1 Teoria
Oligonucleotidele sunt sintetizate prin adăugarea unei baze la un moment dat, extinzându-se de la capătul 3′ la capătul 5′, atașat la un suport în fază solidă. Când sinteza chimică a oligonucleotidei este completă, lanțul ADN este eliberat din suportul solid prin incubare cu hidroxid de amoniu. Amoniul acționează, de asemenea, ca un agent deprotector, scindând grupurile care protejează fosfații din legăturile fosfodiesterice. După aceasta, se adaugă amoniac fierbinte pentru a hidroliza grupările protectoare din grupările amino exociclice de deoxiadenozină, deoxicitozină și deoxiguanozină. Oligonucleotida ar putea fi furnizată utilizatorului în soluția de amoniac ca preparat brut. În acest caz, înainte de utilizare, poate fi necesar să se efectueze o etapă suplimentară pentru îndepărtarea sărurilor și a subproduselor din preparatul oligonucleotidic generat în timpul deprotecției.
după deprotecție, preparatul oligonucleotidic este de obicei desaltat, cuantificat, evaporat până la uscare într-un liofilizator și furnizat utilizatorului sub formă de pulbere. Soluția de oligonucleotidă desalată conține oligonucleotida de lungime completă, dar conține și un amestec de produse trunchiate care au fost acumulate în timpul sintezei chimice. Trunchierea are loc atunci când baza specificată nu se adaugă la lanț în ciclul corespunzător (Hecker & Rill, 1998). Astfel, procentul de produse trunchiate acumulate în preparat este determinat de eficiența sintezei (fracția produsului cu lungime completă după sinteză) și de lungimea moleculei. Oligonucleotidele lungi, care necesită sintetizarea mai multor cicluri, sunt mai puțin pure decât oligonucleotidele scurte. Aceste eșecuri pot concura cu produsul de lungime întreagă în unele aplicații și pot necesita îndepărtarea înainte ca oligonucleotida să poată fi utilizată. Cu toate acestea, preparatele oligonucleotidice desalinizate sunt de obicei potrivite pentru multe aplicații, cum ar fi PCR standard sau microarrays, mai ales dacă oligonucleotida are < 20 nucleotide în lungime.
se recomandă o purificare suplimentară pentru oligonucleotide mai lungi de 50 de baze, deoarece procentul de produs cu lungime completă din preparat nu este de obicei mai mare de 80%. Pentru aplicații solicitante în care lungimea exactă a oligonucleotidei este importantă, cum ar fi testele de schimbare a gelului, mutageneza direcționată pe site, secvențierea, producția de adaptoare de clonare sau sinteza ADNc pe prima catenă pentru generarea de biblioteci, se recomandă purificarea suplimentară, chiar și pentru oligonucleotidele mai scurte (a se vedea mai multe informații despre tehnicile de mai sus privind testele Standard in vitro pentru interacțiunile Protein-acid Nucleic-testele de schimbare a gelului pentru legarea ARN și ADN și mutageneza direcționată pe Site).
purificarea poate fi necesară după sinteză sau după modificarea enzimatică a oligonucleotidei. Există mai multe metode pentru a realiza acest lucru, iar alegerea depinde de natura oligonucleotidei și de aplicația pentru care este destinată.
purificarea HPLC în fază inversă se bazează pe hidrofobicitate. Folosește o fază staționară nepolară și tampoane apoase și solvenți organici ca fază mobilă pentru a Eluta analiții; compușii polari sunt eluați mai întâi, în timp ce compușii nepolari sunt reținuți. Aceasta este cea mai bună metodă de purificare a oligonucleotidelor modificate cu o grupare hidrofobă, cum ar fi biotina, etichetele coloranților fluorescenți sau conjugările NHS-ester. Recuperarea în masă este mai mare decât atunci când se utilizează purificarea paginii și este supusă purificării unor cantități mai mari de oligonucleotide (scară mmol), deși nu elimină produsele incomplete atât de eficient. Cartușele de purificare a oligonucleotidelor, bazate pe cromatografia în fază inversă, oferă o metodă rapidă de desalinizare și purificare a oligonucleotidelor.
electroforeza pe gel de poliacrilamidă (PAGE) rezolvă oligonucleotidele în funcție de lungimea lor și oferă astfel o rezoluție suficientă pentru a diferenția produsele de lungime completă de moleculele eșuate (Atkinson și Smith, 1984). Gelurile de poliacrilamidă sunt mai eficiente pentru separarea fragmentelor mici de ADN decât gelurile de agaroză (vezi analiza ARN prin electroforeza analitică a gelului de poliacrilamidă și electroforeza gelului de agaroză). Singurul dezavantaj al gelurilor de poliacrilamidă este că sunt mai dificil de preparat și manipulat decât gelurile de agaroză. Gelurile de poliacrilamidă sunt rulate într-o configurație verticală într-un câmp electric constant. După electroforeză, oligonucleotida este eluată din gel și concentrată, folosind precipitarea etanolului (găsiți mai multe despre precipitarea acizilor nucleici pe metodele de purificare a ARN – precipitare) sau cromatografia în fază inversă. Aceasta este metoda de alegere atunci când cel mai mare procent de oligonucleotide de lungime întreagă este dorit pentru aplicații solicitante. De asemenea, este recomandat pentru oligonucleotide mai lungi de 30 de baze. De asemenea, mai multe eșantioane pot fi rulate simultan și nu este necesar un echipament scump. Singurul dezavantaj al acestei tehnici este cantitatea mică de oligonucleotidă obținută pe purificare. În mod tipic, oligonucleotidele sunt utilizate la scara de 1 unktmol sau mai puțin, iar recuperarea în masă după purificarea paginii este < 50% și chiar mai mică în cazul oligonucleotidelor modificate. Cu toate acestea, deși randamentul este scăzut, este satisfăcător pentru majoritatea aplicațiilor biochimice.
preparatul oligonucleotidic este încărcat pe un gel de poliacrilamidă denaturat la o cantitate de cel puțin 1 mg pe bandă. Gama de rezoluție a gelului depinde de concentrația de poliacrilamidă. Pentru oligonucleotidele scurte (de la 15 la 35 de baze), se recomandă geluri de poliacrilamidă 13-15%; pentru oligonucleotidele mai lungi (de la 35 la 70 de baze), se recomandă geluri de poliacrilamidă 8-13%. Procentul gelului trebuie adaptat la sistemul de rulare. De obicei folosim sistemul Bio-Rad Mini Protean II și rulăm geluri de 15% pentru a purifica oligonucleotidele de 25 de baze în lungime. După identificarea benzii corecte prin Vizualizare UV, banda este excizată și extrasă din gel.două metode diferite de purificare a oligonucleotidelor din gelurile de poliacrilamidă sunt descrise în acest capitol. Cea mai simplă metodă este eluția prin difuzie. Aceasta se bazează pe mișcarea moleculelor dintr-o regiune cu concentrație mai mare la una cu o concentrație mai mică. Rezultatul difuziei este o amestecare treptată a materialului. Această metodă este consumatoare de timp, dar nu necesită prea multă muncă sau orice echipament. Practic, banda de poliacrilamidă care conține oligonucleotida de interes este tăiată în bucăți mici și acoperită cu tampon de eluție. După incubare, ADN-ul este purificat din supernatant prin precipitarea etanolului. Randamentul este limitat, între 20% și 70%, în funcție de lungimea oligonucleotidei. Cu cât este mai mare cantitatea de tampon de eluție utilizată, cu atât mai multă oligonucleotidă este difuzată din gel.
a doua metodă este electroeluția într-o pungă de dializă (McDonell și colab., 1977). Piesa de gel care conține oligonucleotida este excizată și plasată într-o pungă de dializă cu un tampon. Aplicarea unui curent electric face ca ADN-ul să migreze din gel în tamponul sacului de dializă. Oligonucleotida este recuperată din acest tampon și purificată. Folosind această metodă, oligonucleotida poate fi izolată cu un randament bun, deși consumă mult timp dacă un număr mare de probe sunt purificate în același timp, deoarece necesită introducerea fiecărei benzi de gel în pungi individuale de dializă. Această metodă funcționează bine și pentru fragmente de ADN mai mari și poate fi utilizată chiar și pentru extragerea ADN-ului din gelurile de agaroză.