Témák
Fél-egy egészséges, ellenálló képzett férfiak (22.1 ± 5.0 év, 180 ± 0,1 cm, 86.1 ± 13.0 kg, 18.1 ± 6,4% – os testzsír) tájékoztatták a vizsgálati jegyzőkönyv által jóváhagyott Intézményi bizottság Baylor Egyetem részvétel előtt. A képzési státusz önálló jelentés volt, és kizárták azokat az egyéneket, akiknek legalább egy éves tapasztalata nem volt a tanulmány előtt. Ezen kívül érintettek voltak zárva, ha: 1) volt a történelem anyagcsere, magas vérnyomás, hepatorenal, mozgásszervi, autoimmun, vagy neurológiai betegség; 2) voltak, jelenleg pajzsmirigy, antihyperlipidemic, hipoglikémiás, vérnyomáscsökkentő, vagy androgén gyógyszerek; valamint 3) vett táplálék-kiegészítőket, amelyek befolyásolhatják az izom tömege és/vagy anabolikus/katabolikus hormon szintje számított három hónapon belül kezdődik a tanulmány.
kiindulási vizsgálat
a jogosult vizsgálati alanyok a vizsgálati terv szóbeli és írásbeli magyarázata révén ismerkedtek meg a vizsgálati jegyzőkönyvvel. Tantárgyak aláírta a beleegyező nyilatkozat kitöltött személyes, kórtörténet, ugyanakkor befejezése egy Wingate anaerob kapacitás teszt előtt kiindulási vizsgálat. Tantárgyak utasították, hogy tartózkodjanak a megerőltető testmozgás 48 órán belül gyors 10 óra előtt kiindulási vizsgálat (azaz nap, 0), ami történt 3-4 nap alábbi megismerése lehetővé teszi a felvétel étrendi bevitel. Ez a tanulmány kettős-vak, placebo-kontrollos, párhuzamos vizsgálati tervet alkalmazott, amelynek során az alanyokat az életkor és a testtömeg szerint egyenletesen csoportosították.
kísérleti protokoll
a 0., 25. és 50. napon minden beteget 10 órás gyorsaság után jelentettek a laboratóriumnak. A magasságot standard antropometriával mértük, a teljes testtömeget pedig kalibrált Healthometer digitális törzsmérő elektronikus skálával (Bridgeview, IL) mértük ± 0,02 kg pontossággal. A testösszetételt ezután egy kalibrált Hogologic Discovery w dual-energy X-ray absorptiometer (DXA) eszközzel (Hogic Inc., Bedford, MA), míg a vérnyomást és a nyugalmi pulzusszámot standard eljárásokkal határozták meg. Az alanyok ezután körülbelül 25 ml éhgyomri vért adományoztak hematológiai, klinikai kémiai panelek, majd később citokin és hormon analízis standard vénapunkciós technikáival. Két 10 ml szérum szétválasztás vacutainer csövek, valamint egy 5 ml-es K3 EDTA vacutainer cső volt dugva a vacutainer tartó vérvételi egymás után a több minta érvágás, technikák. A teljes vért azonnal teljes vérképre elemezték, míg a szérum vacutainer csöveket szobahőmérsékleten 15 percig 1500 g-on centrifugálták, a szérum felülúszót mikrocentrifuga csövekbe helyezték át, a szérummintákat pedig -20°C-on tárolták a későbbi hormonális és metabolit-elemzésekhez. Csak a 0. és 50. napon az alanyok körülbelül 60 mg vázizomot adományoztak a vastus lateralis-ból a Bergstrom biopsziás technikával. A felsőtest és az alsó test szilárdságát szabványos 1RM-es próbapad-és 35° – os csípőszán géppel (Nebula, Versailles, OH) vizsgálták. A laboratóriumunkban a rezisztencia-kiképzett vizsgálati alanyokon végzett szilárdsági vizsgálatok megbízhatósága nagy megbízhatóságot biztosított a próbapad (r = 0,94) és a lábprés (r = 0,91) számára. Meghatározása után a csípő szán 1RM, alanyok pihent 10 perccel befejezése előtt 30 másodperc Wingate anaerob kapacitás teszt számítógépes ciklus ergométer (Lode Excalibur, Lode, Groningen, Hollandia), hogy értékelje az alsó test anaerob teljesítmény. Ez a teszt abból állt, hogy az egyes alanyok minden módon sprinteltek a kerékpár ergométeren 30 másodpercig, 0,075 kg·kg-1 testtömeg normál terhelésével szemben. A laboratóriumi abszolút csúcsteljesítmény és az átlagos teljesítmény teszt-teszt megbízhatósága szintén magas megbízhatósági értékeket eredményezett (r = 0,69 és r = 0.95, ill. p < 0, 05).
perkután izombiopsziát
az izombiopsziát a 0 .és 50. napon, minden erőpróbát megelőzően vették be, hogy elkerüljék a testmozgás miatti esetleges myofibrilláris zavarokat. Az alanyokat arra utasították, hogy tartózkodjanak a testmozgástól 48 órával az egyes izom biopszia előtt. Az izmot a vastus lateralis oldalirányú részéből, a domináns láb patella és csípőcsontja közötti félúton vonták ki egy 5 mm-es biopsziás tűvel, alkalmazott szívással . Röviden, 1,5 ml 1.A lidokain HCl 0% – át szubkután injekciózták, mielőtt egy kis kísérleti bemetszést végeztek volna. A kettős vágású eljárással és az alkalmazott szívással a minta először minden látható zsírt és kötőszövetet eltávolított, mielőtt folyékony nitrogénbe fagyasztották volna. Az összes mintát később -80°C-on tárolták a későbbi elemzésekig.
kiegészítő protokoll és étrendi monitorozás
kettős-vak módon a vizsgálati alanyok a vizsgálat megkezdését követő 50 napon belül négy 250 mg-os, kukoricaolaj-placebót vagy AA-t (X-Faktor, molekuláris táplálkozás, Jupiter, FL) tartalmazó kapszulát fogyasztottak. A táplálékkiegészítőket kapszulák formájában állították elő, és molekuláris táplálkozással általános palackokba csomagolták. A megfelelést úgy ellenőrizték, hogy az alanyok 25 és 50 napos kiegészítés után üres kiegészítő palackokat visznek vissza. Összhangban a korábbi iránymutatások, valamint annak érdekében, energia, fehérje bevitel megfelelő volt, hogy megkönnyítse az izom-megnagyobbodás, minden tantárgyból az utasítást kapta, hogy növelje a kalória-bevitel mintegy 500 kcal·nap-1 is miközben a becslések szerint a fehérje bevitel 2 g·kg-1·nap-1, ha a kiindulási értékhez képest étrend elemzés . Alattvalói voltak, feltéve, hogy a kereskedelmi forgalomban kapható, étkezést helyettesítő por (Lean Body, Labrada Nutrition, Houston, TX), amely mintegy 290 kcal, 24 g szénhidrát, 45 g fehérje, 1 g zsír adagonként, hogy megpróbálja biztosítani a fent említett energia fehérje követelményeknek. A kiindulási fehérjebeviteltől függően az alanyoknak azt mondták, hogy reggel és/vagy közvetlenül az egyes edzéseket követően 1-2 csomag étkezéspótló kiegészítést vegyenek be . Emellett a tárgyak arra utasították, hogy elkerüljék a rendszeres fogyasztása élelmiszerek ismert, hogy a magas ω-3 zsírsavak, beleértve a halolaj, lenmagolaj, hideg víz, hal, olíva olaj, szezám olaj, mogyoróvaj, N-acetil-cisztein, konjugált linolsav, valamint gyulladáscsökkentő gyógyszerekkel, beleértve a paracetamol, ibuprofen, aszpirin vagy más nem-szteroid gyulladáscsökkentő gyógyszerek . Étrendi bevitel, valamint linolsav (18:2, ω-6), linolén (18:3, ω-3) és AA bevitelét a 0., 25. és 50. napon 4 napos étrendi visszahívásokkal ellenőrizték, és az élelmiszer-feldolgozó III Nutrition Software (ESHA Nutrition Research, Salem, vagy) segítségével értékelték.
Resistance-training protocol
50 napos időszak alatt az alanyok egy 4 napos·hét-1 osztott testű, lineáris periodizációs ellenállás-képzési programot fejeztek be. Felsőtest felvonók tartalmazza fekvenyomás, lat pull, vállprés, ülő sorok, váll vállrándítások, mellkasi legyek, bicepsz fürtök, és tricepsz prés-downs míg alsó test felvonók tartalmazza lábprés, hátsó kiterjesztés, lépés up, láb fürtök, láb kiterjesztése, sarok emel, és hasi ropog hetente kétszer. Az alanyok 3 db 10 ismétlést hajtottak végre annyi tömeggel, amennyit csak tudtak emelni egy készletenként (azaz az 1RM 60-80% – a). A gyakorlatok közötti pihenőidő nem haladta meg a 3 percet, míg a többi a készletek között nem haladta meg a 2 percet. A képzést az egyetem hallgatói életközpontjában végezték, dokumentálták a képzési naplókban, és a kijelölt alkalmazottak aláírták, hogy ellenőrizzék a megfelelést és figyelemmel kísérjék a haladást. Ezt a protokollt már kimutatták a korábbi kutatások, hogy támogassák a jelentős nyereség izomerő, izom állóképesség, zsírmentes tömeg .
szérum és teljes vér analízis
szérumot és teljes vérmintákat alkalmaztak a klinikai biztonságosság értékelésére a kiegészítő protokollok során. Serum samples were assayed for comprehensive metabolic panels including glucose, total protein, blood urea nitrogen (BUN), creatinine, BUN/creatinine ratio, uric acid, aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), creatine kinase (CK), lactate dehydrogenase (LDH), gamma-glutamyl transpeptidase (GGT), albumin, globulin, sodium, chloride, calcium, carbon dioxide, total bilirubin, alkaline phosphatase (ALP), triglycerides, cholesterol, HDL and LDL using a Dade Dimension XL clinical chemistry system (Dade Behring Inc., Newark, DE). Teljes vérkép, beleértve a vörösvérsejt számít, hemoglobin, hematokrit, vagyis sejt térfogat, az átlagos vörösvértest-hemoglobin, az átlagos vörösvértest-hemoglobin koncentráció, vörösvértest-elosztó széles, fehér vérsejtszám, neutrofil granulociták, limfociták, monociták, eosinophil, valamint basophil elemezték keresztül citometria segítségével a Sejt-DYN 1800 (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). Az ilyen vizsgálatok megbízhatóságának tesztelése (belül és között) az egyes vizsgálatok esetében 2-6% között mozgott, átlagosan 3,0% – os variációs együtthatóval (C V). A mintákat két példányban futtatták, hogy ellenőrizzék az eredményeket, ha a megfigyelt értékek a standard eljárásoknak megfelelően kívül esnek a kontroll értékeken és/vagy a klinikai normákon.
Az ezt követő szérummintákat később kortizol (CORT), szabad tesztoszteron (fTEST), teljes tesztoszteron (tTEST), interleukin-6 (IL-6), prosztaglandin E2 (PGE2) és prosztaglandin F2a (PGF2a) esetében vizsgálták. Commerical enzyme immunoabsorbent assays were used to analyse serum concentrations of pgf2a, PGE2, and IL-6 (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) and CORT, fTEST, and tTEST (Diagnostic Systems Laboratories, Webster, TX). Az EIA-alapú vizsgálatok elvégzésének C V értéke 3,0-5,0% között mozgott.
teljes RNS izoláció
a biopsziás minták homogenizációjából a Tri-reagensben (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Az egyes mintákból származó összes RNS-koncentrációt spektrofotometriásan határoztuk meg 260 nm (OD260) optikai sűrűséggel, a végső koncentrációt 200 ng·µl-1-re állítottuk úgy, hogy a nyers teljes RNS-kivonatokat DEPC-vel kezelt nukleázmentes H2O-ba hígítottuk. Kimutatták, hogy ez az eljárás nem degradált RNS-t eredményez, amely mentes a DNS-től és a fehérjéktől, amint azt a prominens 28S és 18S riboszomális RNS sávok, valamint az OD260 / OD280 arány körülbelül 2,0 . Az RNS-mintákat -80°C-on tárolták a későbbi elemzésekig.
Reverz transzkripció, valamint klonális DNS-szintézis
A szabványos megoldások teljes sejtes RNS voltak fordított átírt szintetizálni klonális DNS (cdns) a korábban leírt módon . Röviden, egy reverz transzkripciós reakcióelegyet 42°C-on 40 percig inkubáltunk, 5 percig 85°C-ra melegítettük, majd jégen gyorsan lehűtöttük a cDNA terméket. Kezdő cdns sablon koncentráció szabványosított 200 ng·µl-1 előtt, valós idejű polimeráz láncreakció (RT-PCR) erősítés, azáltal, hogy érzékeli nyers cdns előállított termékek spectrophotometrically egy hullámhosszon 260 nm hígítás őket nuclease-ingyenes H2O. A szabványosított cdns megoldások voltak fagyva a -80°C-on, amíg a real-time RT-PCR-t végeztünk.
RT-PCR
anti-sense oligonukleotid alapozó párokat gyártottak kereskedelmi forgalomban kapható Beacon Tervező szoftver (Bio-Rad, Hercules, CA) felhasználásával a GenBank nukleotid adatbázisában közzétett ismert mRNS-szekvenciákból és kereskedelmi szinten szintetizált (integrált DNS technológiák, Coralville, IA). A következő 5 “sense and 3” Anti-sense oligonukleotid primereket használták a három felnőtt MHC izoforma izolálására( I., IIa és IIx Típus): I. típusú MHC mRNS (5 “alapozó: 776-796 bázisok, 3″ alapozó: 1398-1378 bázisok, GENEMBL AC X06976), IIA típusú MHC mRNA (5 ” primer: bázisok 1785-1805, 3 “primer: bázisok 2440-2420, GenEMBL AC AF111784), IIx MHC mRNA Típus (5″ primer: bázisok 1138-1158, 3 ” primer: bázisok 1746-1726, GenEMBL AC AF111785). Ezek a primerek 141, 145, illetve 148 bázispár töredékeit erősítik az I., IIa, IIX MHC típushoz. a β-aktint külső referenciaszabványként használták a cél mRNS mennyiségének relatív változásának kimutatására, mivel alkotmányosan expresszált háztartási génként vették figyelembe, Ezek a β-aktin primerek 135 bázispár PCR-fragmensét erősítenek. A négy PCR reakció mindegyikéhez kétszáz ng cDNA-t adtak az I. típusú MHC-hez,- IIa-hoz és-IIx-hez, valamint β-aktinhoz. Pontosabban, minden PCR-reakció a következő keverékeket tartalmazta: 2 µl cDNA-sablont adtak hozzá 12,5 µl 2× SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA) , 1,5 µl sense és anti-sense primerek, valamint 7,5 µl nuclease-mentes dH2O]. Minden PCR reakció volt erősített a thermal cycler (Bio-Rad, Hercules, CA), valamint a hangerősítő sorrend benne egy lépés denaturáció: 95°C-on 30 másodperc, alapozó lágyítás 55°C-on 30 másodpercig, majd kiterjesztése 72°C-on 60 másodpercig . Az RT-PCR-t 40 cikluson keresztül végezték, a SYBR zöld fluorofor által kibocsátott fluoreszcenciával, amelyet minden ciklus után mértek. Fluoreszcencia-kibocsátás következik be, mivel a SYBR green integrálódik a PCR-reakció során előállított kettős szálú cDNA-ba. Az összes CT-értéket az amplifikáció lineáris részében értékelték, és az amplifikáció után DNS-olvadásgörbe-analízist végeztek annak biztosítása érdekében, hogy az egyes géntermékeket primer-dimerek hiányában erősítsék. Az összes mRNS számszerűsítését a β-aktin expresszióhoz viszonyítva fejeztük ki. A CT-érték arányok összehasonlításával hasonlították össze a bazális gén expressziójának változásait az AA és a PLA csoportok között. A véglegesített PCR reakciókeverékek 25 µl-es aliquotjait tartalmazó agaróz gélelektroforézist 1-ben végeztük.5% agarózgélek 1× Tris-bórsav-EDTA (TBE) puffert használva, UV-transzilluminátorral megvilágítva (Chemi-Doc XRS, Bio-Rad, Hercules, CA) a cél mRNS pozitív amplifikációjának ellenőrzésére (az adatok nem láthatók) . Az MHC I, IIA és IIx esetében a C V 2,06%, 3,18%, illetve 2,73% volt .
összes izomfehérje-mennyiség
a teljes RNS-izolációs eljárásból megmaradt összes fehérjét izopropanollal, etanollal és 0,3 M guanidin-hidrokloriddal izoláltuk. A Myofibrillar fehérjét 0-mal izoláltuk.1% nátrium-dodecil-szulfát (SDS) , mielőtt a fehérjetartalmat spektrofotometriailag meghatározták egy Bradford-teszttel 595 nm hullámhosszon. Standard görbe jött létre (r2 = 0, 98, p < 0, 001) szarvasmarha szérumalbumin mint standard és az izom nedves tömegéhez viszonyítva reprezentált . Minden fehérjemintát ezt követően 50 µg fehérjére hígítottak 30 µl SDS pufferenként a későbbi immunoblottinghoz. A myofibrillar fehérje C V értéke 2,03% volt .
MHC protein isoform quantitation
az MHC fehérje izoformák összetételét az egyes izomhomogenizáló mintákon belül automatizált SDS-PAGE határozta meg Experion Pro260 chipek (Bio-Rad, Hercules, CA) segítségével. Az egyes mintákból körülbelül 6 µl aliquotot pipettáztunk minden egyes mintába a mikrochipen. Minden ismeretlen minta készült, 4 µl fehérje hígítási minden egyes tárgy (vagy 4 µl molekulatömegű létra), 2 µl minta puffer a β-mercaptoethanol, 84 µl deionizált víz. Gazith és kollégái eredményei alapján mindhárom MHC izoforma várhatóan a 200-210 kiloDaulton régióban vándorol a poliakrilamid gélen belül a molekulatömeg létrához viszonyítva. A géleket az Experion szoftver (Bio-Rad, Hercules, CA) digitálisan vizualizálta, és az MHC koncentrációkat minden mintában úgy értékelték, hogy összehasonlították az egyes MHC izoformák tetszőleges sűrűségét az ismert koncentrációkkal rendelkező molekulatömegű markerek tetszőleges sűrűségével. A ≥10 kD fehérje sávok c v értéke ≤1,1% volt.
Fehérje immunoblotting
PGF2a (FP), valamint a PGE2 (EP3) receptor mennyiségi meghatározására került sor, szobahőmérsékleten kitermelése teljes izom fehérje a homogenate slot-blot 50 µg a teljes fehérje-ra nitrocellulóz membrán segítségével egy Bio-Dot fehérje eljárás rendszer (Bio-Rad, Hercules, CA). A eltöröltessenek membránok volt inkubáljuk blokkoló megoldás 1 óra egy orbitális rocker, kivontam, s membránok volt inkubáljuk egy TTBS mosóoldat 5 percig, összesen három mossa. A membránokat speciális anti-FP receptorokkal és anti-EP3 receptor poliklonális antitestekkel (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) inkubáltuk, 4 µg·ml-1-re hígítva, 1-2 órán keresztül orbitális rockeren. Az elsődleges antitestoldatokat ezután dekantáltuk, majd a membránokat ttbs oldattal 5 percig mossuk egy orbitális rocker-en, összesen három mosáshoz. A ttbs mosóoldatot dekantálták, és a membránokat egy másodlagos biotinilált kecske anti-nyúl antitest oldattal (Bio-Rad, Hercules, CA) inkubálták 1 órán át egy orbitális rocker-en. Folytatva, a másodlagos biotinilált kecske anti-nyúl antitest oldatot dekantáltuk, a membránokat pedig ttbs mosó oldatban inkubáltuk, összesen három mosással, mosásonként 5 percig. A membránokat streptavidin-biotinilált alkalikus foszfatáz komplex oldattal (Bio-Rad, Hercules, CA) inkubáltuk 1 órán keresztül egy orbitális rockeren. Végül a sztreptavidin-biotinilezett alkalikus foszfatáz komplex oldatot dekantáltuk, majd a membránokat háromszor ttbs-oldattal mossuk 5 percig egy orbitális rázógépen. A bcip/NBT-t (Bio – Rad, Hercules, CA) tartalmazó színfejlesztő megoldást hozzáadták, a színfejlesztést pedig 30-60 perc alatt ellenőrizték. A színfejlődést úgy állították le, hogy a membránt dupla desztillált H2O-ban inkubálták 10 percig egy orbitális rockeren. A blottált membránokat denzitometriával digitalizálták egy Chemi-Doc XRS képalkotó rendszerrel (Bio-Rad, Hercules, CA), és a sávsűrűséget integrált sűrűségegységekben fejezték ki az izomtömeghez viszonyítva.
Statisztikai analízis
statisztikai elemzéseket SPSS (version 14.0, SPSS Inc., Chicago, IL). A teljes vér, szérum, teljesítmény és testösszetétel változókat a variancia (ANOVA) 2 × 3 (csoport × tesztelési munkamenet) analízisével elemeztük, ismételt mérésekkel, univariate tesztekkel. Az MHC-fehérje, az FP és az EP3-receptor fehérjeszintjét külön 2 × 2 (csoport × tesztelési munkamenet) ANOVA-val elemeztük ismételt mérésekkel. Ezenkívül a csoport jelentős fő hatása esetén az egyes csoportok esetében egyirányú Anovákat végeztek a tesztelési munkamenetek ismételt mérésével, hogy felmérjék a tesztek közötti különbségeket. Független t-teszteket alkalmaztak az MHC mRNS kifejezés változásainak elemzésére 50 napos kiegészítés után. Amellett, hogy a nyers pontszám elemzés, delta pontszám elemzést (azaz nap 0 értékek vonni nap 25 és/vagy 50) végezték a változók kiállított idegen eltérés a csoportok között a 0. nap. Mint említettük, a nyers eredmények, egy 2 × 3 (csoport × teszt) varianciaanalízis (ANOVA) ismételt intézkedések univariate vizsgálatok arra használták, hogy elemezze a delta pontszámok test összetétele, teljesítmény változók, valamint hormon koncentráció mivel egy 2 × 2 ismételt intézkedések ANOVA használták, hogy elemezzék intramuscularis delta pontszámokat. Azokban az esetekben, amikor a csoportokon belüli egyenlő eltéréseket nem lehetett feltételezni, a Hunyhs-Feldt epsilon korrekciós tényezőt használták az F-csoport arányainak beállítására. Olyan körülmények között, amikor statisztikai tendenciák jelentek meg (azaz p = 0,05-0.10), a hatásméreteket részleges Eta-négyzetként (np2) is jelentették. A részleges Eta – hatásméretek a korábban leírtak szerint gyengék (np2 ≤ 0,01), közepes (np2 = 0,06), strong = (np2 = 0,14) voltak . Az összes statisztikai elemzés jelentőségét 0,05-ös alfa-szinttel határoztuk meg. Meg kell jegyezni, hogy a terv a priori teljesítményelemzése azt jelezte, hogy a kezelésenként 15 résztvevő n-mérete nagy teljesítményt eredményez (> 0.8) A 0,75-1,25 kritériumváltozó delta értékeihez. Azt is meg kell jegyezni, hogy post hoc outlier elemzés segítségével doboz telkek végeztünk olyan körülmények között, ahol nem volt jelentős csoport × idő kölcsönhatások biztosítása nem voltak kiugró jelen. Minden adat jelentése ± szórás (SD).