proefpersonen
eenendertig gezonde, resistance-trained males (22,1 ± 5,0 jaar, 180 ± 0,1 cm, 86,1 ± 13,0 kg, 18,1 ± 6,4% lichaamsvet) werden geïnformeerd over het door de Institutional Review Board van Baylor University goedgekeurde studieprotocol voorafgaand aan deelname. De trainingsstatus werd zelf gemeld en personen die niet ten minste één jaar ervaring hadden voorafgaand aan de studie werden uitgesloten. Bovendien werden proefpersonen uitgesloten als ze: 1) een voorgeschiedenis hadden van metabole, hypertensie, hepatorenale, musculoskeletale, auto-immuunziekte of neurologische ziekte; 2) momenteel schildklier -, antihyperlipidemische, hypoglycemische, antihypertensieve of androgene geneesmiddelen gebruikten; en 3) voedingssupplementen hadden ingenomen die de spiermassa en/of de anabole/katabole hormoonspiegels kunnen beïnvloeden binnen drie maanden na aanvang van het onderzoek.
Baseline testing
geschikte proefpersonen werden vertrouwd gemaakt met het onderzoeksprotocol via een mondelinge en schriftelijke uitleg van de onderzoeksopzet. Proefpersonen ondertekenden een informed consent statement en voltooiden persoonlijke en medische geschiedenissen terwijl ze ook een Wingate anaërobe capaciteitstest voltooiden voorafgaand aan de baseline test. De proefpersonen werden geïnstrueerd zich gedurende 48 uur van zware inspanning te onthouden en gedurende 10 uur te vasten voorafgaand aan de baseline-test (d.w.z. dag 0), die 3-4 dagen na de vertrouwdmaking optrad om registratie van de inname via de voeding mogelijk te maken. Deze studie gebruikte een dubbelblinde, placebogecontroleerde, parallelle studieontwerp waarbij de proefpersonen gelijkmatig in clusters volgens leeftijd en lichaamsmassa werden gematcht.
experimenteel protocol
gedurende de dagen 0, 25 en 50 werd elke proefpersoon na een vasten van 10 uur aan het laboratorium gemeld. De hoogte werd gemeten met behulp van standaard antropometrie en de totale lichaamsmassa werd gemeten met behulp van een gekalibreerde Healthometer digital strain gauge electronic scale (Bridgeview, IL) met een precisie van ± 0,02 kg. Vervolgens werd de lichaamssamenstelling bepaald met behulp van een gekalibreerd Hologic Discovery W dual-energy x-ray absorptiometer (DXA) (Hologic Inc., Bedford, MA), terwijl de bloeddruk en de hartslag in rust werden bepaald met behulp van standaardprocedures. Proefpersonen doneerden vervolgens ongeveer 25 ml nuchter bloed met behulp van standaard vlindernaald (=aderpunctietechnieken) voor hematologische, klinische chemiepanelen en later cytokine-en hormoonanalyse. Twee 10 ml serumscheidingsvacuutainer tubes en een 5 ml K3 EDTA vacutainer tube werden ingebracht in de vacutainer houder voor bloedinzameling achtereenvolgens met behulp van meerdere Monster flebotomie technieken. Volbloed werd onmiddellijk geanalyseerd voor een volledig bloedbeeld, terwijl serum vacutainer tubes werden gecentrifugeerd bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten bij 1500 g, het serum supernatant werd overgebracht in microcentrifugebuizen, en de serummonsters werden opgeslagen bij -20°C voor daaropvolgende hormonale en metabolite analyses. Alleen op dag 0 en 50 doneerden proefpersonen ongeveer 60 mg skeletspieren van de vastus lateralis met behulp van de biopsie-techniek van Bergstrom. De sterkte van het boven-en onderlichaam werd beoordeeld met behulp van standaard 1RM-testprocedures met een bankpers en een 35° heup-sledemachine (Nebula, Versailles, OH). Test-hertest betrouwbaarheid van deze sterktetests bij weerstandsgetrainde proefpersonen in ons laboratorium hebben een hoge betrouwbaarheid opgeleverd voor de bankpers (r = 0,94) en de beenpers (r = 0,91). Na bepaling van de heupslee 1RM rustten de proefpersonen 10 minuten voor het voltooien van een 30 seconden Wingate anaërobe capaciteitstest op een computergestuurde fietsergometer (Lode Excalibur, Lode, Groningen, Nederland) om het anaërobe vermogen van het onderlichaam te beoordelen. Deze test bestond uit het hebben van elke proefpersoon sprint op een all-out manier op de fiets ergometer voor 30 seconden tegen een standaard belasting van 0,075 kg·kg-1 van het lichaamsgewicht. Test-hertest betrouwbaarheid voor absolute piekvermogen en gemiddelde vermogen in ons laboratorium hebben ook hoge betrouwbaarheidswaarden opgeleverd (r = 0,69 en r = 0.P < 0,05).
percutane spierbiopten
spierbiopten werden genomen op dag 0 en 50 voorafgaand aan alle sterktetests om mogelijke myofibrillaire verstoring door inspanning te voorkomen . De proefpersonen werden geïnstrueerd zich 48 uur voor elke spierbiopsie van inspanning te onthouden. De spier werd uit het laterale gedeelte van de vastus lateralis geëxtraheerd halverwege de knieschijf en de iliacekam van het dominante been met behulp van een 5 mm biopsienaald met aangezette zuiging . Kort 1,5 ml van 1.0% Lidocainehcl werd subcutaan ingespoten alvorens een kleine proefinsnijding te maken. Gebruikend double-chop procedures en toegepaste zuigkracht, had het specimen eerst al zichtbaar vet en bindweefsel verwijderd alvorens flits in vloeibare stikstof wordt bevroren. Alle monsters werden vervolgens bij -80°C bewaard tot latere analyses.
Suppletieprotocol en dieetmonitoring
dubbelblind innamen proefpersonen vier capsules van 250 mg die een placebo of AZ (X-Factor, Molecular Nutrition, Jupiter, FL) bevatten gedurende 50 dagen na de baseline test. Supplementen werden bereid in capsulevorm en verpakt in generieke flessen door moleculaire voeding. De therapietrouw werd gecontroleerd door proefpersonen lege supplementflacons terug te laten geven na 25 en 50 dagen suppletie. In overeenstemming met eerdere richtlijnen en in een poging om ervoor te zorgen dat de energie-en eiwitinname voldoende waren om spierhypertrofie te vergemakkelijken, werden alle proefpersonen geïnstrueerd om de calorie-inname te verhogen met ongeveer 500 kcal·dag-1, terwijl ook een geschatte eiwitinname van 2 g·kg-1·dag-1 wordt gehandhaafd in vergelijking met de basislijn dieetanalyse . De proefpersonen kregen een in de handel verkrijgbaar maaltijdvervangende poeder (Lean Body, Labrada Nutrition, Houston, TX) met ongeveer 290 kilocalorieën, 24 g koolhydraten, 45 g eiwitten en 1 g vet per portie in een poging aan de bovengenoemde energie-en eiwitbehoeften te voldoen. Afhankelijk van de uitgangswaarde van de eiwitinname werd de proefpersonen verteld om ‘ s ochtends en/of onmiddellijk na elke training 1 tot 2 pakjes van het maaltijdvervangende supplement in te nemen . Bovendien werden proefpersonen geïnstrueerd om regelmatige consumptie te vermijden van voedingsmiddelen waarvan bekend is dat ze hoog in ω-3-vetzuren zitten, waaronder visolie, lijnzaadolie, koudwatervis, olijfolie, sesamolie, pindakaas, N-acetyl-cysteïne, geconjugeerd linolzuur, evenals ontstekingsremmende medicijnen zoals acetaminofen, ibuprofen, aspirine en andere niet-steroïde ontstekingsremmende geneesmiddelen . Voedingsinname evenals linolzuur (18: 2, ω-6), linoleenzuur (18:3, ω-3), en AA-inname werden gecontroleerd met 4-daagse dieetherinneringen op dag 0, 25 en 50 en beoordeeld met behulp van de Food Processor III Nutrition Software (ESHA Nutrition Research, Salem, OR).
Resistance-training protocol
gedurende een periode van 50 dagen voltooiden de proefpersonen een 4 daagse·week-1 split-body, linear periodization resistance-training programma. Bovenlichaam liften opgenomen bench press, lat pull, shoulder press, zittende rijen, schouder shrugs, Borst vliegen, biceps krullen, en triceps press-downs terwijl onderlichaam liften opgenomen been druk, rugverlenging, step ups, been krullen, beenverlenging, hiel verhoogt, en abdominale crunches twee keer per week. Proefpersonen voerden 3 sets van 10 herhalingen uit met zoveel gewicht als ze per set konden tillen (d.w.z. 60-80% van 1RM). De rusttijden tussen de oefeningen waren niet langer dan 3 minuten, terwijl de rust tussen de sets niet langer was dan 2 minuten. Training werd uitgevoerd op de Universiteit student life center, gedocumenteerd in de training logs, en ondertekend door aangewezen medewerkers om de naleving te controleren en de voortgang te controleren. Dit protocol is getoond in voorafgaand onderzoek om significante aanwinsten in spierkracht, spierduurzaamheid, en vette vrije massa te bevorderen .
Serum-en volbloedanalyses
Serum-en volbloedmonsters werden gebruikt om de klinische veiligheid tijdens de suppletieprotocollen te evalueren. Serum samples were assayed for comprehensive metabolic panels including glucose, total protein, blood urea nitrogen (BUN), creatinine, BUN/creatinine ratio, uric acid, aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), creatine kinase (CK), lactate dehydrogenase (LDH), gamma-glutamyl transpeptidase (GGT), albumin, globulin, sodium, chloride, calcium, carbon dioxide, total bilirubin, alkaline phosphatase (ALP), triglycerides, cholesterol, HDL and LDL using a Dade Dimension XL clinical chemistry system (Dade Behring Inc., Newark, DE). Volledige bloedceltellingen inclusief het aantal rode bloedcellen, hemoglobine, hematocriet, gemiddeld celvolume, gemiddeld corpusculair hemoglobine, gemiddelde corpusculaire hemoglobineconcentratie, breedte van de distributie van rode bloedcellen, aantal witte bloedcellen, neutrofielen, lymfocyten, monocyten, eosinofielen en basofielen werden geanalyseerd via flow-cytometrie met behulp van de cel-DYN 1800 (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). De test om de betrouwbaarheid (binnen en tussen) van het uitvoeren van deze tests te testen varieerde van 2 tot 6% voor individuele tests met een gemiddelde variatiecoëfficiënt (C V ) van 3,0%. Monsters werden in duplo uitgevoerd om de resultaten te verifiëren of de waargenomen waarden buiten de controlewaarden en/of klinische normen vielen volgens standaardprocedures.
daaropvolgende serummonsters werden later onderzocht op cortisol( CORT), vrij testosteron (fTEST), totaal testosteron (TTEST), interleukine-6 (IL-6), prostaglandine E2 (PGE2) en prostaglandine F2a (PGF2a). De immunoabsorberende analyses van het commericalenzym werden gebruikt om serumconcentraties van PGF2a, PGE2, en IL-6 (Caymanchemical, Ann Arbor, MI) en CORT, fTEST, en tTEST (Diagnostic Systems Laboratories, Webster, TX) te analyseren. De C V van het uitvoeren van deze EIA-gebaseerde analyses varieerde van 3,0 tot 5,0%.
totale RNA-isolatie
totaal cellulair RNA werd geëxtraheerd uit het homogenaat van biopsiemonsters met een monofasische oplossing van fenol en guanidine-isothiocyanaat in het TRI-reagens (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). De totale RNA-concentraties van elk monster werden spectrofotometrisch bepaald met een optische dichtheid van 260 nm (OD260), waarbij de uiteindelijke concentratie werd aangepast tot 200 ng·µl-1 door de ruwe totale RNA-extracten te verdunnen tot nucleasevrij H2o, behandeld met dePC. Deze procedure is getoond om niet-gedegradeerd RNA op te leveren, vrij van DNA en proteã nen zoals aangewezen door prominente 28S en 18S ribosomal de bands van RNA, evenals een OD260/OD280 Verhouding van ongeveer 2,0 . De monsters van RNA werden opgeslagen bij -80°C tot latere analyses.
omgekeerde transcriptie en klonale DNA-synthese
De gestandaardiseerde oplossingen van totaal cellulair RNA werden omgekeerd getranscribeerd om klonaal DNA (cDNA) te synthetiseren zoals eerder beschreven . Kortom, een reverse transcriptie reactiemengsel werd geïncubeerd bij 42°C gedurende 40 minuten, verwarmd tot 85°C gedurende 5 minuten, en vervolgens snel gekoeld op ijs waardoor het cDNA product. Het starten van cDNA template concentraties werden gestandaardiseerd op 200 ng * µl-1 voorafgaand aan real-time polymerasekettingreactie (RT-PCR) amplificatie door het detecteren van ruwe cDNA gesynthetiseerde producten spectrofotometrisch bij een golflengte van 260 nm en het verdunnen van hen in nucleasevrije H2o. de gestandaardiseerde cDNA oplossingen werden bevroren bij -80°C totdat real-time RT-PCR werd uitgevoerd.
RT-PCR
anti-sense en sense oligonucleotide primerparen werden geconstrueerd met commercieel beschikbare Beacon Designer software (Bio-Rad, Hercules, CA) uit bekende mRNA sequenties gepubliceerd in de GenBank nucleotide database en commercieel gesynthetiseerd (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). De volgende 5′ sense en 3 ‘anti-sense oligonucleotide primers werden gebruikt om de drie volwassen MHC isovormen (Type I, IIa en IIx) te isoleren: type I MHC mRNA (5’ primer: bases 776-796, 3 ‘primer: bases 1398-1378, GenEMBL AC X06976), Type IIa MHC mRNA (5’ primer: bases 1785-1805, 3 ‘primer: bases 2440-2420, GenEMBL AC AF111784), Type IIX MHC mRNA (5′ primer: bases 1138-1158, 3’ primer: bases 1746-1726, GenEMBL AC AF111785). Deze primers versterken fragmenten van 141, 145, en 148 basisparen, respectievelijk, voor Type I, IIa, IIX MHC. β-actin werd gebruikt als externe verwijzingsnorm voor het ontdekken van relatieve verandering in de hoeveelheid doelmrna toe te schrijven aan zijn overweging als constitutief uitgedrukt huishoud gen , versterken deze β-actin primers een PCR-fragment van 135 basisparen. Tweehonderd ng van cDNA werd toegevoegd aan elk van de vier PCR reacties voor MHC Type I, – IIa, en-IIx, en β-actin. In het bijzonder bevatte elke PCR-reactie de volgende mengsels: 2 µl cDNA-sjabloon werd toegevoegd, samen met 12,5 µl 2× SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules , CA), 1,5 µl sense-en anti-sense-primers en 7,5 µl nucleasevrij dH2O]. Elke PCR-reactie werd versterkt met een thermische cycler (Bio Rad, Hercules, CA) en de amplificatiesequentie omvatte een denaturatiestap bij 95°C gedurende 30 seconden, primer gloeien bij 55°C gedurende 30 seconden, en verlenging bij 72°C gedurende 60 seconden . RT-PCR werd uitgevoerd over 40 cycli met uitgezonden fluorescentie van SYBR groene fluorophore die na elke cyclus worden gemeten. Een emissie van fluorescentie komt wegens de integratie van SYBR-groen in dubbelstrengs cDNA voor die tijdens de PCR-reactie wordt veroorzaakt. Alle CT-waarden werden beoordeeld in het lineaire gedeelte van de amplificatie en na de amplificatie werd een DNA-smeltkromme-analyse uitgevoerd om te verzekeren dat de afzonderlijke genproducten werden versterkt in afwezigheid van primer-dimeren. De kwantificering van al mRNA werd uitgedrukt ten opzichte van β-actin uitdrukking. Een vergelijking van CT-waardeverhoudingen werd gebruikt om veranderingen in basale genexpressie tussen de groepen AA en PLA te vergelijken. Agarosegelelektroforese met 25 µl aliquots van de afgewerkte PCR-reactiemengsels werd uitgevoerd in 1.5% agarose gels met 1 × Tris-boorzuur-EDTA (TBE) buffer en verlicht met een UV-transilluminator (Chemi-Doc XRS, Bio-Rad, Hercules, CA) om positieve versterking van target mRNA te verifiëren (gegevens niet getoond) . De C V voor MHC I, IIa en IIx waren respectievelijk 2,06%, 3,18% en 2,73%.
totale hoeveelheid spiereiwit
totaal restant eiwit van de totale RNA-isolatieprocedure werd geïsoleerd met isopropanol, ethanol en 0,3 M guanidinehydrochloride. Myofibrillar eiwit werd geïsoleerd met 0.1% natriumdodecylsulfaat (SDS) , voordat het eiwitgehalte spectrofotometrisch wordt bepaald met behulp van een Bradford-test bij een golflengte van 595 nm. Een standaardcurve werd gegenereerd met (r2 = 0,98, P < 0,001) bovine serumalbumine als standaard en vertegenwoordigd ten opzichte van het natte spiergewicht . Elk eiwitmonster werd vervolgens verdund tot 50 µg eiwit per SDS-buffer van 30 µl voor latere immunoblotting. De C V voor myofibrillar proteïne was 2,03% .
MHC-eiwitisovormkwantificatie
de samenstelling van MHC-eiwitisovormen in elk monster van spierhomogenaat werd bepaald met behulp van geautomatiseerde SDS-PAGE met behulp van Experion Pro260-chips (Bio-Rad, Hercules, CA). Ongeveer 6 µl aliquots van elk monster werden pipetted in elk monster putje op de microchip. Elk onbekend monster werd bereid uit 4 µl van de eiwitverdunning van elke proefpersoon (of 4 µl van de molecuulgewichtladder), 2 µl monsterbuffer met β-mercaptoethanol en 84 µl gedeïoniseerd water. Op basis van de bevindingen van Gazith en collega ‘ s werd verwacht dat alle drie MHC-isovormen zouden migreren in het 200-210 kiloDaulton-gebied binnen de polyacrylamidegel ten opzichte van de molecuulgewichtladder. De gels werden digitaal gevisualiseerd door de Experion software (Bio-Rad, Hercules, CA) en MHC concentraties in elk monster werden beoordeeld door de willekeurige dichtheid van elke MHC isovorm te vergelijken met de willekeurige dichtheid van molecuulgewichtmarkers met bekende concentraties. De C V van eiwitbanden ≥10 kD waren ≤1,1%.
Eiwitimmunoblotting
PGF2a (FP) en PGE2 (EP3) receptor kwantificering werd uitgevoerd bij kamertemperatuur door het totale spiereiwit uit het homogenaat te extraheren en 50 µg van het totale eiwit op nitrocellulosemembranen te verwijderen met behulp van een Bio-Dot eiwitblotting systeem (Bio-Rad, Hercules, CA). De blotted membranen werden geïncubeerd met blokkeeroplossing gedurende 1 uur op een orbitale rocker, gedecanteerd en membranen werden geïncubeerd met een ttbs-wasoplossing gedurende 5 minuten voor in totaal drie wasbeurten. De membranen werden geïncubeerd met specifieke anti-FP receptor en anti-EP3 receptor polyclonale antilichamen (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI), verdund tot 4 µg·ml-1, gedurende 1 tot 2 uur op een orbitale rocker. Primaire antilichaamoplossingen werden vervolgens gedecanteerd en de membranen werden gedurende 5 minuten gewassen met ttbs-oplossing op een orbitale rocker voor in totaal drie wasbeurten. De ttbs wash oplossing werd gedecanteerd en de membranen werden geïncubeerd met een secundaire biotinyleerde geit anti-konijn antilichaam oplossing (Bio-Rad, Hercules, CA) gedurende 1 uur op een orbitale rocker. De secundaire gebiotinyleerde anti-konijn antilichaamoplossing van geiten werd gedecanteerd en de membranen werden geïncubeerd in ttbs-wasoplossing gedurende in totaal drie wasbeurten met 5 minuten per wasbeurt. De membranen werden gedurende 1 uur geïncubeerd met een streptavidin-biotinylated alkalische fosfatase complexe oplossing (Bio-Rad, Hercules, CA) op een orbitale rocker. Tenslotte werd de streptavidin-biotinylated alkalische fosfatase complexe oplossing gedecanteerd en werden de membranen driemaal gewassen met ttbs-oplossing bij 5 minuten per wasbeurt met een orbitale shaker. Kleurontwikkelingsoplossing met BCIP/NBT (Bio-Rad, Hercules, CA) werd toegevoegd en kleurontwikkeling werd gedurende 30 – 60 minuten gemonitord. De kleurontwikkeling werd gestopt door het membraan in dubbel gedestilleerd H2O gedurende 10 minuten op een orbitale rocker te incuberen. De gevlekte membranen werden gedigitaliseerd door middel van densitometrie met behulp van een Chemi-Doc XRS beeldvormingssysteem (Bio-Rad, Hercules, CA) en de banddichtheid werd uitgedrukt in geïntegreerde dichtheidseenheden ten opzichte van het spiergewicht.
statistische analyse
statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van SPSS (versie 14.0, SPSS Inc., Chicago, IL). Volbloed, serum, prestatie en lichaamssamenstelling variabelen werden geanalyseerd met behulp van 2 × 3 (groep × testsessie) analyse van variantie (ANOVA) met herhaalde metingen univariate tests. MHC eiwit, FP en EP3 receptor eiwit niveaus werden geanalyseerd met behulp van afzonderlijke 2 × 2 (groep × testsessie) ANOVA met herhaalde maatregelen. Bovendien werd in het geval van een significant hoofdeffect voor de groep eenrichtingsanova ‘ s met herhaalde metingen tijdens testsessies uitgevoerd voor elke groep om eventuele verschillen tussen de tests te beoordelen. Onafhankelijke t-tests werden gebruikt om de veranderingen in MHC mRNA uitdrukking na 50 dagen van aanvulling te analyseren. Naast de raw-score-analyse werd delta-score-analyse (d.w.z. dag 0-waarden afgetrokken van dag 25 en/of 50) uitgevoerd voor variabelen die vreemde variatie tussen groepen vertoonden op dag 0. Zoals vermeld met ruwe scores, werd een 2 × 3 (groep × testsessie) analyse van variantie (ANOVA) met herhaalde metingen univariate tests gebruikt om deltascores te analyseren voor lichaamssamenstelling, prestatievariabelen en hormoonconcentraties, terwijl een 2 × 2 herhaalde metingen ANOVA werd gebruikt om alle intramusculaire deltascores te analyseren. In omstandigheden waarin gelijke verschillen binnen groepen niet konden worden aangenomen, werd de hunyhs-Feldt Epsilon correctiefactor gebruikt om binnen Groep F-ratio ‘ s aan te passen. In omstandigheden waarin statistische trends bleken te bestaan (d.w.z. P = 0,05 tot 0.10) werden ook effectgroottes gerapporteerd als partieel ETA kwadraat (np2). Partiële ETA kwadraat effect maten werden bepaald zwak (NP2 ≤ 0,01), medium (np2 = 0,06), sterk = (np2 = 0,14) zoals eerder beschreven . De significantie voor alle statistische analyses werd bepaald met behulp van een alfaniveau van 0,05. Opgemerkt dient te worden dat een a priori vermogensanalyse van het ontwerp heeft uitgewezen dat een n-grootte van 15 deelnemers per behandeling een hoog vermogen (> 0,8) zou opleveren voor criterium variabele delta-waarden van 0,75 tot 1,25. Er zij ook op gewezen dat een post-hoc-uitbijteranalyse met behulp van boxplots is uitgevoerd in omstandigheden waarin sprake was van significante interacties tussen groepen en tijd om te garanderen dat er geen uitbijters aanwezig waren. Alle gegevens worden gerapporteerd als gemiddelden ± standaarddeviaties (SD).