Temas
Trinta e um saudável, resistência treinados do sexo masculino (de 22,1 ± 5.0 anos, 180 ± 0,1 cm, 86.1 ± 13,0 kg, de 18,1 ± 6.4% de gordura corporal) foram informados de protocolo de estudo aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Baylor antes da participação. O status de treinamento foi auto-relatado, e indivíduos que não tinham pelo menos um ano de experiência antes do estudo foram excluídos. Além disso, os indivíduos foram excluídos se que: 1) não tinha qualquer história do metabólica, hipertensão, hepatorenal, músculo-esquelético, auto-imune, ou doença neurológica; 2) atualmente, tendo tireóide, anti-hiperlipêmicos, hipoglicemia, anti-hipertensivos, androgênicos ou medicamentos; e 3) tinha tomado suplementos nutricionais que podem afetar a massa muscular e/ou anabólico/catabólico níveis de hormônio no prazo de três meses a iniciar o estudo.os indivíduos elegíveis foram familiarizados com o protocolo de estudo através de uma explicação verbal e escrita da concepção do estudo. Os sujeitos assinaram uma declaração de consentimento informado e completaram histórias pessoais e médicas, ao mesmo tempo que completaram um teste de capacidade anaeróbica Wingate antes dos testes de base. Os indivíduos foram instruídos a abster-se de fazer exercício físico extenuante durante 48 horas e rápido durante 10 horas antes dos testes iniciais (ou seja, dia 0) que ocorreram 3-4 dias após a familiarização para permitir o registo da ingestão alimentar. Este estudo utilizou um desenho de estudo paralelo, em dupla ocultação, controlado por placebo, em que os indivíduos eram uniformemente combinados em aglomerados, de acordo com a idade e a massa corporal.
protocolo Experimental
durante os dias 0, 25 e 50, cada indivíduo relatado ao laboratório após um intervalo de 10 horas. A altura foi medida usando a antropometria padrão e a massa corporal total foi medida usando uma escala eletrônica calibrada do Healthometer digital strain gauge (Bridgeview, IL) com uma precisão de ± 0,02 kg. A composição corporal foi então determinada utilizando um dispositivo de absorção de raios-x de dupla energia calibrado (Halic Inc., Bedford, MA), enquanto a pressão arterial e a frequência cardíaca em repouso foram determinados utilizando procedimentos padrão. Os indivíduos doaram então cerca de 25 ml de sangue em jejum usando técnicas padrão de venipunctura para Hematologia, painéis de química clínica e mais tarde citocina e análise hormonal. Foram inseridos dois tubos de separação sérica de 10 ml e um tubo de EDTA vacutainer de 5 ml K3 para recolha sucessiva de sangue, utilizando técnicas de flebotomia de amostras múltiplas. O sangue total foi imediatamente analisado para uma contagem completa de sangue, enquanto os tubos de soro vacutainer foram centrifugados à temperatura ambiente durante 15 minutos a 1500 g, o sobrenadante sérico foi transferido para tubos de microcentrifugação, e as amostras de soro foram armazenadas a -20°C para análises hormonais e metabólicas subsequentes. Apenas nos dias 0 e 50, os indivíduos doaram aproximadamente 60 mg de músculo esquelético do vastus lateralis utilizando a técnica de biópsia de Bergstrom. A resistência do corpo superior e inferior foi avaliada usando procedimentos padrão de teste 1RM com uma prensa de banco e 35° máquina de trenó da anca (Nebula, Versalhes, OH). Test-retest confiabilidade destes testes de resistência em indivíduos treinados em resistência em nosso laboratório rendeu uma alta confiabilidade para a prensa de banco (r = 0.94) e a prensa de perna (r = 0.91). Após a determinação do sled 1RM da anca, os indivíduos descansaram 10 minutos antes de completarem um teste de capacidade anaeróbica de 30 segundos Wingate num ergómetro computorizado de ciclo (Lode Excalibur, Lode, Groningen, Países Baixos) para avaliar a potência anaeróbia do corpo inferior. Este teste consistiu em ter cada tema sprint de uma forma totalmente fora no ergômetro da bicicleta por 30 segundos contra uma carga de trabalho padrão de 0,075 kg * kg-1 de peso corporal. Test-retest confiabilidade para a potência máxima absoluta e potência média em nosso laboratório também renderam valores de alta confiabilidade (r = 0,69 e r = 0.95, respectivamente, P 0, 05).as biópsias musculares percutâneas
foram tomadas nos dias 0 e 50 antes de todos os testes de resistência para evitar potenciais perturbações miofibrilares devido ao exercício . Os indivíduos foram instruídos a abster-se de fazer exercício 48 horas antes de cada biópsia muscular. O músculo foi extraído da porção lateral do vastus lateralis a meio caminho entre a patela e a crista ilíaca da perna dominante usando uma agulha de biópsia de 5 mm com sucção aplicada . Brevemente, 1,5 ml de 1.0% de cloridrato de lidocaína foi injectado por via subcutânea antes de fazer uma pequena incisão piloto. Utilizando procedimentos de duplo corte e sucção aplicada, a amostra teve primeiro toda a gordura visível e tecido conjuntivo removidos antes de ser congelada em azoto líquido. Todas as amostras foram posteriormente armazenadas a -80°C até análises posteriores.protocolo de suplementação e monitorização dietética
numa dupla ocultação, os indivíduos ingeriram quatro cápsulas de 250 mg contendo um placebo de óleo de milho ou AA (Factor X, nutrição Molecular, Júpiter, FL) durante 50 dias após os testes iniciais. Os suplementos foram preparados em forma de cápsula e embalados em Frascos Genéricos por nutrição Molecular. A conformidade foi monitorizada fazendo com que os indivíduos devolvessem frascos de suplemento vazios após 25 e 50 dias de suplementação. De acordo com as directrizes anteriores e num esforço para assegurar que a ingestão de energia e de proteínas era adequada para facilitar a hipertrofia muscular, todos os indivíduos foram instruídos a aumentar a ingestão calórica em aproximadamente 500 kcal·dia-1, mantendo simultaneamente uma ingestão estimada de proteínas de 2 g·kg-1·dia-1, quando comparada com a análise alimentar inicial . Foram fornecidos aos indivíduos um pó de substituição de refeições comercialmente disponível (Corpo Magro, nutrição Labrada, Houston, TX) contendo aproximadamente 290 quilocalorias, 24 g de hidratos de carbono, 45 g de proteínas e 1 g de gordura por porção, numa tentativa de acomodar as necessidades acima mencionadas de energia e proteínas. Dependendo da ingestão inicial de proteínas, os indivíduos foram aconselhados a ingerir 1 a 2 pacotes do suplemento de substituição da refeição de manhã e/ou imediatamente após cada exercício . Além disso, os indivíduos foram instruídos a evitar o consumo regular de alimentos conhecidos por ser alta em ácidos graxos ω-3, incluindo o óleo de peixe, óleo de linhaça, peixes de água fria, óleo de oliva, óleo de gergelim, manteiga de amendoim, N-acetil-cisteína, ácido linoléico conjugado, bem como medicamentos anti-inflamatórios, incluindo o paracetamol, o ibuprofeno, aspirina e outros não-esteróides anti-inflamatórios . Ingestão dietética, bem como linoleico (18:2, ω-6), linolénico (18:3, ω-3), e a ingestão de AA foram monitorizadas com recolhas dietéticas de 4 dias nos dias 0, 25 e 50 e avaliadas utilizando o software nutricional do processador alimentar III (ESHA Nutrition Research, Salem, OR).
Resistance-training protocol
Over a 50-day period, subjects completed a 4 day * week-1 split-body, linear periodization resistance-training program. A parte superior do corpo elevadores incluído supino, puxada, press de ombros, sentado linhas, ombro deu de ombros, peito voa, rosca bíceps, tríceps e pressione pendentes enquanto a parte inferior do corpo elevadores incluído leg press, extensão lombar, passo-ups, leg curl, extensão de perna, calcanhar levanta, flexões e abdominais duas vezes por semana. Os indivíduos realizaram 3 conjuntos de 10 repetições com o máximo de peso que podiam elevar por conjunto (ou seja, 60-80% de 1RM). Os períodos de descanso entre exercícios não excederam 3 minutos, enquanto o descanso entre conjuntos não excedeu 2 minutos. O treinamento foi realizado no centro de vida estudantil da Universidade, documentado em registros de treinamento, e assinado por membros da equipe designados para verificar a conformidade e monitorar o progresso. Este protocolo tem sido mostrado em pesquisas anteriores para promover ganhos significativos na força muscular, resistência muscular e massa sem gordura .foram utilizadas análises séricas e do sangue total para avaliar a segurança clínica durante os protocolos de suplementação. Serum samples were assayed for comprehensive metabolic panels including glucose, total protein, blood urea nitrogen (BUN), creatinine, BUN/creatinine ratio, uric acid, aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), creatine kinase (CK), lactate dehydrogenase (LDH), gamma-glutamyl transpeptidase (GGT), albumin, globulin, sodium, chloride, calcium, carbon dioxide, total bilirubin, alkaline phosphatase (ALP), triglycerides, cholesterol, HDL and LDL using a Dade Dimension XL clinical chemistry system (Dade Behring Inc., Newark, DE). Hemograma completo, incluindo as contagens de glóbulos vermelhos, hemoglobina, hematócrito, média de volume da célula, corpuscular média hemoglobina corpuscular média a concentração da hemoglobina, célula vermelha distribuição de largura, branco contagens de leucócitos, neutrófilos, linfócitos, monócitos, eosinófilos e basófilos foram analisados através de citometria de fluxo, usando o Cell-DYN 1800 (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). A fiabilidade dos ensaios (dentro e entre) variou entre 2% e 6% para os ensaios individuais com um coeficiente médio de variação (C V ) de 3,0%. As amostras foram realizadas em duplicado para verificar os resultados se os valores observados estavam fora dos valores de controlo e/ou das normas clínicas de acordo com os procedimentos padrão.
As amostras de soro subsequentes foram posteriormente ensaiadas para cortisol (CORT), testosterona livre (fTEST), testosterona total (tTEST), interleucina-6 (IL-6), prostaglandina E2 (PGE2) e prostaglandina F2a (PGF2a). Testes imunoabsorventes de enzimas comerciais foram usados para analisar as concentrações séricas de PGF2a, PGE2, e IL-6 (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) e CORT, fTEST, e tTEST (Diagnostic Systems Laboratories, Webster, TX). O C V da realização destes ensaios baseados na AIA variou entre 3, 0 e 5, 0%.o isolamento total de ARN do RNA
o RNA celular total foi extraído do homogeneizado de amostras de biopsia com uma solução monofásica de fenol e isotiocianato de guanidina contidos no reagente TRI (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). As concentrações totais de ARN de cada amostra foram determinadas espectrofotometricamente com uma densidade óptica de 260 nm (OD260), com a concentração final ajustada para 200 ng·µl-1 diluindo os extratos totais de ARN brutos em H2O sem nuclease tratada com RCP. Este procedimento demonstrou produzir ARN não degradado, isento de ADN e proteínas, tal como indicado pelas bandas proeminentes de ARN ribossómico 28S e 18S, bem como uma razão OD260/OD280 de aproximadamente 2, 0 . As amostras de ARN foram armazenadas a -80°C até análises posteriores.
transcrição reversa e síntese clonal de ADN
As soluções padronizadas de ARN celular total foram transcritas ao contrário para sintetizar o ADN clonal (cDNA) como descrito anteriormente . Em suma, incubou-se uma mistura de reacção de transcrição reversa a 42°C durante 40 minutos, aqueceu-se a 85°C durante 5 minutos e, em seguida, arrefeceu-se rapidamente no gelo, produzindo o produto cDNA. Começando cDNA modelo concentrações foram padronizadas para 200 ng·µl-1 antes de real-tempo de reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) para a amplificação através da detecção bruto cDNA sintetizado produtos por espectrofotometria em comprimento de onda de 260 nm e a diluição em nuclease livre de H2O. Padronizado cDNA soluções foram congeladas a -80°C até que o real-time RT-PCR foi realizada.
RT-PCR
Anti-senso e o sentido do oligonucleotide pares de primers foram construídos usando comercialmente disponíveis Beacon Designer de software (Bio-Rad, Hercules, CA) a partir de conhecidos mRNA sequências publicadas no GenBank de nucleotídeos e de banco de dados comercialmente sintetizada (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). Os seguintes 5′ sense and 3′ anti-sense oligonucleotide primers foram utilizados para isolar as três isoformas adultas do MHC( Tipo I, IIa, e IIx): MHC MHC mRNA (5 ‘primer: bases 776-796, 3’ primer: bases 1398-1378, GenEMBL AC X06976), Tipo IIa MHC mRNA (5 ‘ primer: bases 1785-1805, 3′ primer: bases 2440-2420, GenEMBL CA AF111784), Tipo IIx MHC de mRNA (5′ primer: bases 1138-1158, 3’ primer: bases 1746-1726, GenEMBL CA AF111785). Estes iniciadores amplificam fragmentos de 141, 145 e 148 pares de base, respectivamente, para Tipo I, IIa, IIx MHC. a β-actina foi utilizada como um padrão de referência externo para detectar uma alteração relativa na quantidade de ARNm alvo , devido à sua consideração como um gene de limpeza interno constitucionalmente expresso, estes iniciadores de β-actina amplificam um fragmento PCR de 135 pares de base. 200 ng de cDNA foi adicionado a cada uma das quatro reações PCR para MHC Tipo I, -IIa, e-IIx, e β-actina. Especificamente, cada reação PCR continha as seguintes misturas: 2 µl de modelo cDNA foi adicionado juntamente com 12,5 µl de Supermix verde 2× SYBR (Bio-Rad, Hercules, CA) , 1,5 µl de iniciadores sensoriais e anti-sensoriais e 7,5 µl de dH2O livre de nucleases]. Cada reação PCR foi amplificada com um termociclador (Bio Rad, Hercules, CA) e a sequência de amplificação envolveu um passo de desnaturação a 95°C por 30 segundos, o primer recozendo a 55°C por 30 segundos, e a extensão a 72°C por 60 segundos . A RT-PCR foi realizada durante 40 ciclos com fluorescência emitida a partir do fluoróforo verde SYBR, sendo medida após cada ciclo. Uma emissão de fluorescência ocorre devido à integração do verde SYBR no cDNA de cadeia dupla produzido durante a reação PCR. Todos os valores CT foram avaliados na porção linear da amplificação e uma análise da curva de fusão do DNA foi realizada após a amplificação para assegurar que os produtos do gene único foram amplificados na ausência de dimeros primários. A quantificação de todos os ARNm foi expressa em relação à expressão β-actina. Uma comparação dos rácios do valor CT foi usada para comparar mudanças na expressão do gene basal entre os grupos AA e PLA. A electroforese em gel de Agarose utilizando alíquotas de 25 µl das misturas de reacção PCR finalizadas foi realizada em 1.5% de géis de agarose utilizando tampão ácido Tris-bórico-EDTA (TBE) e iluminados com um transiluminador UV (Chemi-Doc XRS, Bio-Rad, Hercules, CA) para verificar a amplificação positiva do ARNm-alvo (dados não apresentados) . O C V para MHC I, IIa e IIx foi de 2,06%, 3,18% e 2,73%, respectivamente .
a quantidade total de proteínas musculares
a proteína Total remanescente do procedimento de isolamento do RNA total foi isolada com isopropanol, etanol e cloridrato de guanidina de 0,3 M. A proteína Myofibrillar foi isolada com 0.1% de sulfato de dodecilo de sódio ( SDS), antes de se determinar o teor de proteínas espectrofotometricamente utilizando um ensaio de Bradford com um comprimento de onda de 595 nm. Foi gerada uma curva padrão usando (r2 = 0, 98, P 0, 001) albumina sérica bovina como padrão e representada em relação ao peso húmido muscular . Cada amostra de proteínas foi subsequentemente diluída para 50 µg de proteína por 30 µl de tampão SDS para subsequente imunoblotting. O C V para a proteína myofibrillar era de 2,03%.
MHC proteína isoforma quantificação
A composição de proteína MHC isoformas dentro de cada músculo homogeneizado amostra foi determinada por sistemas automatizados de SDS-PAGE usando Experion Pro260 chips (Bio-Rad, Hercules, CA). Foram pipetadas para cada alvéolo da amostra, no microchip, aproximadamente 6 µl de alíquotas de cada amostra. Cada amostra desconhecida foi preparada a partir de 4 µl de diluição proteica de cada indivíduo (ou 4 µl da escada de massa molecular), 2 µl de tampão de amostra Com β-mercaptoetanol e 84 µl de água desionizada. Com base nos resultados da Gazith e dos seus colegas , esperava-se que as três isoformas MHC migrassem na região de 200-210 kiloDaulton dentro do gel de poliacrilamida em relação à escada de peso molecular. Os gels foram visualizados digitalmente pelo Experion software (Bio-Rad, Hercules, CA) e as concentrações MHC em cada amostra foram avaliadas comparando a densidade arbitrária de cada isoforma MHC com as densidades arbitrárias de marcadores de peso molecular com concentrações conhecidas. O C V de bandas proteicas ≥10 kD foi ≤1, 1%.
Proteína immunoblotting
PGF2a (FP) e PGE2 (EP3) receptor de quantificação foi realizada à temperatura ambiente pela extração total de proteínas do músculo do homogeneizado e slot-blotting de 50 µg de proteína total para membranas de nitrocelulose utilizando um Bio-Dot blotting da proteína do sistema (Bio-Rad, Hercules, CA). As membranas pontilhadas foram incubadas com solução de bloqueio durante 1 hora num roqueiro orbital, decantadas e as membranas foram incubadas com uma solução de lavagem TTBS durante 5 minutos, num total de três lavagens. As membranas foram incubadas com receptores anti-FP específicos e anticorpos policlonais anti-EP3 (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI), diluídos para 4 µg·ml-1, durante 1 a 2 horas num roqueiro orbital. As soluções primárias de anticorpos foram então decantadas e as membranas lavadas com solução de TTBS durante 5 minutos num roqueiro orbital para um total de três lavagens. A solução de lavagem TTBS foi decantada e as membranas foram incubadas com uma solução de anticorpo anti-coelho biotinilado secundário (Bio-Rad, Hercules, CA) durante 1 hora num roqueiro orbital. Continuando, a solução de anticorpos biotinilados de cabra anti-coelho foi decantada e as membranas incubadas em solução de lavagem TTBS num total de três lavagens a 5 minutos por lavagem. As membranas foram incubadas com uma solução complexa de fosfatase alcalina streptavidin-biotinilada (Bio-Rad, Hercules, CA) por 1 hora em um roqueiro orbital. Por último, a solução complexa de fosfatase alcalina streptavidin-biotinilada foi decantada e as membranas lavadas três vezes com solução de TTBS a 5 minutos por lavagem num agitador orbital. A solução de desenvolvimento de cores Contendo BCIP/NBT (Bio-Rad, Hercules, CA) foi adicionada e o desenvolvimento de cores foi monitorado durante 30 – 60 minutos. O desenvolvimento de cores foi interrompido por incubar a membrana em H2O duplamente destilado por 10 minutos em um roqueiro orbital. Membranas pontilhadas foram digitalizadas por meio de densitometria usando um sistema de imagem XRS Chemi-Doc (Bio-Rad, Hercules, CA) e densidade de banda foi expressa em unidades de densidade integrada em relação ao peso muscular.
A análise estatística
a análise estatística foi realizada utilizando SPSS (versão 14.0, SPSS Inc., Chicago, IL). As variáveis de sangue total, soro, desempenho e composição corporal foram analisadas usando 2 × 3 (sessão de teste de grupo × sessão) de análise da variância (ANOVA) com medidas repetidas testes univariados. Os níveis de proteína MHC, FP e EP3 foram analisados utilizando ANOVA separada 2 × 2 (sessão de teste de grupo×) com medidas repetidas. Além disso, em caso de efeito principal significativo para o grupo, ANOVAs de Sentido Único com medidas repetidas em sessões de teste foi realizada para cada grupo para avaliar quaisquer diferenças entre testes. Testes T independentes foram usados para analisar as alterações na expressão MHC mRNA após 50 dias de suplementação. Para além da análise da pontuação bruta, foi realizada a análise da pontuação delta (ou seja, valores do dia 0 subtraídos do dia 25 e/ou 50) para variáveis que exibiam variação externa entre grupos no dia 0. Como mencionado com as pontuações raw, uma análise 2 × 3 (sessão de teste de grupo × sessão) da variância (ANOVA) com medidas repetidas testes univariados foi usado para analisar as pontuações delta para a composição corporal, variáveis de desempenho e concentrações hormonais, enquanto uma 2 × 2 medidas repetidas ANOVA foi usada para analisar todas as pontuações do delta intramuscular. Em circunstâncias em que não era possível assumir variações iguais dentro de grupos, o Fator de correção Hunyhs-Feldt epsilon foi usado para ajustar dentro das razões F do grupo. Em circunstâncias em que pareciam existir tendências estatísticas (P = 0,05 a 0.10), As dimensões dos efeitos também foram reportadas como Eta parcial ao quadrado (np2). Os tamanhos do efeito Eta parcial ao quadrado foram determinados como sendo fracos (np2 ≤ 0,01), médios (np2 = 0,06), fortes = (np2 = 0,14) como descrito anteriormente . A significância para todas as análises estatísticas foi determinada utilizando um nível alfa de 0,05. Deve-se notar que uma análise de potência a priori do projeto indicou que um n-Tamanho de 15 participantes por tratamento daria uma alta potência (> 0,8) para critério valores delta variáveis de 0,75 a 1,25. Deve igualmente notar-se que a análise pós-hoc de casos anómalos utilizando parcelas de caixa foi realizada em circunstâncias em que se verificaram interacções significativas entre grupos × tempo, a fim de assegurar a ausência de casos anómalos. Todos os dados são reportados como médias ± desvios-padrão (DP).