hiperpolarizarea presinaptică induce o modulare analogică rapidă a transmisiei evocate de spike mediată de canalele de sodiu axonale

facilitarea Ad indusă de hiperpolarizare

am măsurat mai întâi incidența hiperpolarizării scurte a celulei presinaptice asupra transmisiei sinaptice. Perechi de neuroni CA3 conectați monosinaptic au fost înregistrați în culturi organotipice ale hipocampului de șobolan după 8-10 zile in vitro (DIV)21. S-a constatat că un pre-puls hiperpolarizant de 200 ms livrat înainte de vârful presinaptic crește rezistența sinaptică cu 20% (fig. 1a). Această creștere a fost observată la măsurarea amplitudinii sau încărcării răspunsului postsinaptic (Fig suplimentar. 1). În aceste experimente, potențialul de repaus presinaptic a fost de -74 3 mV (n=10). H-ADF a fost comparabil atunci când hiperpolarizarea presinaptică s-a ridicat la -84 sau -102 mV (respectiv, 124 xtc8% față de 119 xtc5%, n=10; testul Wilcoxon P>0.1), sugerând că o hiperpolarizare presinaptică de 10 mV este suficientă pentru a obține h-ADF saturant. h-ADF a fost asociat cu un raport redus al pulsului pereche (PPR, de la 99 la 7 la 88 la 5%, N = 12; testul Wilcoxon p<0,05; suplimentar Fig. 1), indicând faptul că rezultă dintr-o creștere presinaptică a eliberării glutamatului.

este puțin probabil ca o hiperpolarizare lungă de 200 ms să apară într-un context fiziologic. Prin urmare, am investigat cursul de timp al H-ADF pentru hiperpolarizări mai scurte (15, 50, 100 și 200 ms). h-ADF s-a observat pentru toate duratele de hiperpolarizare testate (15 ms: 111,3%, 50 ms: 116,4%, 100 ms: 109,4%, 200 ms: 120,6% Wilcoxon, p<0,05 pentru toate duratele, N=7, Fig. 1b). Conform acestui rezultat, h-ADF este probabil să fie indus de hiperpolarizarea fiziologică.

neuronii piramidali CA3 exprimă facilitarea ad indusă de depolarizare (d-ADF) care rezultă din inactivarea lentă a canalelor Kv1.1 (constantă de timp: 3,3 s)13. Astfel, am examinat dacă ambele D – și H-ADF au fost exprimate la aceleași conexiuni CA3–CA3. AP-urile presinaptice au fost declanșate alternativ din potențialul membranei de repaus (control -78 mV), după o depolarizare lungă sub prag (10 s, -62,6 mV, d-ADF), după o scurtă hiperpolarizare (200 ms, -96,1 MV, h-ADF) sau după combinarea unei depolarizări lungi și a unei scurte hiperpolarizări (D – și h-ADF; Fig. 1C, stânga). De fapt, combinația dintre cele două forme de ADF a produs, în aceleași conexiuni, o facilitare mai mare (113% 3%, N=16; Fig. 1c) decât cea produsă separat de fiecare protocol (d-ADF singur: 105 3%, N = 16, h-ADF singur:108 4%, n=11; Fig. 1c). În special, s – a constatat că media h-și d-ADF se însumează liniar, sugerând două mecanisme moleculare independente. Mai mult, d – și H-ADF măsurate în aceleași perechi au fost corelate pozitiv (Fig suplimentar. 1), sugerând că unele conexiuni sinaptice sunt mai susceptibile la facilitarea AD, probabil pentru că propagarea semnalului analogic de-a lungul axonului depinde de distanța dintre soma și terminalele presinaptice. Aceste date demonstrează că h – și D-ADF coexistă în neuronii piramidali CA3 și că mecanismele de bază sunt susceptibile de a fi independente.

h-ADF a fost observat la neuronii tineri CA3 (DIV8–10 preparați de la șobolani P5–P7) și, prin urmare, ar putea rezulta în principal din densitatea scăzută sau proprietățile imature ale canalelor ionice cu tensiune. Prin urmare, am stabilit dacă h-ADF a fost găsit și în celulele piramidale mature CA3. Înregistrările asociate ale neuronilor CA3 Conectați au fost obținute în culturi de felii DIV24–DIV32. Hiperpolarizarea presinaptică scurtă (200 ms) a crescut semnificativ rezistența sinaptică (104.2 0,1% n=25; Wilcoxon, p<0,01; suplimentar Fig. 2). h-ADF măsurată în celulele mature a fost mai mică decât cea măsurată în neuronii în curs de dezvoltare (Mann–Whitney, P<0,01; Fig suplimentar. 2). Prin urmare, concluzionăm că H-ADF este reglat în dezvoltare în neuronii CA3 in vitro.

toate înregistrările au fost obținute cu calciu extracelular ridicat (3 mM) pentru a optimiza rezistența sinaptică. În aceste condiții, probabilitatea de eliberare presinaptică este ridicată și facilitarea presinaptică, cum ar fi H-ADF, ar putea fi subestimată. Prin urmare, am măsurat h-ADF în neuronii CA3 maturi (DIV24–DIV32) înregistrați cu calciu extracelular fiziologic (1,3 mM)22. În aceste condiții, s-a constatat că h-ADF este în jur de +16,4% (Wilcoxon, P<0,01; Fig suplimentar. 2). Concluzionăm că h-ADF este puternic exprimat în neuronii maturi înregistrați în calciu extracelular fiziologic.

h-ADF este indus de IPSPs și oscilații simulate

pentru a investiga rolul h-ADF în condiții aproape fiziologice, a fost introdusă o conductanță asemănătoare GABAA în neuronul presinaptic folosind clema dinamică (Fig. 2a, stânga). În acord cu rezultatele ilustrate în Fig. 1, APs precedat de injectarea unui curent asemănător IPSC a produs un răspuns mai mare în neuronul postsinaptic comparativ cu APs declanșat din potențialul membranei de repaus (Wilcoxon p<0,001, n=11). În concordanță cu o creștere presinaptică a eliberării glutamatului, PPR a fost redusă atunci când IPSPs GABAergic simulat a precedat APs (de la 121% în control la 96%; Wilcoxon p<0,05, n=7; datele nu sunt prezentate). Interesant este că dimensiunea potențării sinaptice s-a dovedit a fi dependentă de dimensiunea IPSP simulată (R2=0,39, p<0,05), indicând faptul că h-ADF este clasificat între potențialul membranei de repaus (-74 mV) și hiperpolarizarea 10-mV (-84 MV; Fig. 2a, dreapta). De fapt, factorul de facilitare în acest interval sa dovedit a fi de 1,8% pe MV de hiperpolarizare.

am investigat apoi modularea rezistenței sinaptice în timpul oscilației potențiale a membranei presinaptice. Oscilația potențialului membranei presinaptice la 4 Hz a fost produsă prin injectarea curentului sinusoidal, iar vârfurile presinaptice unice au fost evocate la diferite faze ale oscilației. În acord cu rezultatele anterioare, h-ADF a fost observat atunci când celula a tras în timpul fazelor de hiperpolarizare ale oscilației (0 ms: 124,3 7%, 250 ms: 122 7%, Wilcoxon p<0,05, N=8; Fig. 2b). La alte faze, puterea sinaptică este neschimbată (56 ms: 112.2 6%, 163 ms: 95.8 5%, 211 ms: 110.5 6%, Wilcoxon p>0.1, n=8). În special, nu se observă d-ADF cu depolarizarea, deoarece durata sa este prea scurtă pentru a inactiva canalele Kv1.113. Concluzionăm că oscilațiile din intervalul XV induc h-ADF în neuronii CA3.

h-ADF este asociat cu o creștere a amplitudinii axonale a vârfului

în continuare, am investigat mecanismele care stau la baza h-ADF. Un posibil mecanism pentru h-ADF este o modulare a amplitudinii vârfului presinaptic indusă de hiperpolarizare. Prin urmare, am examinat consecința hiperpolarizării asupra amplitudinii vârfului măsurată în axon. Neuronii CA3 au fost umpluți cu Alexa 488 (50 MMCT) pentru a vizualiza arborizarea axonului, iar înregistrările atașate de celule au fost obținute de la axon la distanțe cuprinse între 60 și 240 MMCT (Fig. 3a). La hiperpolarizarea somatică s-a amplificat amplitudinea vârfului axonal (106% 1% din amplitudinea de control, N=6, Wilcoxon, p<0,05; Fig. 3b). Cu toate acestea, s-a constatat că magnitudinea facilitării vârfului axonal scade odată cu distanța axonală cu o constantă spațială de 212 MMC (Fig. 3b). În concluzie, h-ADF în neuronii CA3 este asociat cu o creștere locală a amplitudinii vârfului în axon.

în timp ce înregistrarea celulelor întregi din axonii CA3 este extrem de dificilă în culturile organotipice, ea poate fi obținută în neuronii piramidali L5 din felii acute5,6. Prin urmare, am măsurat mai întâi dacă h-ADF ar putea fi observat și la conexiunile excitatorii L5–L5. Perechi de neuroni piramidali L5 conectați monosinaptic au fost înregistrați în felii acute din cortexul senzori-motor al șobolanilor tineri (P14–P20). S-a constatat o scurtă hiperpolarizare în soma (200 ms, 10-15 MV) a neuronului presinaptic pentru a spori rezistența sinaptică (109,6 2,3%, n=13, testul Wilcoxon, p<0,05; Fig. 4a).

pentru a confirma că h-ADF în neuronii piramidali L5 a fost asociat cu creșterea amplitudinii vârfului axonal, s-au obținut înregistrări simultane de celule întregi de la Soma și axonii cut-end (blebs) (50-80 de la soma) în neuronii piramidali L5. Hiperpolarizarea tranzitorie a soma (aproximativ -13 mV) a amplificat amplitudinea depășirii vârfului în axon, dar nu și în soma (+5,5 xtx1,5 față de -0,3 xtx1,1 mV, n=5, Mann–Whitney, p<0,05; Fig. 4b). Viteza depolarizării a fost, de asemenea, mărită (de la 251 la 59 la 289 la 56 MV ms−1, N=5), iar pragul de vârf a fost hiperpolarizat (de la -35,7 la 5,2 la -38,8 la 4,3 MV, n=5). Concluzionăm că H-ADF atât în celulele piramidale CA3, cât și în L5 este asociat cu creșterea amplitudinii vârfului măsurată în axon.

h-ADF este asociat cu semnale axonale de calciu îmbunătățite

am folosit apoi imagistica Ca2+ pentru a determina consecința creșterii induse de hiperpolarizare a amplitudinii vârfului în axon. Neuronii piramidali CA3 au fost umpluți cu 50 de centimetrii Alexa-594; 250 centimetrii Fluo-4 și semnalele de calciu evocate de spike au fost măsurate în boutoni trecători en passanți la distanțe cuprinse între 150 și 250 de centimetrii de la soma (Fig. 5a). Integrala Ca2 + tranzitorie evocată de spike a fost crescută atunci când spike-ul presinaptic a fost evocat în urma unei hiperpolarizări tranzitorii de 20 MV (126 10%, N=5; Fig. 5b). Concluzionăm că, în timpul h-ADF, hiperpolarizarea presinaptică îmbunătățește atât amplitudinea vârfului presinaptic, cât și afluxul de Ca2+ indus de spike, care îmbunătățește ulterior eliberarea glutamatului.

inactivarea canalului Nav în axon determină h-ADF

amplitudinea crescută a vârfului axonal în timpul hiperpolarizării s-ar putea datora recuperării canalelor Nav din inactivare. Pentru a confirma rolul inactivării canalului de sodiu în h-ADF, am folosit un model NEURON al doi neuroni CA3 conectați monosinaptic. Apoi am determinat incidența modificării inactivării canalelor de sodiu în axon pe H-ADF. Când jumătatea inactivării canalelor de sodiu axonale a fost setată la -80 MV (refs 18, 19), hiperpolarizarea somatică a sporit amplitudinea vârfului, sarcina curentului de calciu evocat de vârf și transmisia sinaptică (Fig. 6a, stânga). Acest lucru se datorează recuperării canalelor Nav de la inactivare prin hiperpolarizare (Fig. 6b, stânga). Cu toate acestea, nu s-a produs nicio modificare dacă jumătatea inactivării canalelor de sodiu axonale a fost setată la -70 MV (Fig. 6a, dreapta). În acest din urmă caz, proporția canalelor Nav disponibile este deja foarte mare la potențialul membranei de repaus, producând un AP de amplitudine completă (Fig. 6a, b, dreapta). Prin urmare, recuperarea de la inactivare nu afectează în continuare amplitudinea vârfului presinaptic. Astfel, h-ADF în model se datorează recuperării canalelor Nav de la inactivare și este crescută prin hiperpolarizarea jumătății de inactivare a Nav (Fig. 6c).

Mai Mult, Am folosit modelul nostru de neuroni pentru a simula disponibilitatea axonală a canalului Nav în timpul unei oscilații theta similare cu cea utilizată în Fig. 2b. S-a constatat că canalele Nav se inactivează în timpul depolarizării și se recuperează în timpul hiperpolarizării, explicând modularea EPSC în timpul oscilației (Fig suplimentar. 4). Cu toate acestea, inactivarea este mai rapidă decât recuperarea în timpul oscilației din cauza cineticii Nav mai lente la potențialele depolarizate (Fig suplimentar. 4). Acest lucru explică de ce EPSC-urile produse la 163 ms nu au prezentat niciun h-ADF, deși vârful este emis dintr-un potențial ușor hiperpolarizat (Fig. 2b). De fapt, în acest moment al oscilației canalele Nav nu au avut suficient timp pentru a se recupera de la inactivare (Fig suplimentar. 4).

în ansamblu, aceste rezultate susțin faptul că h-ADF se datorează recuperării canalelor Nav de la inactivare.

densitatea canalului Nav determină puterea h-ADF

h-ADF depinde de disponibilitatea canalelor de sodiu în axon. Astfel, reducerea densității canalelor Nav ar trebui să afecteze h-ADF. De fapt, modelul nostru a arătat că reducerea densității canalului Nav la 70% din starea de control a îmbunătățit h-ADF de la 130 la 180% (Fig. 7a). Parametrul critic aici a fost câștigul de depășire a vârfului presinaptic care depinde de conductanța na activabilă (Fig. 7b). În condiții de control, această valoare era deja ridicată, iar hiperpolarizarea elementului presinaptic de la -78 la -93 mV a sporit amplitudinea vârfului cu 28%. Când densitatea Nav a fost redusă, aceeași hiperpolarizare a sporit amplitudinea ap presinaptică cu 42%.

am verificat experimental că reducerea densității canalului Nav a crescut h-ADF în neuronii CA3. Prin urmare, am blocat parțial canalele Nav cu o concentrație scăzută de tetrodotoxină (TTX) aplicată în baie (15-25 nM). La această concentrație,TTX blochează 80% din curentul Na+, dar păstrează inducerea vârfurilor rapide Na+ 24, 25. În prezența TTX, amplitudinea spike–ului în soma a fost redusă cu 45 XTX 4% (n=9), iar transmisia sinaptică la conexiunile CA3-CA3 a fost redusă cu 55 XTX 8% (N=9; suplimentar Fig. 5). Cel mai important, reducerea proporției de canale Nav activabile cu 15-25 nM TTX s-a dovedit a spori foarte mult h-ADF în neuronii maturi care exprimă no h-ADF (de la 103 la 3% în control la 121 la 4% în prezența TTX, N=6, Wilcoxon p<0,05; Fig. 7c, d). Prin urmare, aceste date confirmă faptul că H-ADF în neuronii CA3 depinde de disponibilitatea canalelor Nav.

canalele Ca2+ de tip T sunt prezente în axon. Acestea ar putea fi activate în timpul secvenței de hiperpolarizare–depolarizare utilizată pentru a induce h-ADF și, prin urmare, poate reprezenta h-ADF. Cu toate acestea, s-a constatat că h-ADF rămâne stabil în prezența mibefradilului de 100 nM, un blocant de canale de tip T (de la 112,2 1,1% în control la 116,2 11,9% cu mibefradil, n=3; Datele nu sunt prezentate), sugerând că canalele Ca2+ de tip T nu participă la H-ADF.

h-ADF promovează sincronizarea rețelei

am testat apoi implicarea h-ADF în sincronizarea rețelei folosind un model de rețea hipocampal format din 80 de celule excitatorii piramidale (celule e) și 20 de celule inhibitoare de tip interneuron (celule i) interconectate (Fig. 8a; a se vedea metodele). celulele e și i au fost alimentate prin intrare stocastică. Rețeaua de celule e a devenit sincronizată, iar oscilațiile din gama gamma au apărut pe măsură ce rezistența sinaptică între celulele e a crescut (Fig suplimentar. 6). Aceste oscilații au fost conduse de celulele i: s-a constatat că activarea celulelor e promovează activarea celulelor i, care la rândul lor au redus la tăcere întreaga rețea (Fig suplimentar. 6). Deoarece h-ADF crește rezistența sinaptică interpiramidală atunci când vârful presinaptic este precedat de un IPSP, h-ADF este un bun candidat pentru a promova aceste oscilații conduse de celule I.

regula h-ADF a fost încorporată în rețea prin creșterea rezistenței sinaptice între celulele e în funcție de potențialul membranei măsurat cu 17 ms înainte de vârf. De fapt, rezistența sinaptică a fost crescută cu 20% dacă potențialul presinaptic a fost sub -84 MV (Fig. 8b). Această regulă a fost derivată direct din valorile măsurate experimental (vezi figurile 1a și 2a). Pentru o rezistență sinaptică a celulei e de 2,8 mS, adăugarea h-ADF în rețea a îmbunătățit semnificativ atât frecvența de ardere, cât și sincronizarea între celulele e (Fig. 8c-e). De fapt, tendința de a oscila în gama gamma a fost mult facilitată dacă H-ADF între celulele e a fost eficientă (Fig. 8e). Interesant este că într-o rețea cu inhibiție de manevră (ECl=-73 mV în loc de -80 MV în stare de control), regula h-ADF nu a îmbunătățit sincronia și nu a promovat oscilațiile gamma (Fig suplimentar. 6). Cu toate acestea, pe măsură ce h-ADF crește rezistența sinaptică între celulele e, efectul său de sincronizare s-ar putea datora pur și simplu creșterii ratei de vârf a rețelei. Pentru a crește rata de vârf fără a afecta rezistența sinaptică, am decis să fixăm rezistența inter-E-cell la 2,5 mS și să creștem frecvența de acționare externă a celulelor e de la 6 la 20 Hz. Am trasat coeficientul de sincronizare față de rata de vârf a rețelei. Chiar dacă sincronizarea s-a dovedit a fi corelată liniar cu rata spike, h-ADF a crescut coeficientul de sincronizare pentru orice rată spike dată în intervalul 4-14-Hz (Fig suplimentar. 6). Acest lucru a arătat că, pentru rata scăzută de vârf, h-ADF crește sincronizarea independent de activitatea medie a rețelei. În concluzie, în modelul nostru, h-ADF crește sincronizarea rețelei și promovează oscilațiile prin legarea forței sinaptice interpiramidale cu activitatea interneuronilor.