osoby
trzydzieści jeden zdrowych mężczyzn przeszkolonych w zakresie oporności (22,1 ± 5,0 lat, 180 ± 0,1 cm, 86,1 ± 13,0 kg, 18,1 ± 6,4% tkanki tłuszczowej) zostało poinformowanych o protokole badania zatwierdzonym przez Instytut.Komisja Rewizyjna na Uniwersytecie Baylor przed udziałem. Status szkolenia został zgłoszony samodzielnie, a osoby, które nie miały co najmniej rocznego doświadczenia przed rozpoczęciem badań, zostały wykluczone. Ponadto pacjenci zostali wykluczeni, Jeśli: 1) mieli w przeszłości jakiekolwiek choroby metaboliczne, nadciśnienie tętnicze, wątrobowo-nerkowe, mięśniowo-szkieletowe, autoimmunologiczne lub neurologiczne; 2) przyjmowali obecnie leki tarczycowe, przeciwhiperlipidemiczne, hipoglikemiczne, przeciwnadciśnieniowe lub androgenne; oraz 3) przyjmowali suplementy diety, które mogą wpływać na masę mięśniową i/lub poziom hormonów anabolicznych/katabolicznych w ciągu trzech miesięcy od rozpoczęcia badania.
testowanie początkowe
kwalifikujące się osoby zostały zapoznane z protokołem badania poprzez ustne i pisemne wyjaśnienie projektu badania. Testerzy podpisali Oświadczenie o świadomej zgodzie i ukończyli historię osobistą i medyczną, a także ukończyli test zdolności beztlenowej Wingate przed testami bazowymi. Testerom poinstruowano, aby przez 48 godzin powstrzymywali się od intensywnego wysiłku fizycznego i pościli przez 10 godzin przed rozpoczęciem badania początkowego (tj. w dniu 0), które miało miejsce 3-4 dni po zapoznaniu się, aby umożliwić rejestrowanie spożycia w diecie. W badaniu tym zastosowano równoległą metodę podwójnie ślepej próby, kontrolowaną placebo, w której uczestnicy byli dopasowywani równomiernie do grup w zależności od wieku i masy ciała.
protokół doświadczalny
w dniach 0, 25 i 50 każdy pacjent zgłaszał się do laboratorium po 10-godzinnym postie. Wysokość mierzono za pomocą standardowej antropometrii, a całkowitą masę ciała mierzono za pomocą skalibrowanej Healthometer digital tensometer electronic scale (Bridgeview, IL) z dokładnością ± 0,02 kg. Skład ciała określono następnie za pomocą skalibrowanego urządzenia Hologic Discovery W dual-energy x-ray absorptiometer (DXA) (Hologic Inc., Bedford, MA), podczas gdy ciśnienie krwi i tętno spoczynkowe oznaczano za pomocą standardowych procedur. Badani następnie oddali około 25 ml krwi na czczo, stosując standardowe techniki wkłucia dożylnego do badań hematologicznych, klinicznych paneli chemicznych, a następnie analizy cytokin i hormonów. Do uchwytu vacutainera wstawiono dwie probówki vacutainera do separacji 10 ml surowicy i jedną probówkę vacutainera K3 EDTA o pojemności 5 ml w celu pobrania krwi kolejno przy użyciu technik flebotomii z wieloma próbkami. Pełną krew natychmiast analizowano pod kątem pełnej morfologii krwi, podczas gdy probówki z vacutainerem w surowicy wirowano w temperaturze pokojowej przez 15 minut w temperaturze 1500 g, supernatant w surowicy przenoszono do probówek z mikrocentryfugami, a próbki surowicy przechowywano w temperaturze -20°C do dalszych analiz hormonalnych i metabolicznych. Tylko w dniach 0 i 50 pacjenci otrzymywali około 60 mg mięśni szkieletowych z vastus lateralis przy użyciu techniki biopsji Bergstroma. Wytrzymałość górnej i dolnej części ciała oceniano za pomocą standardowych procedur testowych 1RM przy użyciu Wyciskarki stołowej i sanek 35° (Nebula, Versailles, OH). Test-retest niezawodność tych testów wytrzymałościowych na testach odpornościowych w naszym laboratorium dały wysoką niezawodność w wyciskaniu na ławce (r = 0,94) i wyciskaniu nóg (r = 0,91). Po określeniu sań biodrowych 1RM testerzy odpoczywali 10 minut przed zakończeniem 30-sekundowego testu wydolności beztlenowej Wingate na skomputeryzowanym ergometrze rowerowym (Lode Excalibur, Lode, Groningen, Holandia) W celu oceny mocy beztlenowej dolnej części ciała. Test ten polegał na tym, że każdy Tester przez 30 sekund biegał na ergometrze rowerowym w dowolny sposób przy standardowym obciążeniu 0,075 kg·kg-1 masy ciała. Test-retest niezawodność dla absolutnej mocy szczytowej i średniej mocy w naszym laboratorium przyniosły również wysokie wartości niezawodności (r = 0,69 i r = 0.P < 0, 05).
przezskórne biopsje mięśni
biopsje mięśni wykonano w dniach 0 i 50 przed wszystkimi testami wytrzymałości w celu uniknięcia potencjalnego zakłócenia miofibrylarnego spowodowanego wysiłkiem fizycznym . Pacjenci zostali poinstruowani o powstrzymaniu się od ćwiczeń na 48 godzin przed każdą biopsją mięśni. Mięsień Pobrano z bocznej części vastus lateralis w połowie drogi między rzepką a grzebieniem biodrowym dominującej nogi za pomocą 5 mm Igły biopsyjnej z przyłożonym ssaniem . Krótko, 1,5 ml 1.0% lidokainy HCl wstrzyknięto podskórnie przed wykonaniem małego nacięcia pilotażowego. Stosując procedury podwójnego posiekania i stosując ssanie, próbka najpierw usunęła cały widoczny tłuszcz i tkankę łączną, zanim została zamrożona w ciekłym azocie. Następnie wszystkie próbki przechowywano w temperaturze -80°C do późniejszej analizy.
protokół suplementacji i monitorowanie diety
w sposób podwójnie zaślepiony, osoby przyjmujące cztery kapsułki po 250 mg zawierające olej kukurydziany placebo lub AA (X-Factor, Molecular Nutrition, Jupiter, FL) w ciągu 50 dni od rozpoczęcia badania. Suplementy zostały przygotowane w postaci kapsułek i zapakowane w butelki generyczne przez Molecular Nutrition. Zgodność monitorowano poprzez zwracanie pustych butelek z suplementem po 25 i 50 dniach suplementacji. Zgodnie z wcześniejszymi wytycznymi oraz w celu zapewnienia odpowiedniego spożycia energii i białka w celu ułatwienia przerostu mięśni, wszystkim uczestnikom zalecono zwiększenie spożycia kalorii o około 500 kcal·dzień-1, przy jednoczesnym utrzymaniu szacowanego spożycia białka na poziomie 2 g·kg-1·dzień-1 w porównaniu z wyjściową analizą diety . Testerom dostarczono dostępny w handlu proszek zastępujący posiłek (Lean Body, Labrada Nutrition, Houston, TX) zawierający około 290 kilokalorii, 24 g węglowodanów, 45 g białka i 1 g tłuszczu na porcję, próbując dostosować się do wyżej wymienionych wymagań energetycznych i białkowych. W zależności od początkowego spożycia białka, pacjentom zalecano spożycie 1 do 2 opakowań suplementu zastępującego posiłek rano i (lub) bezpośrednio po każdym treningu . Dodatkowo, uczestnicy zostali poinstruowani, aby unikać regularnego spożywania pokarmów, o których wiadomo, że są bogate w kwasy tłuszczowe ω-3, w tym olej rybny, olej lniany, ryby zimnowodne, oliwa z oliwek, olej sezamowy, masło orzechowe, N-acetylo-cysteina, sprzężony kwas linolowy, a także leki przeciwzapalne, w tym paracetamol, ibuprofen, aspiryna i inne niesteroidowe leki przeciwzapalne . Spożycie w diecie, a także linolowy (18: 2, ω-6), linolenowy (18:3, ω-3), a spożycie AA monitorowano za pomocą 4-dniowych przypomnień żywieniowych w dniach 0, 25 i 50 i oceniano za pomocą oprogramowania żywieniowego Food Processor III (Esha Nutrition Research, Salem, OR).
protokół treningu oporowego
w ciągu 50 dni uczestnicy ukończyli 4-dniowy·tydzień-1 program treningu oporowego na rozszczepienie ciała, periodyzację liniową. Górne wyciągi ciała obejmowały wyciskanie na ławce, wyciąganie lat, Prasowanie ramion, siedzące rzędy, wzruszenia ramion, muchy w klatce piersiowej, loki biceps i triceps press-downs, podczas gdy dolne wyciągi ciała obejmowały prasę nóg, przedłużenie pleców, podwyżki, loki nóg, przedłużenie nóg, podnoszenie pięty i brzuszne chrupnięcia dwa razy w tygodniu. Testerzy wykonywali 3 zestawy po 10 powtórzeń z taką masą, jaką mogli podnieść na zestaw (tj. 60-80% 1RM). Okresy odpoczynku między ćwiczeniami nie przekraczały 3 minut, podczas gdy odpoczynek między zestawami nie przekraczał 2 minut. Szkolenie zostało przeprowadzone w centrum życia studenckiego Uniwersytetu, udokumentowane w dziennikach szkoleniowych i podpisane przez wyznaczonych pracowników w celu weryfikacji zgodności i monitorowania postępów. Protokół ten został wykazany we wcześniejszych badaniach w celu promowania znacznego przyrostu siły mięśniowej, wytrzymałości mięśniowej i masy beztłuszczowej .
analizy surowicy i pełnej krwi
próbki surowicy i pełnej krwi zostały wykorzystane do oceny bezpieczeństwa klinicznego podczas protokołów suplementacji. Serum samples were assayed for comprehensive metabolic panels including glucose, total protein, blood urea nitrogen (BUN), creatinine, BUN/creatinine ratio, uric acid, aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), creatine kinase (CK), lactate dehydrogenase (LDH), gamma-glutamyl transpeptidase (GGT), albumin, globulin, sodium, chloride, calcium, carbon dioxide, total bilirubin, alkaline phosphatase (ALP), triglycerides, cholesterol, HDL and LDL using a Dade Dimension XL clinical chemistry system (Dade Behring Inc., Newark, DE). Pełną morfologię krwi, w tym liczbę krwinek czerwonych, hemoglobinę, hematokryt, średnią objętość komórek, średnią hemoglobinę korpuskularną, średnie stężenie hemoglobiny korpuskularnej, szerokość dystrybucji krwinek czerwonych, liczbę krwinek białych, neutrofile, limfocyty, monocyty, eozynofile i bazofile analizowano metodą cytometrii przepływowej przy użyciu komórki-DYN 1800 (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). Test do testowania niezawodności (wewnątrz i pomiędzy) wykonywania tych testów wahał się od 2 do 6% dla indywidualnych testów ze średnim współczynnikiem zmienności (C V) wynoszącym 3,0%. Próbki przeprowadzono w dwóch egzemplarzach, aby zweryfikować wyniki, czy obserwowane wartości były poza wartościami kontrolnymi i / lub normami klinicznymi zgodnie ze standardowymi procedurami.
kolejne próbki surowicy badano na obecność kortyzolu (Cort), wolnego testosteronu (Ftest), całkowitego testosteronu (tTest), interleukiny-6 (IL-6), prostaglandyny E2 (PGE2) i prostaglandyny F2A (PGF2a). Do analizy stężeń PGF2a, PGE2 i IL-6 w surowicy (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) oraz CORT, fTEST i tTEST (Diagnostic systems Laboratories, Webster, TX) wykorzystano komercyjne testy immunoabsorbentu enzymatycznego. Wartość C V w wykonywaniu tych testów opartych na OOŚ wahała się od 3,0 do 5,0%.
całkowita izolacja RNA
całkowite komórkowe RNA ekstrahowano z homogeniatu próbek pobranych z biopsji za pomocą jednofazowego roztworu fenolu i izotiocyjanianu guanidyny zawartego w TRI-odczynniku (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) . Całkowite stężenia RNA z każdej próbki oznaczono spektrofotometrycznie z gęstością optyczną 260 nm (OD260), z końcowym stężeniem dostosowanym do 200 ng·µl-1 przez rozcieńczenie surowych ekstraktów całkowitego RNA do pozbawionego nukleazy H2O traktowanego DEPC. Wykazano, że procedura ta daje niezdegradowany RNA, wolny od DNA i białek, na co wskazują widoczne pasma rybosomalnego RNA 28S i 18S, jak również stosunek OD260/OD280 wynoszący około 2,0 . Próbki RNA przechowywano w temperaturze -80°C do późniejszej analizy.
odwrotna transkrypcja i synteza klonalnego DNA
standaryzowane roztwory całkowitego komórkowego RNA poddano odwrotnej transkrypcji w celu syntezy klonalnego DNA (cDNA), jak opisano wcześniej . Krótko mówiąc, mieszaninę reakcji odwrotnej transkrypcji inkubowano w temperaturze 42°C przez 40 minut, ogrzewano do 85°C przez 5 minut, a następnie szybko schładzano na lodzie, otrzymując produkt cDNA. Początkowe stężenia szablonu cDNA znormalizowano do 200 ng * µl-1 przed amplifikacją łańcuchowej reakcji polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-PCR) przez wykrywanie spektrofotometrycznie surowych produktów syntezy cDNA przy długości fali 260 nm i rozcieńczanie ich w wolnym od nukleaz H2O. znormalizowane roztwory cDNA zamrażano w temperaturze -80°C do czasu wykonania RT-PCR w czasie rzeczywistym.
RT-PCR
Anti-sense I sense oligonucleotide primer par zostały skonstruowane przy użyciu komercyjnie dostępnego oprogramowania Beacon Designer (Bio-Rad, Hercules, CA) ze znanych sekwencji mRNA opublikowanych w GenBank nucleotide database i komercyjnie zsyntetyzowane (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). Do wyizolowania trzech dorosłych izoform MHC (Typ I, IIa i IIx) zastosowano następujące startery 5′ sense I 3 'anti-sense oligonucleotide: typ i MHC mRNA (Starter 5′: Zasady 776-796, Starter 3′: Zasady 1398-1378, GenEMBL AC X06976), Typ IIA MHC mRNA (Starter 5′: Zasady 776-796,: bazy 1785-1805, 3 'primer: bazy 2440-2420, GenEMBL AC AF111784), Typ IIX MHC mRNA (5′ primer: bazy 1138-1158, 3 ’ primer: bazy 1746-1726, GenEMBL AC AF111785). Te startery wzmacniają fragmenty odpowiednio 141, 145 i 148 par zasad dla typu I, IIA, IIX MHC. β-aktyna została użyta jako zewnętrzny standard odniesienia do wykrywania względnej zmiany w ilości docelowego mRNA ze względu na jej rozważenie jako konstytutywnie wyrażonego genu domowy, te startery β-aktyny wzmacniają fragment PCR 135 par zasad. Do każdej z czterech reakcji PCR dla MHC typu I, -IIa i-IIx oraz β-aktyny dodano dwieście ng cDNA. W szczególności, każda reakcja PCR zawierała następujące mieszaniny: dodano 2 µl szablonu cDNA wraz z 12,5 µl 2× SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA), 1,5 µl sensowych i antysensowych starterów i 7,5 µl wolnego od nukleazy dH2O]. Każda reakcja PCR wzmacniano cyklem termicznym (Bio Rad, Hercules, CA), a Sekwencja amplifikacji obejmowała etap denaturacji w temperaturze 95°C przez 30 sekund, wyżarzanie podkładu w temperaturze 55°C przez 30 sekund i przedłużanie w temperaturze 72°C przez 60 sekund . RT-PCR przeprowadzono w ciągu 40 cykli z fluorescencją emitowaną z FLUOROFORU SYBR green mierzoną po każdym cyklu. Emisja fluorescencji następuje w wyniku integracji zieleni SYBR z dwuniciowym cDNA wytwarzanym podczas reakcji PCR. Wszystkie wartości CT oceniano w liniowej części amplifikacji, a po amplifikacji przeprowadzono analizę krzywej topnienia DNA, aby upewnić się, że produkty pojedynczego genu zostały amplifikowane bez primer-dimerów. Oznaczanie ilościowe wszystkich mRNA wyrażono w stosunku do ekspresji β-aktyny. Porównano współczynniki wartości CT w celu porównania zmian ekspresji genu podstawowego między grupami AA i PLA. Elektroforezę w żelu agarozowym z użyciem 25 µl porcji finalizowanych mieszanin reakcyjnych PCR przeprowadzono w 1.5% żeli agarozowych wykorzystuje Bufor 1× Kwas Tris-borowy-EDTA (TBE) i podświetlany transilluminatorem UV (Chemi-Doc XRS, Bio-Rad, Hercules, CA) w celu weryfikacji pozytywnego wzmocnienia docelowego mRNA (dane nie pokazane). C V dla MHC I, IIa i IIX wynosiło odpowiednio 2,06%, 3,18% i 2,73%.
całkowita ilość białka mięśniowego
całkowite białko pozostałe po całkowitej procedurze izolacji RNA wyizolowano izopropanolem, etanolem i 0,3 M chlorowodorkiem guanidyny. Białko miofibrylarne wyizolowano z 0.1% siarczanu dodecylu sodu (SDS) , przed oznaczeniem zawartości białka spektrofotometrycznie przy użyciu testu Bradforda przy długości fali 595 nm. Krzywą standardową wygenerowano stosując (r2 = 0,98, p < 0,001) albuminę surowicy bydlęcej jako standard i reprezentowaną w stosunku do masy mięśniowej mokrej . Każdą próbkę białka rozcieńczono następnie do 50 µg białka na 30 µl buforu SDS w celu późniejszego immunoblottingu. Wartość C V dla białka miofibrylarnego wynosiła 2,03% .
oznaczanie ilości izoform białka MHC
skład izoform białka MHC w każdej próbce homogeniatu mięśniowego określono za pomocą zautomatyzowanego SDS-PAGE z wykorzystaniem chipów Experion Pro260 (Bio-Rad, Hercules, CA). Około 6 µl każdej próbki pipetowano do każdej studni na mikroczipie. Każdą nieznaną próbkę przygotowano z 4 µl rozcieńczenia białka z każdego osobnika (lub 4 µl drabiny masy cząsteczkowej), 2 µl buforu próbki z β-merkaptoetanolem i 84 µl wody dejonizowanej. W oparciu o wyniki badań Gazitha i współpracowników, oczekuje się, że wszystkie trzy izoformy MHC będą migrować w regionie 200-210 kiloDaulton w żelu poliakrylamidowym w stosunku do drabiny masy cząsteczkowej. Żele wizualizowano cyfrowo za pomocą oprogramowania Experion (Bio-Rad, Hercules, CA), a stężenia MHC w każdej próbce oceniano poprzez porównanie arbitralnej gęstości każdej izoformy MHC z arbitralnymi gęstościami markerów masy cząsteczkowej ze znanymi stężeniami. Wartość C V pasm białkowych ≥10 kD wynosiła ≤1,1%.
immunoblotting białek
oznaczanie receptorów PGF2a (FP) i PGE2 (EP3) przeprowadzono w temperaturze pokojowej przez ekstrakcję całkowitego białka mięśniowego z homogeniatu i wytłoczenie 50 µg całkowitego białka na błony nitrocelulozowe za pomocą systemu bio-Dot protein blotting system (Bio-Rad, Hercules, CA). Blotowane membrany inkubowano z roztworem blokującym przez 1 godzinę na kołku orbitalnym, dekantowano, a membrany inkubowano z roztworem myjącym TTBS przez 5 minut, łącznie przez trzy płukania. Membrany inkubowano ze swoistym receptorem anty-FP i przeciwciałami poliklonalnymi przeciw receptorowi anty-EP3 (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI), rozcieńczonymi do 4 µg·ml-1, przez 1 do 2 godzin na orbitalnym rockerze. Roztwory pierwszorzędowych przeciwciał następnie dekantowano i membrany przemywano roztworem TTBS przez 5 minut na kołku orbitalnym przez łącznie trzy płukania. Roztwór do płukania TTBS dekantowano, a membrany inkubowano z wtórnym biotynylowanym kozim roztworem przeciwciała przeciw królikowi (Bio-Rad, Hercules, CA) przez 1 godzinę na orbitalnym rockerze. Kontynuując, wtórny biotynylowany Kozi przeciwciało przeciw królikowi dekantowano i membrany inkubowano w roztworze płuczącym TTBS przez łącznie trzy płukania po 5 minutach na płukanie. Membrany inkubowano z kompleksowym roztworem streptawidyny-biotynylowanej fosfatazy alkalicznej (Bio-Rad, Hercules, CA) przez 1 godzinę na orbicie rocker. Wreszcie, kompleksowy roztwór streptawidyny-biotynylowanej fosfatazy alkalicznej dekantowano i membrany przemywano trzykrotnie roztworem TTBS po 5 minutach na przemywanie na wytrząsarce orbitalnej. Dodano roztwór do rozwoju koloru zawierający BCIP/NBT (Bio-Rad, Hercules, CA) i monitorowano rozwój koloru przez 30 – 60 minut. Rozwój koloru zatrzymano przez inkubację membrany w podwójnie destylowanej H2O przez 10 minut na orbitalnym rockerze. Blotted membrany digitalizowano za pomocą densytometrii za pomocą Chemi-Doc XRS imaging system (Bio-Rad, Hercules, CA) i gęstość pasma wyrażano w zintegrowanych jednostkach gęstości w stosunku do masy mięśniowej.
analiza statystyczna
analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu SPSS (Wersja 14.0, SPSS Inc., Chicago, IL). Analizowano zmienne krwi pełnej, surowicy, wydajności i składu ciała za pomocą analizy wariancji 2 × 3 (grupa × sesja testowa) (ANOVA) z powtarzanymi pomiarami testy univariate. Poziomy białka MHC, FP i białka receptora EP3 analizowano przy użyciu oddzielnego 2 × 2 (Grupa × sesja testowa) ANOVA z powtarzanymi pomiarami. Dodatkowo, w przypadku istotnego efektu głównego dla grupy, dla każdej grupy przeprowadzono jednokierunkowe ANOVAs z powtarzanymi pomiarami na sesjach testowych w celu oceny wszelkich różnic między testami. Do analizy zmian ekspresji mRNA MHC po 50 dniach suplementacji wykorzystano niezależne testy T. Oprócz analizy wyników surowych, przeprowadzono analizę wyników delta (tj. wartości dnia 0 odejmowane od dnia 25 i/lub 50) dla zmiennych, które wykazywały obce różnice między grupami w dniu 0. Jak wspomniano w przypadku surowych wyników, analiza wariancji (ANOVA) 2 × 3 (grupa × sesja testowa) z powtarzanymi miarami testy univariate została wykorzystana do analizy wyników delta dla składu ciała, zmiennych wydajności i stężeń hormonów, podczas gdy powtarzane miary 2 × 2 ANOVA wykorzystano do analizy wszystkich domięśniowych wyników delta. W okolicznościach, w których nie można było zakładać równych wariancji w ramach grup, zastosowano współczynnik korekcji Epsilonu Hunyhsa-Feldta do dostosowania w ramach współczynników grupy F. W okolicznościach, w których pojawiły się tendencje statystyczne (tj. P = 0,05 do 0.10), Rozmiary efektów były również zgłaszane jako częściowe ETA do kwadratu (NP2). Częściowy efekt kwadratowy eta oznaczono jako słaby (NP2 ≤ 0, 01), średni (np2 = 0, 06), silny = (np2 = 0, 14), jak opisano wcześniej . Znaczenie dla wszystkich analiz statystycznych określono na poziomie Alfa 0,05. Należy zauważyć, że analiza mocy a priori projektu wykazała, że rozmiar n 15 uczestników na leczenie dawałby wysoką moc (> 0,8) dla wartości Delta zmiennych kryterium od 0,75 do 1,25. Należy również zauważyć, że post hoc analiza wartości odstających z wykorzystaniem Wykresów pudełkowych została przeprowadzona w okolicznościach, w których występowały znaczące interakcje grupowe × czasowe, aby upewnić się, że nie występują wartości odstające. Wszystkie dane są podawane jako średnie ± odchylenia standardowe (SD).