材料
細胞培養
ヒト黒色腫Mel Z、Mel IL、およびMel MTP細胞は、n.N.Blokhin national Medical Research Center of oncology50で治療を受けている患者の腫瘍材料から得られた。 ＢＪ−５ｔ ａ線維芽細胞および乳癌ＳＫ−ＢＲ−３細胞はＡＴＣＣ由来であった。 他の細胞は、ＳｖｉｒｃｈｅｖｓｋａｙａおよびＥによって親切に提供された。 コワレンコ（Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry RAS,Moscow,Russia）。 全ての細胞を、１ ０％ＦＢＳ、２μ Ｌ−グルタミン、１ ０ ０μ ｇ／ｍｌストレプトマイシン、および１ ０ ０Ｕ／ｍｌペニシリンを添加したＲＰＭＩ−１ ６ ４ ０増殖培地中で、５％ＣＯ２加湿雰囲気中で３ ７℃で 培地は3-4日ごとに交換した。 メラニン含有量は、Ｃａｒｙ５ ０ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計を使用してＤＭＳＯ細胞溶解物（１ ０ ６細胞／ｍｌ）中の吸収スペクトルを測定することによって推定した。細胞をベルセン溶液で回収し、300gで5分間遠心分離によりペレット化し、血清を含まないRPMI-1640培地に再懸濁し、106細胞/mlの最終濃度にした。
細胞をVersene溶液で回収し、300gで5分間遠心分離し、血清を含まないRPMI-1640培地に再懸濁し、1mlあたり106細胞の最終濃度にした。 次いで、１ ０ ０μ ｌの細胞懸濁液を、フローサイトメトリーのために光保護チューブに移した。 実験の直前に、ＲＰＭＩ−１ ６ ４ ０培地中のＦＭＮの適切な作業溶液を調製した。 これらのＦＭＮ溶液を管に加え、最終的なｆｍｎ濃度は１ ０μ Ｍ、３ ０μ Ｍ、および１ ０ ０μ Ｍであった。 その後、co2インキュベーター内で暗所で30分間培養した。 インキュベーションの終わりに、１ｍｌの冷たいＰＢＳを各管に加え、細胞を５分間遠心分離した（３ ０ ０ｇ、４℃）。 上清を除去し、細胞を３ ０ ０μ ｌの冷ＰＢＳ中に再懸濁し、氷に移した。 蛍光を、ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ Ｎｏｖｏｃｙｔｅ２ ０ ０ ０Ｒ（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＮｏｖｏｅｘｐｒｅｓｓ ｖ． Ｆｉｔｃ蛍光に対応するチャネル上で蛍光を測定し、少なくとも１ ０，０ ０ ０事象を各試料について調べた。 細胞中のＦＭＮの蓄積レベルを推定するために、各サンプル中の蛍光中央値を決定し、次いで、相対蛍光レベル（Ｆ）を、以下の式に従って計算した：＜／ｐ＞＜ｄｉｖ＞＜ＤＩＶ＞$ ${\rm{Ｆ}}={{\rm{Fluo}}}_{{\rm{Sample}}}-{{\rm{Fluo}}}_{{\rm{Background}}}$ $＜／ＤＩＶ＞＜／ＤＩＶ＞＜ｈ３＞共焦点顕微鏡検査＜／ｈ３＞＜ｐ＞細胞は、蛍光の中央値を決定し、次いで、相対蛍光レベル（ｆ）を計算した。96ウェルプレート（ウェルあたり5×103細胞）に播種し、一晩インキュベーションを行った。 次いで、ＲＰＭＩ−１ ６ ４ ０培地中のＦＭＮの適切な作業溶液（１ ０μ Ｍ、３ ０μ Ｍ、および１ ０ ０μ Ｍ）１ ０ ０μ Ｌを細胞に添加し、プレートを暗所でＣＯ２インキュベーター中で３ ０分間インキュベートした。 その後、細胞を冷たいＰＢＳで３回洗浄し、さらにＨｏｅｃｈｓｔ３ ３ ２ ５ ８色素（５ ０μ Ｍ）で１ ５分間染色した。 光学画像および蛍光強度データは、Ｉｎｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ６ ０ ０ ０およびＣｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ．
細胞毒性試験
細胞を96ウェルプレート（ウェルあたり5×103細胞）に播種し、その後一晩インキュベーションした。 完全なＲＰＭＩ−１ ６ ４ ０培地中のＦＭＮの適切な作業溶液を、実験の直前に調製した。 その後、９ ６ウェル板から培地を除去し、各ウェルにｆｍｎ溶液アリコート（１ ０ ０μ ｌ）を添加した。 FMN光活性化を誘導するために、プレートを450nm、照射線量0.2J/cm2–7J/cm2の光で処理した。 処置なしの細胞を対照として使用した（１ ０ ０％）。 細胞生存率は、48時間インキュベーション後のMTTアッセイによって決定された。 この目的のために、細胞をMTT溶液（RPMI-1640中0.5mg/ml）で3時間処理した後、形成されたホルマザン結晶を溶解するために、培地を100μ lのDMSOと交換した。 ５ ７ ０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）は、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ Ｆｌａｓｈ ｒｅａｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を使用して測定した。 ＦＭＮ処理後の細胞の生存率（Ｖ）は、以下の式に従って対照と比較して％で表された。:
ROS媒介光毒性を決定するために、fmn溶液アリコート（100μ l）を各ウェルに添加し、450nm（5J/cm2）の光で処理した。 ＦＭＮ含有培地を処置の直後に除去し、細胞を新鮮なＲＰＭＩ−１ ６ ４ ０培地中で４ ８時間インキュベートした。ＭＴＴアッセイを上記のように行った。
アポトーシスと壊死アッセイ
細胞は、一晩インキュベーションに続いて96ウェルプレート（ウェルあたり5×103細胞）に播種しました。
アポトーシスと壊死アッセイ
細胞は、一晩インキュベーションに続いて、96ウェルプレート（ 次いで、ＲＰＭＩ−１ ６ ４ ０培地中のＦＭＮの適切な作業溶液（１ ０μ Ｍ、３ ０μ Ｍ、および１ ０ ０μ Ｍ）１ ０ ０μ Ｌを細胞に添加し、プレートを暗所でＣＯ２インキュベーター中で３ ０分間インキュベートした。 その後、４ ５ ０ｎｍのレーザーを用いて５Ｊ／ｃｍ２の用量で細胞を照射した。 次いで、細胞を一貫して冷たいＰＢＳおよび結合緩衝液で洗浄し、結合緩衝液中で室温でＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣ、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、およびＨｏｅｃｈｓｔ３ ３ ２ ５ ８で１ ５分間染色した。 光学画像および蛍光強度データは、Ｉｎｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ６ ０ ０ ０およびＣｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ．
電極製造
カーボンナノ電極を0.1M NaOH、10mM KCl溶液中で30-40サイクルの間にそれぞれ10秒間エッチングし、炭素表面に空洞を作成した。 印加電位は1.5-2Vの振幅でV字型であった白金蒸着は、0から–1500mV対Ag/AgCl2mMクロロプラチン酸（H2Ptcl6、Sigma）を含む溶液中で電位を掃引することによっ 1mMフェロセンメタノール（FcMeOH、シグマ）のサイクリックボルタンモグラムは、製造プロセスを制御するために、ナノキャビティと白金と電極のために、初期の炭素電極のために得られた。 Ptの堆積はわずかに（1mM FcMeOHの酸化のためのボルタンモグラムによって証明されるように）ナノ電極の有効幾何学的表面積を増加させたが、劇的にROS還元 ナノ電極を６ ０ ０ｍＶ対Ａ ｇ／Ａｇｃｌ（Ｈ２Ｏ２の拡散制限検出のため）で偏光させ、手動で液体または単一癌細胞の表面に接近させた。 校正のために、H2O2（Sigma）の濃度が10-7-10-4Mの範囲の溶液を使用しました。
電気化学プローブによるROS測定
結果は、いくつかの変更を加えてearlier47に記載されていたように得られました。 このように，この作業に使用される電極の導入された改質は，Ｐｔ蒸着前に炭素層中の空洞をエッチングすることにより，白金の炭素電極へのより良い接着性である。 直径１ ０ ０〜５ ０ ０ｎｍの石英（ＩＣＡＰＰＩＣ Ｌｉｍｉｔｅｄ、ＵＫ）中で単離された、市販の円盤状の炭素ナノ電極を、ＲＯＳ検出用のセンサの製造に使用した。 電極の比較的不活性な炭素表面を酸化還元活性種の検出のためにさらに官能化した。 電着した白金層は，活性酸素種の還元によって生じる過剰電位を大幅に減少させることにより，電気触媒活性を増強する。 炭素プラグへの白金の接着性を高めるために，炭素電極にナノキャビティをエッチングした。 私たちは、炭素ナノ電極の先端に小さなノッチを作成するために電気化学的方法を使用しています51。 白金ナノセンサの作製をアルカリ溶液中でのエッチングと白金化の二段階で行った。 すべての段階は電気化学的測定によって正確に制御された。 私たちは、ナノ電極は短命と長寿命のROSフォームの両方に敏感であると考えています。 最近，フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）水溶液中での一重項酸素産生が青色光照射によって誘導されることを示した。 この結果に基づいて、我々は（補足データ9）青色光照射下でFMNの水溶液中のROS生産にAg/AgCl対+800mVで偏光カーボンナノ電極の応答を実証しています。細胞をペトリ皿に播種し、その後一晩インキュベーションした。
細胞をペトリ皿に播種し、その後一晩インキュベーションした。 その後、細胞を暗所で１ ０ ０μ Ｍ ＦＭＮで３ ０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄した。 次に，精密なマイクロマニピュレータを用いて，倒立顕微鏡による光学制御下で単一セルに白金化ナノ電極を慎重に導入した。 電極の操作および調整には、ｍｉｃｒｏｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ Ｐａｔｃｈｓｔａｒ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃａ、ＵＫ）を使用した。 我々は、パッチクランプ増幅器モデル2400（A-Mシステム、米国）とサイクリックボルタンメトリックデータを収集しました。 信号の記録は、多機能ｉ／Ｏ装置ＵＳＢ−６ ２ １ １（Ｎａｔｉｏｎａｌ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＳＡ）およびコンピュータプログラムＷｉｎｗｃｐを用いて行った。 全ての測定は、倒立顕微鏡Ｎｉｋｏｎ（日本）のテーブル上で達成した。 全ての測定において、Ａ Ｇ／Ａｇｃｌ電極を基準電極として使用した。
蛍光プローブによるROS測定
細胞質ROSの評価は、CellROX Deep Red蛍光プローブ（Molecular Probes/Thermo）を用いて行った。 手短に言えば、Ｍｅｌ ＩＬおよびＭ−３黒色腫細胞（５×１ ０ ３）を９ ６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に播種し、２． 次に、フェノールレッドを含まないRPMI-1640培地中のFMNの適切な作業溶液（10μ M、30μ M、および100μ M）100μ Lを細胞に加え、プレートをCO2インキュベーター中で暗所で30分間 その後、４ ５ ０ｎｍのレーザーを用いて５Ｊ／ｃｍ２の用量で細胞を照射した。 細胞核をさらに５ ０μ ＭのＨｏｅｃｈｓｔ３ ３ ２ ５ ８色素溶液によって１ ５分間染色した。 Ｍｅｌ ＩＬおよびＡ３ ７ ５黒色腫細胞の光学画像およびＣｅｌｌｒｏｘ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ蛍光強度データを、Ｉｎｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ６ ０ ０ ０およびＣｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｗｏｒｋｓｔｏｎｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ．
メラニン含有量の決定
我々は、マイナーな変更52と分光光度メラニン定量のためのルーチンアッセイを使用しています。 ４つのメラノーマ細胞株：Ｍｅｌ ＭＴＰ、ＭＥＬ ＩＬ、Ｍｅｌ Ｚ、Ａ３ ７ ５および２つの正常細胞株（ヒト角化細胞Ｈａｃａｔおよびヒト皮膚線維芽細胞ＢＪ−５ｔ Ａ）を計数し、２×１ ０ ６細胞／ｍｌの最終濃度を 細胞内メラニン含有量を決定するために、細胞ペレットを10％（v/v）DMSOを含む1M NaOHに溶解し、80℃で1時間インキュベートした。 インキュベーション後、溶解物を遠心分離し（３ ０ ０ ０ｇ、５分間）、無細胞培地中で４ ０ ５ｎｍで吸光度を測定した。 全ての結果は、３つの独立した実験の線維芽細胞±標準偏差（Ｓ Ｄ）におけるメラニン含量に対して正規化された吸光度強度の平均値として表される。 ０（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡ）を用いて、統計分析を行った。６〜７週齢の雄性Ｂａｌｂ／ｃ ｎ ｕ／ｎｕマウスを、ｓｈｅｍｙａｋｉｎ−Ｏｖｃｈｉｎｎｉｋｏｖ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏ ｆ Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｒussian Ａｃａｄｅｍｙ ｏ ｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓのａｎｉｍａｌ ｆａｒｍから購入し、制御された環境条件下で、通気された動物キャビネットＡ−Ｂｏｘ８ ０（Ｎｏｒｏｉｔ、Ｆｒａｎｃｅ）に１ ２時間の暗光サイク すべての動物実験は、動物実験のための欧州およびロシアの国家ガイドラインに従って実施し、ＦＳＢＳＩの動物および倫理審査委員会「Ｎ．Ｎ．Ｂｌｏｋｈｉｎ ＮＭＲＣＯ」、参照番号２ ０ １ ７−０ ３ ４によ異種移植マウスモデルを確立するために、Ｍｅｌ ＩＬおよびＡ３ ７ ５細胞を、Ｖｅｒｓｅｎｅ溶液で回収し、３ ０ ０ｇで５分間遠心分離によりペレット化し、血清を含まないＲＰＭＩ−１ ６ ４ ０培地 メラノーマ細胞懸濁液を混合した（1:Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｂ Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、得られた細胞懸濁液（注射あたり２×１ ０ ６細胞）をマウスの右脇腹に皮下移植し、成功した腫瘍開始および腫瘍成長測定を確実にした。
FMNの投与は、腫瘍の大きさが100-120mm3に達したときに接種後10日目に開始された。 ＦＭＮ溶液（１ ５ ０μ ｌ、１ ０μ ｇ／ｍｌ）を眼窩後洞を通してマウスに静脈内注射し、腫瘍に４ ５ ０ｎｍの青色光を１ ５分間照射し、最終用量の２ ０Ｊ／ｃｍ２にした。Tumor{{\rm{V}}}_{{\rm{Tumor}}}={\rm{Length}}\times{({\rm{Width}})}}={({\rm{Width}})}={({\rm{Length}})}={({\rm{Width}})}={({\rm{Length}})}={({\rm}})}^{2}/2$$光活性化されたＦＭＮの抗腫瘍活性は、以下のように計算された腫瘍増殖阻害率（ＴＧＩ％）を評価することによって決定された。:distant{\rm{TGI}}\%=({{\rm{tg}}}_{{\rm{control}}}-{{\rm{tg}}}_{{\rm{test}}})/{{\rm{tg}}}_{{\rm{control}}}\times\mathrm{100}\%%
遠位腫瘍の光線力学療法
我々はＳｈｅｍｙａｋｉｎ−Ｏｖｃｈｉｎｎｉｋｏｖ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏ ｆ Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｒｕｓｉａｎ ａｃａｄｅｍｙ ｏ ｆ ｓｃｉｅｎｃｅｓのＡｎｉｍａｌ Ｆａｒｍから購入した６〜７週齢のＣ５ ７ＢＬ／６マウス。 すべての動物実験は、動物実験のための欧州およびロシアの国家ガイドラインに従って実施され、ＦＳＢＩ「Ｎｎ」の動物倫理審査委員会によって承認された。 2017-034″を参照。Ｂ１ ６−Ｆ１ ０マウス黒色腫細胞を、Ｖｅｒｓｅｎｅ溶液で回収し、３ ０ ０ｇで５分間遠心分離してペレット化し、血清を含まないＲＰＭＩ−１ ６ ４ ０培地に再懸濁した。＜／ｐ＞＜ｐ＞Ｂ１ ６−Ｆ１ ０マウ メラノーマ細胞懸濁液を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｂ Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と混合し（１：１体積）、得られた細胞懸濁液（注射あたり５×１ ０ ５細胞）をマウスの右および左脇腹に皮下移植し、成功した腫瘍開
fmnの投与は、腫瘍の大きさが60±16mm3に達したときに接種後4日目に開始したFMN溶液（150μ l、10mg/ml）を眼窩後洞を通してマウスに静脈内注射し、腫瘍を450nmで15分間青色光を15分間照射し、20J/cm2の最終用量にした。 光照射なしのＦＭＮ注入とｆｍｎ注入なしのレーザ照射の二つの対照群を用いた。 光活性化されたＦＭＮの腫よう容積および抗腫よう活性を上記のように推定した。
ヘマトキシリンおよびエオシン染色
動物は、PDT後24時間で子宮頸部脱臼によって犠牲にした。 すべての収穫された腫瘍は4％パラホルムアルデヒドで24時間固定し、その後パラフィンで埋め込まれた。 組織切片（厚さ4μ m）をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
統計分析
特に記載のない限り、すべての実験は三重で行われ、各実験は独立して三回繰り返されました。 データは平均±ＳＤとして表される。 差は、P値が0.05未満であったときに統計的に有意であると考えられた。 全ての統計分析は、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃ Ａ，ＵＳＡ）を用いて行った。