animal farm of Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences. Alla djurförsök utfördes i enlighet med europeiska och ryska nationella riktlinjer för djurförsök och godkändes av animal and ethics review committee of the FSBI ” N. N. Blokhin NMRCO”, referensnummer 2017-034.
B16-F10 musmelanomceller skördades med versen-lösning, pelleterades genom centrifugering vid 300 g i 5 minuter och återupptogs i rpmi-1640-media utan serum. Melanomcellsuspension blandades (1: 1 volym) med Matrigel (BD Biosciences), och den erhållna cellsuspensionen (5 105 CG celler per injektion) implanterades subkutant i höger och vänster flank av mössen för att säkerställa framgångsrik tumörinitiering och tumörtillväxtmätningar.
administrering av FMN började på Dag 4 efter inokulering när tumörstorleken nådde 60 16 mm3 mmn-lösning (150 CGL, 10 mg / ml) injicerades intravenöst i mössen genom en retro-orbital sinus och tumörerna bestrålades med blått ljus vid 450 nm i 15 min till den slutliga dosen av 20 J/cm2. Två kontrollgrupper användes: FMN-injektion utan ljusbestrålning; laserbestrålning utan FMN-injektion. Tumörvolym och antitumöraktivitet av fotoaktiverad FMN uppskattades som det beskrivits ovan.
Hematoxylin och eosin färgning
djur offrades av cervikal dislokation i 24 timmar efter PDT. Alla skördade tumörer fixerades med 4% paraformaldehyd i 24 timmar och inbäddades sedan med paraffin. Vävnadssektioner (4 cm tjocka) färgades med hematoxylin och eosin.
statistisk analys
alla experiment utfördes i tre exemplar om inte annat anges, och varje experiment upprepades tre gånger oberoende. Data uttrycks som medelvärde för SD-kort. Skillnader ansågs vara statistiskt signifikanta när p-värden var mindre än 0,05. Alla statistiska analyser utfördes med GraphPad Prism-programvara (GraphPad Software, La Jolla, San Diego, CA, USA).