ämnen
trettioen friska, motståndsutbildade män (22.1 8.0 år, 180 0.1 cm, 86.1 13.0 kg, 18.1 6.4% kroppsfett) informerades om studieprotokoll godkänt av Institutional Review Board vid Baylor University före deltagande. Träningsstatus var självrapporterad, och individer som saknade minst ett års erfarenhet före studien uteslöts. Dessutom utesluts ämnen om de: 1) hade någon historia av metabolisk, hypertoni, hepatorenal, muskuloskeletal, autoimmun eller neurologisk sjukdom; 2) tog för närvarande sköldkörtel -, antihyperlipidemiska, hypoglykemiska, antihypertensiva eller androgena läkemedel; och 3) hade tagit näringstillskott som kan påverka muskelmassan och/eller anabola/kataboliska hormonnivåer inom tre månader efter starten av studien.
Baslinjetestning
kvalificerade personer bekantades med studieprotokollet via en muntlig och skriftlig förklaring av studiedesignen. Ämnen undertecknade ett informerat samtycke uttalande och avslutade personliga och medicinska historier samtidigt som de slutförde ett Wingate anaerobt kapacitetstest före baslinjetestning. Ämnen instruerades att avstå från ansträngande träning i 48 timmar och snabbt i 10 timmar före baslinjetestning (dvs. dag 0) som inträffade 3-4 dagar efter förtrogenhet för att möjliggöra registrering av kostintag. Denna studie använde en dubbelblind, placebokontrollerad, parallell studiedesign där försökspersoner matchades jämnt i kluster beroende på ålder och kroppsmassa.
experimentellt protokoll
under dagarna 0, 25 och 50 rapporterade varje patient till laboratoriet efter en 10-timmars fasta. Höjden mättes med hjälp av standardantropometri och total kroppsmassa mättes med hjälp av en kalibrerad Healthometer digital töjningsmätare elektronisk skala (Bridgeview, IL) med en precision på 0,02 kg. Kroppssammansättning bestämdes sedan med användning av en kalibrerad Hologic Discovery w dual-energy röntgenabsorptiometer (DXA) enhet (Hologic Inc., Bedford, MA), medan blodtryck och vilopuls bestämdes med hjälp av standardprocedurer. Ämnen donerade sedan cirka 25 ml fastande blod med hjälp av standard venipunktionstekniker för hematologiska, kliniska kemipaneler och senare cytokin-och hormonanalys. Två 10 ml serumseparation vacutainer-rör och ett 5 ml K3 EDTA vacutainer-rör infördes i vacutainer-hållaren för bloduppsamling i följd med användning av flera provflebotomitekniker. Helblod analyserades omedelbart för ett fullständigt blodantal medan serum vacutainer-rör centrifugerades vid rumstemperatur i 15 minuter vid 1500 g, serum supernatanten överfördes till mikrocentrifugrör och serumproverna lagrades vid -20 CCG för efterföljande hormonella och metabolitanalyser. Endast på dag 0 och 50 donerade försökspersoner cirka 60 mg skelettmuskulatur från vastus lateralis med Bergstroms biopsiteknik. Övre och nedre kroppsstyrka bedömdes med hjälp av standard 1RM-testprocedurer med en bänkpress och 35 megapixels höftledsmaskin (Nebula, Versailles, OH). Test-testa tillförlitligheten hos dessa styrketester på motståndsutbildade personer i vårt laboratorium har gett en hög tillförlitlighet för bänkpressen (r = 0,94) och benpressen (r = 0,91). Efter bestämning av höftled 1RM vilade försökspersonerna 10 minuter innan de slutförde ett 30 sekunder Wingate anaerobt kapacitetstest på en datoriserad cykelergometer (Lode Excalibur, Lode, Groningen, Nederländerna) för att bedöma anaerob kraft i underkroppen. Detta test bestod av att varje ämne sprint på ett helt sätt på cykelergometern i 30 sekunder mot en standard arbetsbelastning på 0,075 kg * kg-1 kroppsvikt. Test-retest tillförlitlighet för absolut toppeffekt och medelkraft i vårt laboratorium har också gett höga tillförlitlighetsvärden (r = 0,69 och r = 0.95, P < 0,05).
perkutana muskelbiopsier
muskelbiopsier togs dagarna 0 och 50 före alla styrketester för att undvika potentiell myofibrillarstörning på grund av träning . Ämnen instruerades att avstå från träning 48 timmar före varje muskelbiopsi. Muskeln extraherades från den laterala delen av vastus lateralis halvvägs mellan patella och iliac crest av det dominerande benet med hjälp av en 5 mm biopsinål med applicerad sug . Kort sagt, 1,5 ml av 1.0% lidokain HCl injicerades subkutant innan ett litet pilotinsnitt gjordes. Med hjälp av dubbelhackningsprocedurer och applicerad sugning hade provet först allt synligt fett och bindväv avlägsnat innan det frystes i flytande kväve. Alla prover lagrades därefter vid -80 C. C. tills senare analyser.
tilläggsprotokoll och dietövervakning
på dubbelblind sätt intog försökspersoner fyra 250 mg kapslar innehållande en majsolja placebo eller AA (X-Faktor, Molekylär näring, Jupiter, FL) under 50 dagar efter baslinjetestning. Kosttillskott bereddes i kapselform och förpackades i generiska flaskor genom molekylär näring. Efterlevnaden övervakades genom att försökspersonerna returnerade tomma tilläggsflaskor efter 25 och 50 dagars tillskott. I enlighet med tidigare riktlinjer och i ett försök att säkerställa att energi-och proteinintaget var tillräckligt för att underlätta muskelhypertrofi, instruerades alla försökspersoner att öka kaloriintaget med cirka 500 kcal·dag-1 samtidigt som de behöll ett uppskattat proteinintag på 2 g·kg-1·dag-1 jämfört med baslinjedietanalys . Ämnen tillhandahölls ett kommersiellt tillgängligt måltidsersättningspulver (Lean Body, Labrada Nutrition, Houston, TX) innehållande cirka 290 kilokalorier, 24 g kolhydrat, 45 g protein och 1 g fett per portion i ett försök att tillgodose ovan nämnda energi-och proteinbehov. Beroende på baslinjeproteinintag fick försökspersonerna veta att de skulle ta in 1 till 2 paket av måltidsersättningstillskottet på morgonen och/eller omedelbart efter varje träningspass . Dessutom instruerades försökspersonerna att undvika regelbunden konsumtion av livsmedel som är kända för att vara höga i Audrey-3-fettsyror inklusive fiskolja, linfröolja, kallvattenfisk, olivolja, sesamolja, jordnötssmör, N-acetyl-cystein, konjugerad linolsyra samt antiinflammatoriska läkemedel inklusive paracetamol, ibuprofen, aspirin och andra icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel . Kostintag såväl som linolsyra (18: 2, ml-6), linolensyra (18:3, Xiaomi-3) och AA-intag övervakades med 4-dagars dietrekommendationer på dagarna 0, 25 och 50 och bedömdes med hjälp av matprocessorn III Nutrition Software (Esha Nutrition Research, Salem eller).
Motståndsutbildningsprotokoll
under en 50-dagarsperiod slutförde ämnen ett 4-dagars·vecka-1 split-body, linjärt periodiseringsmotståndsutbildningsprogram. Överkroppslyftar inkluderade bänkpress, lat pull, axelpress, sittande rader, axelryckningar, bröstflugor, biceps curls och triceps press-downs medan underkroppslyftar inkluderade benpress, ryggförlängning, steg ups, benkrullar, benförlängning, hälhöjningar och abdominal crunches två gånger per vecka. Ämnen utförde 3 uppsättningar med 10 repetitioner med så mycket vikt som de kunde lyfta per uppsättning (dvs 60-80% av 1RM). Viloperioderna mellan övningarna översteg inte 3 minuter, medan resten mellan uppsättningarna inte översteg 2 minuter. Utbildningen genomfördes vid universitetets studentliv center, dokumenteras i utbildningsloggar, och undertecknades av utsedda anställda för att kontrollera efterlevnaden och övervaka utvecklingen. Detta protokoll har visats i tidigare forskning för att främja betydande vinster i muskelstyrka, muskeluthållighet och fettfri massa .
Serum-och helblodanalyser
Serum-och helblodsprover användes för att utvärdera klinisk säkerhet under tilläggsprotokollen. Serum samples were assayed for comprehensive metabolic panels including glucose, total protein, blood urea nitrogen (BUN), creatinine, BUN/creatinine ratio, uric acid, aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), creatine kinase (CK), lactate dehydrogenase (LDH), gamma-glutamyl transpeptidase (GGT), albumin, globulin, sodium, chloride, calcium, carbon dioxide, total bilirubin, alkaline phosphatase (ALP), triglycerides, cholesterol, HDL and LDL using a Dade Dimension XL clinical chemistry system (Dade Behring Inc., Newark, DE). Komplett blodcellsantal inklusive röda blodkroppar, hemoglobin, hematokrit, Genomsnittlig cellvolym, genomsnittligt korpuskulärt hemoglobin, Genomsnittlig korpuskulär hemoglobinkoncentration, distributionsbredd för röda blodkroppar, antal vita blodkroppar, neutrofiler, lymfocyter, monocyter, eosinofiler och basofiler analyserades via flödescytometri med Cell-DYN 1800 (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). Test för att testa tillförlitlighet (inom och mellan) för att utföra dessa analyser varierade från 2 till 6% för enskilda analyser med en genomsnittlig variationskoefficient (CV ) på 3,0%. Prover kördes i två exemplar för att verifiera resultat om de observerade värdena var utanför kontrollvärden och/eller kliniska normer enligt standardprocedurer.
efterföljande serumprover analyserades senare för kortisol (CORT), fritt testosteron (fTEST), totalt testosteron (tTEST), interleukin-6 (IL-6), prostaglandin E2 (PGE2) och prostaglandin F2a (PGF2a). Kommersiella enzymimmunabsorbentanalyser användes för att analysera serumkoncentrationer av PGF2a, PGE2 och IL-6 (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) och CORT, fTEST och tTEST (Diagnostic Systems Laboratories, Webster, TX). CV för att utföra dessa MKB-baserade analyser varierade från 3,0 till 5,0%.
Total rna-isolering
totalt cellulärt RNA extraherades från homogenatet av biopsiprover med en monofasisk lösning av fenol och guanidinisotiocyanat innehållen i TRI-reagenset (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Totala RNA-koncentrationer från varje prov bestämdes spektrofotometriskt med en optisk densitet av 260 nm (OD260), med slutlig koncentration justerad till 200 ng·Ci-1 genom utspädning av de råa totala RNA-extrakten till depc-behandlad nukleasfri H2O. Denna procedur har visat sig ge un-degraderat RNA, fritt från DNA och proteiner, vilket indikeras av framstående 28S och 18S ribosomala RNA-band, såväl som ett OD260/OD280-förhållande på ungefär 2,0 . RNA-proverna lagrades vid -80 C-C tills senare analyser.
omvänd transkription och klonal DNA-syntes
de standardiserade lösningarna av totalt cellulärt RNA transkriberades omvänd för att syntetisera klonalt DNA (cDNA) som beskrivits tidigare . Kort sagt inkuberades en omvänd transkriptionsreaktionsblandning vid 42 kg C i 40 minuter, upphettades till 85 kg C i 5 minuter och kyldes sedan snabbt på is vilket gav cDNA-produkten. Startande cDNA-mallkoncentrationer standardiserades till 200 ng * oc-L-1 före realtidspolymeraskedjereaktion (RT-PCR) amplifiering genom att detektera råa cDNA-syntetiserade produkter spektrofotometriskt vid en våglängd av 260 nm och spädning av dem i nukleasfri H2O. de standardiserade cDNA-lösningarna frystes vid -80 CCG tills RT-PCR i realtid utfördes.
RT-PCR
Anti-sense och sensoligonukleotidprimerpar konstruerades med användning av kommersiellt tillgänglig Beacon Designer-programvara (Bio-Rad, Hercules, CA) från kända mRNA-sekvenser publicerade i genbank nucleotide database och kommersiellt syntetiserade (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). Följande 5′ sense och 3 ’anti-sense oligonukleotidprimrar användes för att isolera de tre vuxna MHC-isoformerna (typ I, IIa och IIx): typ i MHC mRNA (5’ primer: baser 776-796, 3 ’primer: baser 1398-1378, GenEMBL AC X06976), typ IIa MHC mRNA (5’ primer: baser 1785-1805, 3 ’primer: baser 2440-2420, GenEMBL AC AF111784), typ IIx MHC mRNA (5′ primer: baser 1138-1158, 3’ primer: baser 1746-1726, GenEMBL AC AF111785). Dessa primers förstärker fragment av 141, 145 respektive 148 baspar för typ I, IIa, IIx MHC. som en extern referensstandard för att detektera relativ förändring i mängden mål-mRNA på grund av dess övervägande som en konstitutivt uttryckt hushållningsgen , förstärker dessa hCG-aktin-primers ett PCR-fragment av 135 baspar. Två hundra ng av cDNA tillsattes till var och en av de fyra PCR-reaktionerna för MHC typ I,- IIa och-IIx och Javi-aktin. Specifikt innehöll varje PCR-reaktion följande blandningar: 2 sekl cDNA-Mall tillsattes tillsammans med 12,5 sekl av 2 sekl SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA) , 1,5 sekl av sense och anti-sense primers och 7,5 sekl nukleasfri dH2O]. Varje PCR-reaktion förstärktes med en termisk cykler (Bio Rad, Hercules, CA) och förstärkningssekvensen involverade ett denatureringssteg vid 95 CCI i 30 sekunder, primerglödgning vid 55 CCI i 30 sekunder och förlängning vid 72 CCI i 60 sekunder . RT-PCR utfördes under 40 cykler med emitterad fluorescens från SYBR-grön fluorofor som mättes efter varje cykel. En emission av fluorescens uppstår på grund av integrationen av SYBR green i den dubbelsträngade cDNA som produceras under PCR-reaktionen. Alla CT-värden bedömdes i den linjära delen av amplifieringen och en DNA-smältkurvanalys utfördes efter amplifiering för att säkerställa att de enskilda genprodukterna förstärktes i frånvaro av primerdimerer. Kvantifiering av all mRNA uttrycktes i förhållande till uttrycket av en aktinaktun. En jämförelse av CT – värdeförhållanden användes för att jämföra förändringar i basalt genuttryck mellan AA-och PLA-grupperna. Agarosgelelektrofores med användning av 25 alikvoter av de slutförda PCR-reaktionsblandningarna utfördes i 1.5% agarosgeler som använder 1 ml tris-borsyra-EDTA (TBE) buffert och belyses med en UV-transilluminator (Chemi-Doc XRS, Bio-Rad, Hercules, CA) För att verifiera positiv förstärkning av mål mRNA (data visas inte) . C V för MHC I, IIa och IIx var 2,06%, 3,18% respektive 2,73%.
Total muskelproteinkvantitation
totalt protein kvar från det totala rna-isoleringsförfarandet isolerades med isopropanol, etanol och 0,3 M guanidinhydroklorid. Myofibrillar protein isolerades med 0.1% natriumdodecylsulfat (SDS), innan proteininnehållet bestämdes spektrofotometriskt med användning av en Bradford-analys vid en våglängd av 595 nm. En standardkurva genererades med användning av (r2 = 0,98, P < 0,001) bovint serumalbumin som standard och representerat i förhållande till muskelvätvikt . Varje proteinprov späddes därefter till 50 CG protein per 30 CGL SDS-buffert för efterföljande immunoblottning. C V för myofibrillarprotein var 2,03%.
MHC protein isoform quantitation
sammansättningen av MHC protein isoformer inom varje muskelhomogenatprov bestämdes av automatiserad SDS-sida med Experion Pro260 chips (Bio-Rad, Hercules, CA). Cirka 6 alikvoter av varje prov pipetterades i varje provbrunn på mikrochipet. Varje okänt prov framställdes från 4 sekl av proteinutspädningen från varje försöksperson (eller 4 sekl av molekylviktsstegen), 2 sekl provbuffert med sekl-merkaptoetanol och 84 sekl avjoniserat vatten. Baserat på resultaten från Gazith och kollegor förväntades alla tre MHC-isoformerna migrera i regionen 200-210 kiloDaulton inom polyakrylamidgelen relativt molekylviktsstegen. Gelerna visualiserades digitalt av Experion-programvaran (Bio-Rad, Hercules, CA) och MHC-koncentrationer i varje prov bedömdes genom att jämföra godtycklig densitet för varje MHC-isoform med godtyckliga densiteter av molekylviktmarkörer med kända koncentrationer. CV av proteinband, 10 KD, var 1,1%.
Proteinimmunoblotting
PGF2a (FP) och PGE2 (EP3) receptorkvantitation utfördes vid rumstemperatur genom att extrahera totalt muskelprotein från homogenatet och slitsblotting 50 CGG totalt protein på nitrocellulosmembran med användning av ett Bio-Dot-proteinblottningssystem (Bio-Rad, Hercules, CA). De blottade membranen inkuberades med blockeringslösning i 1 timme på en orbital rocker, dekanterades och membran inkuberades med en ttbs tvättlösning i 5 minuter för totalt tre tvättar. Membranen inkuberades med specifika anti-FP-receptor-och anti-EP3-receptorpolyklonala antikroppar (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI), utspädda till 4 cuberg·ml-1, i 1 till 2 timmar på en orbital rocker. Primära antikroppslösningar dekanterades sedan och membranen tvättades med ttbs-lösning i 5 minuter på en orbitalvippa för totalt tre tvättar. Ttbs-tvättlösningen dekanterades och membranen inkuberades med en sekundär biotinylerad get-anti-kaninantikroppslösning (Bio-Rad, Hercules, CA) i 1 timme på en orbital rocker. Fortsatt dekanterades den sekundära biotinylerade get-anti-kaninantikroppslösningen och membranen inkuberades i ttbs tvättlösning under totalt tre tvättar vid 5 minuter per tvätt. Membranen inkuberades med en streptavidin-biotinylerad alkalisk fosfataskomplexlösning (Bio-Rad, Hercules, CA) i 1 timme på en orbital rocker. Slutligen dekanterades den streptavidin-biotinylerade alkaliska fosfataskomplexlösningen och membranen tvättades tre gånger med ttbs-lösning vid 5 minuter per tvätt på en orbital shaker. Färgutvecklingslösning innehållande BCIP / NBT (Bio-Rad, Hercules, CA) tillsattes och färgutveckling övervakades under 30 – 60 minuter. Färgutvecklingen stoppades genom att inkubera membranet i dubbeldestillerad H2O i 10 minuter på en orbital rocker. Blottade membran digitaliserades genom densitometri med användning av ett Kemi-Doc XRS-bildsystem (Bio-Rad, Hercules, CA) och banddensitet uttrycktes i integrerade densitetsenheter i förhållande till muskelvikt.
statistisk analys
statistiska analyser utfördes med användning av SPSS (version 14.0, SPSS Inc., Chicago, IL). Helblods -, serum -, prestanda-och kroppssammansättningsvariabler analyserades med användning av 2-analys av varians (ANOVA) med upprepade åtgärder univariata tester. MHC-protein -, FP-och EP3-receptorproteinnivåer analyserades med användning av separat 2 ci 2 (grupp-testningssession) ANOVA med upprepade åtgärder. Dessutom, när det gäller betydande huvudeffekt för grupp, utfördes enkelriktad ANOVAs med upprepade åtgärder på testsessioner för varje grupp för att bedöma eventuella skillnader mellan testerna. Oberoende t-tester användes för att analysera förändringarna i MHC mRNA-uttryck efter 50 dagars tillskott. Förutom raw-poänganalys utfördes delta-poänganalys (dvs. dag 0-värden subtraherade från dag 25 och/eller 50) för variabler som uppvisade främmande variation mellan grupper på dag 0. Som nämnts med raw-poäng användes en analys av varians (ANOVA) med upprepade mått univariata tester för att analysera delta-poäng för kroppssammansättning, prestandavariabler och hormonkoncentrationer, medan en 2-2-upprepad åtgärd ANOVA användes för att analysera alla intramuskulära delta-poäng. Under omständigheter där lika variationer inom grupper inte kunde antas användes Hunyhs-Feldt epsilon-korrigeringsfaktorn för att justera inom Grupp F-förhållanden. Under omständigheter där statistiska trender tycktes existera (dvs. P = 0,05 till 0.10), effektstorlekar rapporterades också som partiell eta kvadrat (np2). Partiell Eta i kvadrat effektstorlekar som var fast beslutna att vara svag (np2 ≤ 0.01), medium (np2 = 0.06), stark = (np2 = 0.14), som tidigare beskrivits . Betydelse för alla statistiska analyser bestämdes med användning av en alfa-nivå på 0,05. Det bör noteras att en a priori-effektanalys av designen indikerade att en n-storlek på 15 deltagare per behandling skulle ge en hög effekt (> 0.8) för kriterium variabla delta-värden på 0.75 till 1.25. Det bör också noteras att post hoc-outlier-analys med användning av låddiagram utfördes under omständigheter där det fanns betydande grupp-interaktioner mellan grupp-och grupptid för att säkerställa att det inte fanns några avvikelser. Alla data rapporteras som medel för standardavvikelser (SD).