Fag
Trettien friske, motstandstrenede menn (22,1 ± 5,0 år, 180 ± 0,1 cm, 86,1 ± 13,0 kg, 18,1 ± 6,4% kroppsfett) ble informert om studieprotokoll godkjent Av Institutional Review Board på baylor university før deltakelse. Opplæringsstatus var selvrapportert, og personer som manglet minst ett års erfaring før studien ble ekskludert. I tillegg ble forsøkspersoner ekskludert hvis de: 1) hadde noen historie med metabolsk, hypertensjon, hepatorenal, muskuloskeletale, autoimmune eller nevrologiske sykdommer; 2) for tiden tok skjoldbrusk, antihyperlipidemisk, hypoglykemisk, antihypertensiv eller androgen medisiner; og 3) hadde tatt kosttilskudd som kan påvirke muskelmasse og / eller anabole / katabolske hormonnivåer innen tre måneder etter oppstart av studien.
Baseline testing
Kvalifiserte personer ble kjent med studieprotokollen via en muntlig og skriftlig forklaring av studiedesignet. Forsøkspersoner signerte en informert samtykkeerklæring og fullførte personlige og medisinske historier samtidig som de fullførte En Wingate anaerob kapasitetstest før baseline testing. Forsøkspersonene ble bedt om å avstå fra anstrengende trening i 48 timer og faste i 10 timer før baseline testing (dvs. dag 0) som inntraff 3-4 dager etter familiarisering for å tillate registrering av diettinntak. Denne studien benyttet en dobbeltblind, placebokontrollert, parallell studiedesign hvor forsøkspersonene ble matchet jevnt i klynger i henhold til alder og kroppsmasse.
Eksperimentell protokoll
i løpet av dagene 0, 25 og 50 rapporterte hvert individ til laboratoriet etter en 10-timers rask. Høyde ble målt ved bruk av standard antropometri, og total kroppsmasse ble målt ved bruk Av en kalibrert Healthometer digital strain gauge elektronisk skala (Bridgeview, IL)med en presisjon på 0,02 kg. Kroppssammensetningen ble deretter bestemt ved hjelp av en kalibrert Hologic Discovery W dual-energy x-ray absorptiometer (Dxa) enhet (Hologic Inc., Bedford, MA), mens blodtrykk og hvilepuls ble bestemt ved hjelp av standardprosedyrer. Pasienter donerte deretter ca 25 ml fastende blod ved hjelp av standard venepunkturteknikker for hematologiske, kliniske kjemipaneler og senere cytokin-og hormonanalyse. To 10 ml serumseparasjon vacutainer-rør og ett 5 ml K3 EDTA vacutainer-rør ble satt inn i vacutainer-holderen for blodprøvetaking i rekkefølge ved bruk av flebotomiteknikker med flere prøver. Fullblod ble umiddelbart analysert for en fullstendig blodtelling mens serum vacutainer-rør ble sentrifugert ved romtemperatur i 15 min ved 1500 g, serum-supernatanten ble overført til mikrosentrifugerør, og serumprøvene ble lagret ved -20°C for påfølgende hormon-og metabolittanalyser. Bare på dag 0 og 50 donerte forsøkspersonene omtrent 60 mg skjelettmuskulatur fra vastus lateralis ved Hjelp Av Bergstrom biopsi-teknikken. Øvre og nedre kroppsstyrke ble vurdert ved hjelp av standard 1rm testprosedyrer med en benkpress og 35° hip sled maskin (Nebula, Versailles, OH). Test-retest pålitelighet av disse styrketestene på motstandstrente fag i vårt laboratorium har gitt høy pålitelighet for benkpressen (r = 0,94) og benpress (r = 0,91). Etter bestemmelse av hip sled 1RM hvilte pasientene 10 minutter før de fullførte en 30 sekunder Wingate anaerob kapasitetstest på et datastyrt ergometer (Lode Excalibur, Lode, Groningen, Nederland) for å vurdere underkroppens anaerob kraft. Denne testen besto av å ha hvert fag sprint i en helt ut mote på sykkel ergometer i 30 sekunder mot en standard arbeidsbelastning på 0.075 kg * kg-1 kroppsvekt. Test-retest pålitelighet for absolutt toppeffekt og gjennomsnittlig effekt i vårt laboratorium har også gitt høye pålitelighetsverdier (r = 0,69 og r = 0.95, henholdsvis P < 0,05).
Perkutane muskelbiopsier
Muskelbiopsier ble tatt på dag 0 og 50 før alle styrketester for å unngå potensielle myofibrillarforstyrrelser på grunn av trening . Forsøkspersonene ble bedt om å avstå fra trening 48 timer før hver muskelbiopsi. Muskel ble ekstrahert fra den laterale delen av vastus lateralis midt mellom patella og iliac crest av den dominerende ben ved hjelp av en 5 mm biopsi nål med påført sug . Kort, 1,5 ml av 1.0% Lidokain HCl ble injisert subkutant før et lite pilotinnsnitt ble gjort. Ved hjelp av dobbelthakkeprosedyrer og påført suging, hadde prøven først alt synlig fett og bindevev fjernet før det ble frosset i flytende nitrogen. Alle prøvene ble deretter lagret på -80°C til senere analyser.
Tilleggsprotokoll og diettovervåking
på en dobbeltblind måte inntok forsøkspersonene fire 250 mg kapsler som inneholdt placebo eller AA (x-Factor, Molecular Nutrition, Jupiter, FL) i løpet av 50 dager etter baseline testing. Kosttilskudd ble fremstilt i kapselform og pakket i generiske flasker Ved Molekylær Ernæring. Compliance ble overvåket ved å ha fag tilbake tomme supplement flasker etter 25 og 50 dager med tilskudd. I samsvar med tidligere retningslinjer og i et forsøk på å sikre at energi-og proteininntaket var tilstrekkelig til å lette muskelhypertrofi, ble alle forsøkspersonene instruert til å øke kaloriinntaket med ca. 500 kcal * dag-1, samtidig som man opprettholdt et estimert proteininntak på 2 g * kg-1 * dag-1 sammenlignet med baseline kostanalyse . Emner ble gitt et kommersielt tilgjengelig måltidserstatningspulver (Lean Body, Labrada Nutrition, Houston, TX) som inneholdt ca. 290 kilokalorier, 24 g karbohydrat, 45 g protein og 1 g fett per porsjon i et forsøk på å imøtekomme ovennevnte energi-og proteinbehov. Avhengig av baseline proteininntak, ble fagene fortalt å innta 1 til 2 pakker av måltidsutskiftningstilskuddet om morgenen og / eller umiddelbart etter hver treningsøkt . I tillegg ble forsøkspersonene instruert om å unngå regelmessig forbruk av matvarer som er kjent for å være høye i ω – 3 fettsyrer, inkludert fiskeolje, linfrøolje, kaldvannsfisk, olivenolje, sesamolje, peanøttsmør, n-acetyl-cystein, konjugert linolsyre, samt antiinflammatoriske medisiner, inkludert acetaminophen, ibuprofen, aspirin og andre ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler . Diettinntak samt linolsyre (18: 2, ω-6), linolensyre( 18:3, ω-3) og AA-inntak ble overvåket med 4-dagers tilbakekalling av kosttilskudd på dag 0, 25 og 50 og vurdert ved Hjelp Av Food Processor III-Ernæringsprogramvaren (ESHA Nutrition Research, Salem, OR).
Resistance-training protocol
over en 50-dagers periode fullførte fagene et 4-dagers * uke-1 split-body, lineært periodiseringsmotstandsopplæringsprogram. Overkroppen heiser inkludert benkpress, lat pull, skulderpress, sittende rader, skulder shrugs, bryst fluer, biceps krøller, og triceps trykk-downs mens lavere kroppen heiser inkludert leg press, tilbake forlengelse, step ups, leg krøller, leg extension, hæl reiser, og abdominal crunches to ganger per uke. Emner utførte 3 sett med 10 repetisjoner med så mye vekt som de kunne løfte per sett (dvs. 60-80% AV 1RM). Hvileperioder mellom øvelser oversteg ikke 3 minutter, mens resten mellom settene ikke oversteg 2 minutter. Opplæringen ble gjennomført ved universitetets studentlivssenter, dokumentert i treningslogger, og signert av utpekte medarbeidere for å verifisere samsvar og overvåke fremgang. Denne protokollen har blitt vist i tidligere forskning for å fremme betydelige gevinster i muskelstyrke, muskulær utholdenhet og fettfri masse .
Serum-og helblodanalyser
Serum-og helblodprøver ble brukt til å evaluere klinisk sikkerhet under tilskuddsprotokollene. Serum samples were assayed for comprehensive metabolic panels including glucose, total protein, blood urea nitrogen (BUN), creatinine, BUN/creatinine ratio, uric acid, aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), creatine kinase (CK), lactate dehydrogenase (LDH), gamma-glutamyl transpeptidase (GGT), albumin, globulin, sodium, chloride, calcium, carbon dioxide, total bilirubin, alkaline phosphatase (ALP), triglycerides, cholesterol, HDL and LDL using a Dade Dimension XL clinical chemistry system (Dade Behring Inc., Newark, DE). Komplette blodceller inkludert antall røde blodceller, hemoglobin, hematokrit, gjennomsnittlig cellevolum, gjennomsnittlig korpuskulært hemoglobin, gjennomsnittlig korpuskulært hemoglobinkonsentrasjon, distribusjonsbredde for røde blodceller, antall hvite blodceller, nøytrofiler, lymfocytter, monocytter, eosinofiler og basofiler ble analysert via flowcytometri ved Bruk Av Cellen-DYN 1800 (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). Test for å teste pålitelighet (innenfor og mellom) for å utføre disse analysene varierte fra 2 til 6% for individuelle analyser med en gjennomsnittlig variasjonskoeffisient (C V ) på 3,0%. Prøver ble kjørt i to eksemplarer for å verifisere resultatene dersom de observerte verdiene var utenfor kontrollverdier og / eller kliniske normer i henhold til standardprosedyrer.Påfølgende serumprøver ble senere analysert for kortisol (CORT), fritt testosteron (fTEST), totalt testosteron (tTEST), interleukin-6 (IL-6), prostaglandin E2 (PGE2) og prostaglandin F2a (PGF2a). Kommersielle enzymimmunoabsorberende analyser ble brukt til å analysere serumkonsentrasjoner Av PGF2a, PGE2 og IL-6 (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) og CORT, fTEST og tTEST (Diagnostic Systems Laboratories, Webster, TX). C V for å utføre DISSE EIA-baserte analysene varierte fra 3,0 til 5,0%.
Total rna-isolasjon
Totalt cellulært RNA ble ekstrahert fra homogenatet av biopsiprøver med en monofasisk løsning av fenol og guanidinisotiocyanat inneholdt I tri-reagenset (Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO) . Totale rna-konsentrasjoner fra hver prøve ble bestemt spektrofotometrisk med en optisk tetthet på 260 nm (OD260), med endelig konsentrasjon justert til 200 ng·µ-1 ved å fortynne de totale rna-ekstraktene til DEPC-behandlet nukleasefri H2O. Denne prosedyren har vist seg å gi u-degradert RNA, fri FOR DNA og proteiner som indikert av fremtredende 28s og 18s ribosomale rna-bånd, samt ET OD260 / OD280-forhold på omtrent 2,0 . RNA-prøvene ble lagret ved -80°C til senere analyser.
Revers transkripsjon og klonal DNA-syntese
de standardiserte løsningene av totalt cellulært RNA ble omvendt transkribert for å syntetisere klonal DNA (cDNA) som beskrevet tidligere . Kort sagt ble en omvendt transkripsjonsreaksjonsblanding inkubert ved 42°C i 40 minutter, oppvarmet til 85°C i 5 minutter, og deretter hurtigkjølt på is som ga cDNA-produktet. Oppstart av cDNA – malkonsentrasjoner ble standardisert til 200 ng·µ-1 før real-time polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) forsterkning ved å oppdage rå cDNA-syntetiserte produkter spektrofotometrisk ved en bølgelengde på 260 nm og fortynne dem i nukleasefri H2O. de standardiserte cDNA-løsningene ble frosset ved -80°C til RT-PCR i sanntid ble utført.
RT-PCR
anti-sense og sense oligonucleotide primer parene ble konstruert ved hjelp av kommersielt tilgjengelig Beacon Designer programvare (Bio-Rad, Hercules, CA) fra kjente mRNA sekvenser publisert I GenBank nucleotide database og kommersielt syntetisert (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). Følgende 5′ sense og 3 ‘anti-sense oligonukleotid-primere ble brukt til å isolere de tre VOKSNE MHC-isoformene (type I, IIa og Iix): TYPE I MHC mRNA (5′ PRIMER: baser 776-796, 3’ primer: baser 1398-1378, GenEMBL AC X06976), Type IIA MHC mRNA (5 ‘ primer: baser 1785-1805, 3 ‘primer: baser 2440-2420, GenEMBL AC AF111784), Type IIX MHC mRNA (5’ primer: baser 1138-1158, 3 ‘ primer: baser 1746-1726, GenEMBL AC AF111785). Disse primerne forsterker fragmenter av henholdsvis 141, 145 og 148 basepar For TYPE I, IIa, IIX MHC. β-actin ble brukt som en ekstern referansestandard for å oppdage relativ endring i mengden av mål-mRNA på grunn av sin vurdering som et konstitusjonelt uttrykt housekeeping-gen forsterker disse β-actin-primere ET PCR-fragment på 135 basepar. To hundre ng cDNA ble lagt til hver AV DE fire PCR-reaksjonene FOR MHC type I, -IIa, Og-IIx og β-actin. Spesifikt inneholdt hver PCR-reaksjon følgende blandinger: 2 hryvnl av cDNA-mal ble tilsatt sammen med 12.5 µ AV 2× SYBR Grønn Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA) , 1.5 µ av sense-og anti-sense-primere og 7.5 µ nukleasfri dH2O]. HVER PCR-reaksjon ble forsterket med en termisk syklusbryter (Bio Rad, Hercules, CA), og forsterkningssekvensen innebar et denatureringstrinn ved 95 hryvnias C i 30 sekunder, primerglødning ved 55 hryvnias C i 30 sekunder og forlengelse ved 72 hryvnias C i 60 sekunder . RT-PCR ble utført over 40 sykluser med emittert fluorescens fra SYBR grønn fluorofor måles etter hver syklus. En utslipp av fluorescens oppstår på grunn av integrasjonen AV SYBR green i den dobbeltstrengede cDNA produsert under PCR-reaksjonen. ALLE CT-verdier ble vurdert i den lineære delen av amplifiseringen, OG EN DNA-smeltekurveanalyse ble utført etter amplifikasjon for å sikre at enkeltgenproduktene ble forsterket i fravær av primerdimerer. Kvantifisering av alle mRNA ble uttrykt i forhold til β-actin uttrykk. EN sammenligning AV CT-verdiforhold ble brukt til å sammenligne endringer i basal genuttrykk mellom AA-og PLA-gruppene. Agarosegelelektroforese ved bruk av 25 µ av DE ferdige PCR-reaksjonsblandingene ble utført i 1.5% agarosegeler ved bruk av 1× Tris-Borsyre-EDTA (TBE) buffer og belyst MED UV-transilluminator (Chemi-Doc XRS, Bio-Rad, Hercules, CA) for å verifisere positiv forsterkning av mål-mRNA (data ikke vist). C-V FOR MHC I, IIa og iix var henholdsvis 2,06%, 3,18% og 2,73%.
total kvantifisering av muskelprotein
Totalt protein som ble igjen fra total rna-isolasjonsprosedyren ble isolert med isopropanol, etanol og 0,3 M guanidinhydroklorid. Myofibrillarprotein ble isolert med 0.1% natriumdodecylsulfat (SDS) , før proteininnholdet bestemmes spektrofotometrisk ved Bruk Av En Bradford-analyse ved en bølgelengde på 595 nm. En standardkurve ble generert ved bruk av (r2 = 0,98, P < 0,001) bovint serumalbumin som standard og representert i forhold til muskel våtvekt . Hver proteinprøve ble deretter fortynnet til 50 µ protein per 30 µ SDS-buffer for påfølgende immunoblotting. C-V for myofibrillarprotein var 2,03% .
mhc protein isoform kvantifisering
sammensetningen AV MHC protein isoformer i hver muskel homogenat prøve ble bestemt av automatisert SDS-SIDE ved Hjelp Av Experion Pro260 chips (Bio-Rad, Hercules, CA). Omtrent 6 µ av hver prøve ble pipettert inn i hver prøvebrønn på mikrochip. Hver ukjente prøve ble utarbeidet fra 4 ④l av proteinfortynningen fra hver forsøksperson (eller 4 µ i molekylvektstigen), 2 µ i prøvebuffer med β-merkaptoetanol og 84 µ i avionisert vann. Basert På Funnene Fra Gazith og kolleger , ble alle TRE MHC-isoformene forventet å migrere i 200-210 kiloDaulton-regionen i polyakrylamidgelen i forhold til molekylvektstigen. Gelene ble digitalt visualisert av Experion-programvaren (Bio-Rad, Hercules, CA) og MHC-konsentrasjoner i hver prøve ble vurdert ved å sammenligne vilkårlig tetthet av HVER MHC-isoform med vilkårlig tetthet av molekylvektmarkører med kjente konsentrasjoner. C-V for proteinbånd ≥10 kD var ≤1.1%.
proteinimmunoblotting
pgf2a (FP) og PGE2 (EP3) reseptorkvantitasjon ble utført ved romtemperatur ved å trekke ut totalt muskelprotein fra homogenat og slot-blotting 50 µ av totalt protein på nitrocellulosemembraner ved Bruk Av Et Bio-Dot proteinblotting system (Bio-Rad, Hercules, CA). De blottede membranene ble inkubert med blokkeringsløsning i 1 time på en orbital rocker, dekantert og membraner ble inkubert med EN ttbs vaskeløsning i 5 minutter for totalt tre vasker. Membranene ble inkubert med spesifikke anti-FP-reseptor og anti-EP3-reseptor polyklonale antistoffer (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI), fortynnet til 4 µ * ml-1, i 1 til 2 timer på en orbital rocker. Primære antistoffløsninger ble deretter dekantert og membranene vasket MED TTBS-oppløsning i 5 minutter på en orbital rocker i totalt tre vasker. TTBS vaskeoppløsning ble dekantert og membranene ble inkubert med en sekundær biotinylert geit anti-kanin antistoffløsning (Bio-Rad, Hercules, CA) i 1 time på en orbital rocker. Fortsatt ble den sekundære biotinylerte geit anti-kanin antistoffløsningen dekantert og membranene inkubert I TTBS vaskeløsning for totalt tre vasker ved 5 minutter per vask. Membranene ble inkubert med en streptavidin-biotinylert alkalisk fosfatase kompleks løsning (Bio-Rad, Hercules, CA) i 1 time på en orbital rocker. Endelig ble den streptavidin-biotinylerte alkaliske fosfatasekompleksoppløsningen dekantert og membranene vasket tre ganger med TTBS-oppløsning ved 5 minutter per vask på en orbital shaker. Fargeutviklingsløsning som inneholder BCIP / NBT (Bio-Rad, Hercules, CA) ble tilsatt og fargeutvikling ble overvåket over 30-60 minutter. Fargeutviklingen ble stoppet ved å inkubere membranen i dobbeltdestillert H2O i 10 minutter på en orbital rocker. Blotted membraner ble digitalisert ved hjelp av densitometri ved hjelp Av Et Chemi-Doc XRS imaging system (Bio-Rad, Hercules, CA) og båndtetthet ble uttrykt i integrerte tetthetsenheter i forhold til muskelvekt.
Statistisk analyse
Statistiske analyser ble utført MED SPSS (versjon 14.0, SPSS Inc.(Chicago, IL). Fullblod -, serum -, prestasjons-og kroppssammensetningsvariabler ble analysert ved bruk av 2 × 3 (gruppe × testsesjon) variansanalyse (ANOVA) med gjentatte målinger univariate tester. MHC-protein -, FP-og EP3-reseptorproteinnivåer ble analysert ved bruk av separat 2 × 2 (gruppe × testøkt) ANOVA med gjentatte tiltak. I tillegg, i tilfelle av signifikant hovedeffekt for gruppen, ble enveis ANOVAs med gjentatte tiltak på testøkter utført for hver gruppe for å vurdere eventuelle forskjeller mellom testene. Uavhengige t-tester ble brukt til å analysere endringene I MHC mRNA uttrykk etter 50 dager med tilskudd. I tillegg til raw-skåreanalyse ble delta-skåreanalyse (dvs. dag 0-verdier trukket fra dag 25 og/eller 50) utført for variabler som viste fremmed variasjon mellom grupper på dag 0. Som nevnt med rå score ble det brukt en 2 × 3 (gruppe × testsesjon) analyse av varians (ANOVA) med gjentatte mål univariate tester for å analysere delta-score for kroppssammensetning, ytelsesvariabler og hormonkonsentrasjoner, mens en 2 × 2 gjentatte mål ANOVA ble brukt til å analysere alle intramuskulære delta-score. I tilfeller der like variasjoner innen grupper ikke kunne antas, Ble Hunyhs-Feldt epsilon-korreksjonsfaktoren brukt til å justere innen gruppe F-forhold. I tilfeller der statistiske trender syntes å eksistere (dvs. P = 0,05 til 0.10) ble effektstørrelser også rapportert som delvis eta-kvadrert (np2). Partielle eta-kvadrerte effektstørrelser ble bestemt å være svake (np2 ≤ 0,01), middels (np2 = 0,06), sterk = (np2 = 0,14) som tidligere beskrevet . Signifikans for alle statistiske analyser ble bestemt ved bruk av et alfanivå på 0,05. Det skal bemerkes at en a priori effektanalyse av designet indikerte at en n-størrelse på 15 deltakere per behandling ville gi høy effekt (> 0,8) for kriterievariable delta-verdier på 0,75 til 1,25. Det skal også bemerkes at post hoc outlier-analyse ved bruk av boksplott ble utført under omstendigheter der det var signifikante gruppekursinteraksjoner for å sikre at det ikke var noen avvikere tilstede. Alle data rapporteres som betyr ± standardavvik (SD).