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셀 문화
인 흑색 멜 Z,멜 IL,와 멜 MTP 세포에서 얻을 수 있었 종양의 재료를 받는 환자 치료에 N. 국가 너무 늦 의학 연구의 중심 oncology50. BJ-5ta 섬유 아세포 및 유방암 SK-BR-3 세포는 ATCC 에서였다. 다른 세포는 Drs.E.Svirchevskaya 와 E 에 의해 친절하게 제공되었습니다. Kovalenko(Shemyakin-Ovchinnikov Institute Of Bioorganic Chemistry RAS,모스크바,러시아). 모든 세포에서 재배된 경우-1640 성장 매체 보충 10%FBS,2μМ L-글루타민,100µg/mL 수트렙토마이신,그리고 100U/mL 페니실린 37°C 에서는 5%의 CO2 가습됩니다. 매체는 3-4 일마다 교체되었습니다. Cary50UV-Vis 분광 광도계를 사용하여 dmso 세포 용 해물(ml 당 106 세포)에서 흡수 스펙트럼을 측정하여 멜라닌 함량을 추정했습니다.
cytometry
세포 수확 Versene 솔루션,산탄 원심분리하여 300g5 분,및 resuspended 에서는 경우-1640 미디어지 않고 혈청 마지막의 농도가 106 세포당 ml. 이어서,100μl 의 세포 현탁액을 유동 세포 계측법을 위해 광 보호 튜브로 옮겼다. Rpmi-1640 배지에서 FMN 의 적절한 작업 용액을 실험 직전에 준비 하였다. 이들 FMN 용액을 튜브에 첨가하고,최종 FMN 농도는 10μm,30μm 및 100μm 이었다. 이어서,세포를 30 분 동안 이산화탄소 배양기에서 어둠 속에서 배양 하였다. 배양 말기에,1ml 의 차가운 PBS 를 각 튜브에 첨가하고,세포를 5 분 동안 원심 분리(300g,4°C)하였다. 상청액을 제거하고 세포를 300μl 의 차가운 PBS 에서 resuspended 하고 얼음으로 옮겼다. 유세포계 NovoCyte2000R(ACEA Biosciences)및 NovoExpress v.1.2.4 소프트웨어를 사용하여 형광을 조사 하였다. Fitc 형광에 상응하는 채널에서 형광을 측정하고,각 샘플에 대해 적어도 10,000 개의 이벤트를 조사 하였다. 를 추정하는 축적 수준의 FMN,세포에서 중간 형광 값에서 각 샘플이 결정되었고,그 상대 형광준(F)에 따라 계산한 수식은 다음과 같습니다.
Confocal microscopy
세포에서 시드 a96-well 플레이트(5×103 당 셀라)다음으로 하룻밤 incubation. 그런 다음,100µL 의 적절한 작업 솔루션의 FMN(10µM,30μm 및 100μm)의 경우-1640 중에 추가되었 세포 및판 배양에 진 CO2 인큐베이터에 대한 30 분입니다. 그 후,세포를 차가운 PBS 로 3 회 세척하고 15 분 동안 Hoechst33258 염료(50μm)로 추가로 염색 하였다. Incell Analyzer6000 을 사용하고 Cell Analyzer Workstation 소프트웨어 v.3.7.3(GE Healthcare,USA)에서 광학 이미지 및 형광 강도 데이터를 획득했습니다.
세포 독성 연구
세포를 96-웰 플레이트(웰 당 5×103 세포)에 시드하여 밤새 배양 하였다. 전체 RPMI-1640 배지에서 FMN 의 적절한 작업 용액을 실험 직전에 준비 하였다. 이어서,배지를 96-웰 플레이트로부터 제거하고 fmn 용액 aliquots(100μl)를 각각의 웰에 첨가 하였다. FMN 광 활성화를 유도하기 위해,플레이트를 450nm 의 빛,조사 용량 0.2J/cm2–7J/cm2 로 처리 하였다. 어떤 치료도받지 않은 세포를 대조군으로 사용 하였다(100%). 세포 생존력은 48h 배양 후 MTT 분석법에 의해 결정되었다. 이러한 목적,세포 치료를 했 MTT 솔루션(0.5mg/ml 경우-1640)3h. 그 중 대체되었으로 100μl of DMSO 하기 위해서 용해 형성되는 포르마잔을 결정합니다. 570nm 에서의 광학 밀도(od)는 Varioskan Flash reader(THERMO Scientific,USA)를 사용하여 측정되었습니다. Fmn 처리 후 세포(V)의 생존력은 다음 식에 따른 대조군과 비교하여%로 표현되었다:
목표로 결정하는 세포 독성 FMN photoproducts,적당한 작업 솔루션의 FMN 전체 경우-1640 매체들을 조사 450nm(5J/cm2)그리고 배양한다. 그런 다음 이들 FMN aliquots(100μl)를 세포에 첨가하고 48 시간 동안 배양 하였다.mtt 분석법은 전술 한 바와 같이 수행되었다.
목표로 결정하는 선생님 중재 광독성,FMN 솔루션 부분 표본(100μl)에 추가되었는 각론으로 처리에서 빛 450nm(5J/cm2). FMN-이 포함된 미디어를 즉시 제거 후 처리 및세포를 배양에 신선한 경우-1640 미디어 for48h. MTT assay 었으로 수행됩니다.
아폽토시스 및 괴사 분석
세포를 96-웰 플레이트(웰 당 5×103 세포)에 시드하여 밤새 배양 하였다. 그런 다음,100µL 의 적절한 작업 솔루션의 FMN(10µM,30μm 및 100μm)의 경우-1640 중에 추가되었 세포 및판 배양에 진 CO2 인큐베이터에 대한 30 분입니다. 그 후,5J/cm2 의 용량으로 450nm 레이저를 사용하여 세포를 조사 하였다. 이어서,세포를 차가운 PBS 및 결합 완충액으로 일관되게 세척하고 결합 완충액에서 실온에서 Annexin V-FITC,propidium iodide(PI)및 Hoechst33258 로 15 분 동안 염색 하였다. Incell Analyzer6000 을 사용하고 Cell Analyzer Workstation 소프트웨어 v.3.7.3(GE Healthcare,USA)에서 광학 이미지 및 형광 강도 데이터를 획득했습니다.
전극이 생산
탄소 nanoelectrodes 이 새겨져 있었에 0.1M NaOH,10mM KCl 솔루션 중에는 30~40 주기 위해 각각 10 초간을 만들에 구멍 탄소 표면입니다. 적용되는 잠재력을 V 자 형태로 진폭의 1.5–2V. 플래티넘착했을 실시 청소하여 잠재적인 0 에서 -1500mV 대 Ag/AgCl 가 포함된 솔루션에서 2mM chloroplatinic 산(H2PtCl6,Sigma). 주기적 가져온된 voltammograms 를 계산 하 여 자세하게 1mM ferrocene 메탄올(FcMeOH,Sigma)얻었다 초기에 대한 탄소 전극에 대한 전극으로 nanocavities 및 플래티넘을 제어하는 생산 공정을 지원합니다. 의 증착 Pt 만 약간 증가 효과적인 기하학적 표면적의 nanoelectrode(에 의해 입증 voltammogram 의 산화를 위해 1mM FcMeOH),그러나 극적으로 강화된 촉매 활동을 향한 선생님 감소입니다. 이 nanoelectrode 었 편광 600mV 대 Ag/AgCl(보급에 대한 제한의 탐지 H2O2)및 수동으로 접근하는 액체 또는 표면의 하나의 암 세포입니다. 에 대한 보정이 우리 사용되는 솔루션과 다른 농도의 H2O2(시그마)의 범위에서 10-7-10-4M.
선생님 측정과 전기화학적 조사
서 얻어진 결과로 그것을 설명했다 earlier47 으로 어떤 변화가 있습니다. 따라서,도입되는 수정의 전극에 사용되는 이 작업은 더 나 접착 플래티넘의 탄소전극으로 인해 에칭에 구멍 탄소 층 전 Pt deposition. 직경 100-500nm 의 석영(ICAPPIC Limited,UK)에서 분리 된 시판 디스크 모양의 탄소 나노 전자가 ROS 검출을위한 센서 생산에 사용되었습니다. 전극의 상대적으로 불활성 인 탄소 표면은 산화 환원 활성 종의 검출을 위해 추가로 기능화되었다. 는 전해 플래티넘 레이어를 향상 electrocatalytic 활동을 현저하게 줄여 overpotential 에 의해 생산의 감소는 활성 산소. 탄소 플러그에 대한 백금의 접착력을 향상시키기 위해 탄소 전극에 나노 캐비티를 에칭했습니다. 우리는 탄소 나노 전자 장치 51 의 팁에 작은 노치를 만들기 위해 전기 화학적 방법을 사용했습니다. 백금 나노 센서의 제조는 알칼리성 용액에서의 에칭과 플라틴 화의 두 단계로 수행되었다. 모든 단계는 전기 화학적 측정에 의해 정확하게 제어되었습니다. 우리는 나노 전자가 수명이 짧고 수명이 긴 ROS 형태 모두에 민감하다고 생각합니다. 최근에는 우리는 시연합 내의 산소 생산 수용액의 플 라빈 mononucleotide(FMN)에 의해 유도 된 푸른 빛의 조사. 이 결과를 바탕으로 우리가 보여(추가 데이터 9)응답의 탄소 nanoelectrode 극화에+800mV 대 Ag/AgCl 에 선생님에서 생산의 수용액 FMN 아래에 파란색 빛의 조사.
세포를 밤새 배양 한 다음 배양 접시에 시드시켰다. 이어서,세포를 어둠 속에서 100μm FMN 으로 30 분 동안 배양하고 PBS 로 3 회 세척 하였다. 그런 다음,platinized nanoelectrode 신중하게 도입하여 사용하여 정확한 micromanipulator 으로 단일 세포에서는 광학과 제어 거꾸로 현미경으로 관찰합니다. 전극 조작 및 조정을 위해 우리는 micromanipulator PatchStar(Scientifica,UK)를 사용했습니다. 우리는 패치 클램프 증폭기 모델 2400(A-M Systems,USA)을 사용하여 순환 전압계 데이터를 수집했습니다. 신호의 기록은 다기능 I/O 장치 USB-6211(NATIONAL instruments,USA)및 컴퓨터 프로그램 WinWCP 로 수행되었습니다. 모든 측정은 반전 현미경 니콘(일본)의 테이블에서 수행되었다. 모든 측정에서 ag/AgCl 전극을 기준 전극으로 사용 하였다.
형광 프로브를 사용한 ROS 측정
세포질 ROS 의 평가는 CellROX Deep Red 형광 프로브(분자 프로브/Thermo)를 사용하여 수행되었습니다. 간단히,Mel IL 및 M-3 흑색 종 세포(5×103)를 96-웰 플레이트(Nunc,덴마크)에서 시드하고 30 분 동안 전체 RPMI-1640 배지에서 2.5μm 의 CellROX Deep Red 로 배양하고 PBS 에서 3 회 세척 하였다. 다음 100µL 의 적절한 작업 솔루션(10µM,30μm 및 100μm)의 FMN 에는 경우-1640 매체없이 석탄산 빨간에 추가되었 세포 및판 배양에 진 CO2 인큐베이터에 대한 30 분입니다. 그 후,5J/cm2 의 용량으로 450nm 레이저를 사용하여 세포를 조사 하였다. 세포핵을 15 분 동안 50μm 의 Hoechst33258 염료 용액에 의해 추가로 염색 하였다. 광학적인 이미지와 CellROX 깊은 빨간 형광 강도 데이터의 멜 IL 및 A375 흑색종 세포들을 사용하여 획득 InCell 분석기 6000 및 세포 분석기 워크스테이션 소프트웨어 v.3.7.3(GE 건강 관리,USA).
멜라닌 함량 측정
우리가 사용하는 일상적인 분석 결과에 대한 분광 광도법 멜라닌 결정한 사소한 changes52. 네 흑색종 세포 라인:멜 MTP,멜 IL,멜 Z,A375 두 정상(human keratinocytes HaCaT 과 인간 피부에 게재 BJ-5ta)세포 라인을 계산하고 산탄을 갖기 위해서는 최종 농도의 2×106cells/ml. 세포 내 멜라닌 함량 측정을 위해,세포 펠릿을 10%(v/v)DMSO 를 함유하는 1m NaOH 에 용해시키고 1h 동안 80℃에서 배양 하였다. 배양 후 용해물을 원심 분리(5 분 동안 3000g)하고 405nm 에서 세포가없는 배지에서 흡광도를 측정 하였다. 는 모든 결과는 표현으로 평균 값의 흡광도를 강도를 정상화하는 멜라닌의 콘텐츠에 게재±표준편차(SD)에 세 개의 독립적인 실험입니다. 통계 분석은 GraphPad Prism 버전 5.0(GraphPad Software,LA Jolla CALIFORNIA USA)으로 수행되었습니다.
동물 실험
치료의 기본 종양
남성 Balb/c 뉴/뉴 쥐 6~7 세 주에서 구입 한 농장 동물의 Shemyakin–Ovchinnikov 연구소의 생유기화학,러시아 과학 아카데미 및에서 보관되어 있어 환경 조건에서 배출되는 동물 캐비닛 상자 80(Noroit,프랑스)에서 12 시간 어두운 빛을 주기에 대한 액세스를 허용 멸균 물 SPF-마우스 우다. 모든 동물 실험에서 수행에 따라 유럽 및 러시아어 국가의 지침은 동물을 위한 실험 및 승인되었으로 동물과 윤리 위원회의 FSBSI”N. 너무 늦 NMRCO”,참조 번호 2017-034.
을 설정하는 뇌종양 마우스 모델 멜 IL 및 A375 셀 수확 Versene 솔루션,산탄 원심분리하여 300g5 분,및 resuspended 에서는 경우-1640 미디어지 않고 혈청. 흑색 종 세포 현탁액을 혼합 하였다(1:1 볼륨)마트리겔(BD 생명과학부),고 얻어진 셀룰라 현탁액(2×106 세포당 주입)이식했 피하으로 오른쪽 측면 쥐의하여 종양을 성공적으로 시작 및 종양의 성장을 측정합니다.
fmn 의 투여는 종양 크기가 100-120mm3 에 도달했을 때 접종 후 10 일째에 시작되었다. FMN 솔루션(150µl,10μg/ml)었으로 주입된 쥐의 정맥을 통해 복고 궤도상 부비동,그리고 종양 조사와 푸른 빛 450nm 에서 15 분을 위해 최종 용량의 20J/cm2 입니다.
종양한 볼륨 추정에 의해 표준의 방법 calipation 및 계산,다음과 같은 식으로 가정 hemi-타원형 모양
Antitumor 활동의 photoactivated FMN 결정을 평가하여 종양의 성장 저해율(TGI%)으로 계산됩:
Photodynamic 치료의 먼 종양
우리는 우리 사용되는 C57BL/6 쥐에서 6~7 주의 나이에서 구입 한 농장 동물의 Shemyakin–Ovchinnikov 연구소의 생유기화학,러시아 과학 아카데미. 모든 동물 실험에서 수행에 따라 유럽 및 러시아어 국가의 지침은 동물을 위한 실험 및 승인되었으로 동물과 윤리 위원회의 FSBI”N. Blokhin NMRCO”,참조 번호 2017-034.
B16-F10 마우스 흑색종 세포들 수확 Versene 솔루션,산탄 원심분리하여 300g5 분,및 resuspended 에서는 경우-1640 미디어지 않고 혈청. 흑색종 세포 현탁액을 혼합하였(1:1volume)와 마트리겔(BD 생명과학부),고 얻어진 셀룰라 서스펜션(5×105 세포당 주입)이식했 피하는 오른쪽과 왼쪽 측면 쥐의하여 종양을 성공적으로 시작 및 종양의 성장을 측정합니다.
의 관리 FMN 에 시작하 4 일 후 접종할 때 종양의 크기에 도달하는 60±16mm3FMN 솔루션(150µl,10mg/ml)에 주입하였으로 mice 정맥 투여를 통해 복고 궤도상 부비동,그리고 종양 조사와 푸른 빛 450nm 에서 15 분을 위해 최종 용량의 20J/cm2 입니다. 두 개의 대조군이 사용되었다:광 조사가없는 FMN 주입;FMN 주입이없는 레이저 조사. 광 활성화 된 FMN 의 종양 부피 및 항 종양 활성은 전술 한 바와 같이 추정되었다.
헤 마톡 실린 및 에오신 염색
동물을 pdt 후 24 시간에 자궁 경부 탈구에 의해 희생시켰다. 수확 된 모든 종양을 24 시간 동안 4%파라 포름 알데히드로 고정시킨 다음 파라핀을 묻었다. 조직 섹션(4μm 두께)을 헤 마톡 실린 및 에오신으로 염색 하였다.
통계분석
모든 실험을 수행하였 세중에서 언급하지 않는 한,각 실험은 세 번 반복됩니다. 데이터는 평균±SD 로 표현됩니다. 차이는 P 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의미한 것으로 간주되었다. 모든 통계 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어(GraphPad Software,LA Jolla,San Diego,CA,USA)로 수행되었습니다.