frontiere în neuroștiințe

Introducere

în secolul al XIX− lea, la 80 de ani de la descoperirea lactatului (La -) de către Scheele (Kompanje și colab., 2007), Louis Pasteur a observat că celulele de drojdie facultative au crescut mai mult în condiții aerobe decât anaerobe, totuși consumul de zahăr a scăzut, iar fermentarea la alcool a fost mai mică în condiții aerobe (Pasteur, 1861). Anterior, Pasteur (1858) recunoscuse că unele tipuri de drojdie fermentează zahărul La La− în condiții anaerobe, dar nu aerobe. Acest fenomen (atât pentru alcool, cât și pentru fermentația La) a fost numit efectul Pasteur (Barnett și Entian, 2005). Un fenomen paralel a fost descoperit în mușchii scheletici și animalele întregi. Pentru mușchii scheletici Fletcher și Hopkins (1907) au raportat că la− acumulate în mușchii broaștei anaerobe în repaus. În timpul stimulării, concentrația La () a crescut rapid în mușchiul amfibian anaerob, dar a dispărut atunci când acești mușchi obosiți au fost lăsați să se recupereze într-un mediu bogat în oxigen (O2). Ulterior, Meyerhof a demonstrat în mod concludent că glicogenul a fost precursorul mușchilor izolați La− in, iar calea glicolitică completă a fost elucidată la începutul anilor 1940 (Meyerhof, 1942; Brooks și Gladden, 2003). Dogma tradițională a fost construită pe acest cadru și pe alte cercetări privind hipoxia: Piruvatul este produsul final al glicolizei în condiții aerobe și La-este produsul final atunci când O2 este insuficient. Schurr (2006) a discutat această dogmă din punctul de vedere al metabolismului creierului.

este larg acceptat faptul că valorile PO2 intracelulare de 0,5 Torr sau mai puțin au ca rezultat fosforilarea oxidativă limitată de O2, o afecțiune numită disoxie (Connett și colab., 1990), cu producția și acumularea ulterioară. Cu toate acestea, Stainsby și Welch (1966) au raportat efluxul La de la un mușchi contractant aparent bine oxigenat. Ulterior, J Inktbsis și Stainsby (1968) au observat producția și eliberarea La dintr− un mușchi scheletic canin contractant în timp ce cuplul nad+/NADH redox devenea mai oxidat, o indicație a aprovizionării adecvate cu O2. Folosind o abordare diferită, mioglobina cryomicrospectroscopy, pentru a determina PO2 în câine gracilis musculare contractante la rate progresiv mai rapid, Connett și colab. (1986) a constatat creșterea efluxului La fără dovezi de disoxie; cele mai mici valori PO2 au fost, în general, de ordinul a 2 Torr. Richardson și colab. (1998) a folosit spectroscopia de rezonanță magnetică a protonilor (MRS) pentru a determina saturația mioglobinei (și, prin urmare, PO2 intracelular) la om în timpul exercițiului gradat. În experimente paralele cu același tip de exercițiu, La− efluxul a fost determinat prin diferențe de concentrație arteriovenoasă și flux sanguin. Ei au descoperit la-eflux în prezența nivelurilor PO2 intracelulare (~3 Torr) care nu ar trebui să limiteze fosforilarea oxidativă. V.v. (1998) a raportat, de asemenea, că țesutul nervos izolat, stimulat, eliberează lactat în condiții aerobe.

aceste constatări, împreună cu alte dovezi circumstanțiale abundente indică faptul că producția netă de La și efluxul din celule pot apărea în condiții aerobe (Gladden, 2004a,b). De fapt, Brooks (2000) a propus că „lactatul a fost produs tot timpul în celule și țesuturi complet oxigenate. Schurr (2006) a discutat această propunere în detaliu, propunând că „glicoliza continuă întotdeauna la Pasul final, reacția LDH și formarea lactatului” în țesutul cerebral, dar cel mai probabil și în multe alte țesuturi. Ulterior, Schurr și Payne (2007) și Schurr și Gozal (2012) au furnizat dovezi experimentale de susținere a acestui postulat în felii de creier hipocampal. Aici, îmbrățișăm acest concept, propunând că, chiar și în absența acumulării nete de La și în prezența abundenței de O2, La− este produsul final natural al glicolizei. Important, folosim principii biochimice de bază pentru a susține acest concept și pentru a reintroduce naveta lactatului citosol-mitocondrial.

reacția LDH este o reacție aproape de echilibru

La− se formează în următoarea reacție care este catalizată de enzima lactat dehidrogenază (LDH):

constanta de echilibru este puternic în favoarea La− (1,62 Inktiv 1011 M−1) (Lambeth și kushmerick, 2002), iar activitatea LDH este ridicată în raport cu presupusele enzime reglatoare din calea glicolitică din mușchii scheletici (connett și Sahlin, 2011), ficat, rinichi, mușchi cardiac, splină și grăsime (shonk și boxer, 1964), creier (iwangoff și colab., 1980; Morland și colab., 2007) și atât tumori mamare maligne, cât și benigne (Larner și Rutherford, 1978; Balinsky și colab., 1984). Important, activitatea LDH este, de asemenea, ridicată în comparație cu enzimele de reglare presupuse ale oxidării piruvatului; vezi Spriet și colab. (2000) pentru mușchii scheletici, Morland și colab. (2007) pentru brain și Marie și Shinjo (2011) pentru cancerul cerebral. În timp ce măsurătorile raporturilor la− piruvat tisular sunt rare, unele valori de exemplu sunt 7:1 pentru ficat (Liaw și colab., 1985), 10-13:1 pentru mușchii scheletici în repaus (Sahlin și colab., 1976; Liaw și colab., 1985) și valori de până la 159:1 în mușchiul scheletic imediat după exerciții dinamice exhaustive (Sahlin și colab., 1976). Valori de referință pentru raportul La-piruvat din creier, folosind sonde de microdializă, în medie 23: 1 (Reinstrup și colab., 2000; Sahuquillo și colab., 2014). De obicei, raportul crește în urma leziunilor traumatice ale creierului, chiar și în absența ischemiei sau a țesutului scăzut PO2 {Irak 25(Sahuquillo și colab., 2014); 40 (Vespa și colab., 2005)}. În ciuda standardizării tehnicilor, valorile microdializei nu reflectă neapărat concentrațiile reale ale țesuturilor (Sahuquillo și colab., 2014). Cu toate acestea, aceste valori ale microdializei La− la piruvat pentru creierul uman nu sunt departe de valorile (13:1) obținute pe omogenatele creierului de șobolan (Ponten și colab., 1973). În general, relativ ridicat chiar și cu O2 adecvată de aprovizionare, consolidează rolul activității LDH în determinarea La-aspect. Activitatea LDH ridicată și constanta de echilibru la-înclinat a reacției LDH sunt elemente cheie în propoziția că La-este produsul final major al glicolizei în esență toate condițiile metabolice. Pur și simplu, în orice moment glicoliza este operativă, indiferent de tensiunea locală a oxigenului, La− se formează în majoritatea tipurilor de țesuturi. Cu toate acestea, cantitatea de La produsă și acumulată efectiv (adică o creștere ) poate fi modificată de factori precum tensiunea O2, rata metabolică, activitatea mitocondrială disponibilă și alți factori.

destinele piruvatului

potențialele destine ale piruvatului sunt enumerate mai jos. Propunem ca niciunul dintre aceste procese să nu aibă loc la o rată care să se potrivească cu conversia inițială a piruvatului în La−, asigurându− se astfel că La-este întotdeauna produsul final al glicolizei.

1. Eflux din celulă în principal prin transportori monocarboxilați (MCT). Cu toate acestea, La− este întotdeauna prezent într-o concentrație mai mare decât piruvatul și va îndepărta celulele într-un ritm mai rapid decât piruvatul.

2. Conversia la alanină prin reacția de alanină aminotransferază aproape de echilibru care are o constantă de echilibru de aproximativ 1 (Tiidus și colab., 2012), astfel încât concentrația de alanină ar trebui să aproximeze concentrația de piruvat, iar conversia piruvatului în alanină nu ar trebui să diminueze conversia piruvatului în La−.

3. Reacții gluconeogene / Glyconeogene. În țesuturile gluconeogene, piruvatul poate fi transformat în oxaloacetat într-o reacție catalizată de piruvat carboxilază (Pascoe și Gladden, 1996). În gliconeogeneza mușchilor scheletici, piruvatul poate fi transformat în malat cu cataliză de către enzima malică (Pascoe și Gladden, 1996) sau mai probabil la fosfoenolpiruvat prin inversarea reacției piruvat kinazei (Donovan și Pagliassotti, 2000). Aceste reacții reprezintă” inversarea ” glicolizei și încep cu La -, produsul final natural al glicolizei. În creier, glicogenul este cel mai abundent în astrocite și rar la neglijabil în neuroni (Cataldo și Broadwell, 1986). Deși piruvat carboxilaza este exprimată în celule astrogliale cultivate, oligodendrocite, celule microgliale și ependimocite (Murin și colab., 2009), nu suntem conștienți de nicio informație despre capacitatea oricăreia dintre aceste celule de a sintetiza glicogenul din La−.

4. Transportul prin membrana interioară mitocondrială cu conversia ulterioară în acetil-CoA prin reacția piruvat dehidrogenază (PDH) urmată de intrarea în ciclul acidului tricarboxilic și oxidare. Piruvatul traversează membrana mitocondrială interioară prin difuzie simplă și difuzie facilitată; transportorii sunt un MCT (Hashimoto și colab., 2006) și purtătorul de piruvat mitocondrial (Divakaruni și Murphy, 2012). Pentru oxidarea continuă a piruvatului, naveta NADH în matricea mitocondrială de către navetele malat-aspartat și fosfat de glicerol este la fel de importantă ca transportul piruvatului.

prezența constantă a La− și acumularea acesteia în perioadele de stimulare glicolitică este o dovadă că reacția LDH predomină asupra acestor destine alternative de piruvat.

Figura 1 ilustrează un model al metabolismului intracelular pe care îl numim „naveta lactatului citosol-mitocondrial”; originea sa poate fi urmărită la o revizuire a La-metabolismului de către Stainsby și Brooks (1990). Datorită activității LDH ridicate și a unei constante de echilibru departe în direcția La−, La− este întotdeauna rezultatul predominant al glicolizei. Cu toate acestea, formarea La− nu este sinonim cu la− acumulare și a crescut . Mitocondriile constituie o chiuvetă pentru piruvat și în condiții de activitate glicolitică lentă cu O2 amplă, oxidarea în majoritatea celulelor este suficientă pentru a se potrivi îndeaproape producției prin glicoliză; fluxul la transmembranar va varia între eliberarea lentă și absorbția lentă, eliberarea fiind condiția mai tipică. Într− o manieră analogă creatin kinazei și navetei Fosfocreatinei, LDH deține piruvatul și La-în echilibru în întregul citosol celular. În acest scenariu, La – este specia primară care călătorește în vecinătatea reticulului mitocondrial, cel mai probabil în spațiul intermembranar în care LDH este atașat de partea exterioară a membranei mitocondriale interioare (Hashimoto și colab., 2006; Gladden, 2008). Aici, La-este transformat în piruvat pentru intrarea în mitocondrii, având în vedere „chiuveta” relativă pentru piruvat. În același timp, NADH este regenerat din inversarea reacției LDH și perechea sa de electroni este transportată peste membrana mitocondrială interioară de către malat-aspartat și glicerol fosfat navete. O diferență importantă față de naveta fosfocreatină este că două componente cheie, La− și piruvat, spre deosebire de fosfocreatină, pot traversa membrana plasmatică și pot părăsi celula.

paradigma citosol-mitocondrială susține că La-se formează întotdeauna în timpul glicolizei, chiar dacă La− nu se acumulează și este stabil. Desigur, dacă O2 este atât de scăzut încât fosforilarea oxidativă este inhibată, atunci producția de La va depăși rata la care metabolismul oxidativ poate utiliza piruvat și NADH, provocând și la− eflux să crească. De asemenea, dacă activitatea glicolitică crește chiar și cu niveluri ample de O2, ca în contractarea mușchilor scheletici la o intensitate moderată sau poate în astrocite activate (Pellerin și Magistretti, 2011), producția La nu va fi egalată de oxidarea piruvatului și va crește la fel ca și transportul La− din celulă. În mod similar, dacă activitatea enzimei glicolitice este îmbunătățită și/sau funcția mitocondrială (activitatea enzimei oxidative) este reglată în jos, astfel încât glicoliza este favorizată față de oxidare, va exista o nepotrivire continuă între producția de La și oxidarea ulterioară a piruvatului și NADH, rezultând un eflux crescut și La. Această din urmă situație este observată în celulele canceroase „Warburg” (Semenza, 2008) și la pacienții cu BPOC în timpul exercițiului întregului corp in vivo (Maltais și colab., 1996).

cu antrenamentul de exerciții de anduranță, conținutul mitocondrial al mușchilor scheletici este crescut (Holloszy și Coyle, 1984), iar acum există o chiuvetă mai mare pentru piruvat. Creșterea activității oxidative mitocondriale necesită niveluri mai scăzute de stimulatori (de exemplu, ADP) pentru o anumită rată de fosforilare oxidativă; aceiași stimuli sunt stimulatori alosterici ai enzimelor glicolitice cheie, astfel încât glicoliza este redusă. În plus, dacă transportul la-membrană este inhibat, în special în celulele care au deja o nepotrivire în care glicoliza este favorizată față de metabolismul oxidativ, este probabil ca celularul să crească cu efecte potențial dăunătoare asupra celulei (Le Floch și colab., 2011). Mai mult, inhibarea puternică a activității LDH totale în celulele glicolitice ar trebui să prevină echilibrul și, prin urmare, să reducă producția, acumularea și efluxul (Fantin și colab., 2006). Cu toate acestea, efectul modificării modelului izoenzimei LDH independent de inhibarea sau reducerea activității totale a LDH nu este încă rezolvat complet (Downer și colab., 2006).

direcții viitoare: influența Izoformei LDH și aplicațiile asupra metabolismului tumoral

Ce impact are izoforma LDH și cum ar putea fi aplicate aceste cunoștințe în tratamentul bolilor cu metabolism modificat, cum ar fi cancerele?

În primul rând, LDH este o enzimă tetramerică compusă din două subunități proteice care totalizează aproximativ 135 kDa (Cahn și colab., 1962). Tetramerul se poate asambla ca cinci izoenzime separate formând toate combinațiile formei M (musculare) (produs al genei LDH-A) sau forma H (inimă) (produs al genei LDH-B) producând: M4 (=A4 = ldh5), M3H1 (=a3b1 = LDH4), M2H2 (=A2B2 = LDH3), M1H3 (=A1B3 = LDH2) și H4 (=B4 = LDH1). Rezultatele investigațiilor in vitro indică proprietăți cinetice diferite în ceea ce privește afinitatea și inhibarea substratului între aceste izozime. Izozimele dominate de M au valori Km de 3,5-7 ori mai mari pentru piruvat și La decât formele dominate de H. Mai mult, tipurile H4 sunt inhibate de piruvat la concentrații peste ~0,2 mM, în timp ce tipurile M4 sunt puțin afectate de concentrații de piruvat de până la 5 mM (Plagemann și colab., 1960; Stambaugh și Post, 1966; Quistorff și Grunnet, 2011b). Izozima H4 este inhibată de peste 20-40 mM, în timp ce izozima M4 este mai puțin inhibată de înaltă (Stambaugh și Post, 1966). Aceste puncte au fost oferite ca dovadă a diferențelor funcționale în metabolismul celular al diferitelor țesuturi cu formele inimii care promovează oxidarea, în timp ce formele musculare facilitează formarea La− (Cahn și colab., 1962). Distribuția izoenzimei LDH Găsită în natură se potrivește cu aceste caracteristici determinate in vitro. De exemplu, fibrele musculare scheletice rapide, glicolitice, de tip II au o proporție mai mare de izoenzimă LDH de tip M, în timp ce mușchii scheletici de tip I, oxidativ, de tip I, precum și mușchiul cardiac au o proporție mai mare din izoenzima LDH de tip H (Van Hall, 2000). În mod congruent, antrenamentul de exerciții de anduranță scade proporția izozimei LDH de tip M în mușchii instruiți (Van Hall, 2000). În creier, astrocitele (care sunt postulate că au un metabolism glicolitic mai mare), au o proporție mai mare din izozima LDH de tip M, în timp ce neuronii (despre care se afirmă că au un metabolism oxidativ mai mare), au o proporție mai mare din izozima LDH de tip H (Schurr, 2006; Pellerin și Magistretti, 2011). În tumori, celulele glicolitice de tip „Warburg” au o proporție mai mare de izozimă LDH de tip M, în timp ce mai multe celule canceroase oxidative au o proporție mai mare de izozimă LDH de tip H (Semenza, 2008). Deci, dovezile circumstanțiale ale modelelor de distribuție a izoenzimelor LDH coincid cu funcția percepută a izoenzimelor LDH așa cum sunt determinate in vitro.

dovezile citate mai sus au condus la concluzia că modelul izoenzimei LDH este un factor cauzal în metabolismul La. Pentru a elucida în continuare rolul repartizării izozimelor LDH ca coordonator al metabolismului La, Summermatter și colab. (2013) a întreprins o investigație pentru a testa rolul receptorului activat de proliferator peroxizom-coactivator 1-coactivator 1-ca regulator al expresiei subtipului izoenzimei LDH. PGC-1 este cunoscut ca fiind important în coordonarea metabolismului energetic celular (Wu și colab., 1999). Ca răspuns la o varietate de stimuli, PGC-1 inkst stimulează biogeneza mitocondrială, promovează tranziția mușchilor scheletici la un fenotip mai oxidativ și contribuie la metabolismul modificat al carbohidraților și lipidelor (Liang și Ward, 2006).

Summermatter și colab. (2013) a studiat șoarecii transgenici PGC-1 cu specific muscular, precum și șoarecii knock-out PGC-1 cu specific muscular și a găsit (1) sânge mai mic la animalele transgenice și sânge mai mare la animalele knock-out ca răspuns la exercițiile de anduranță și (2) reducerea expresiei LDH de tip M la animalele transgenice și reducerea LDH de tip H la animalele knock-out. Acești autori au ajuns la concluzia, după cum afirmă titlul lor, că „mușchiul scheletic PGC-1 XV controlează homeostazia La a întregului corp prin activarea LDH B dependentă de receptorul legat de estrogen și reprimarea LDH A.”În opinia lor, modelul izoenzimei LDH este un jucător major în metabolismul întregului corp al La−.

cu toate acestea, există avertismente subevaluate cu privire la funcțiile izoenzimelor LDH și rolurile lor potențiale în metabolism. În primul rând, proprietățile cinetice menționate mai sus pentru izoformele LDH au fost determinate in vitro la 20 sau 25 CTC, iar valorile Km pentru piruvat cresc odată cu temperatura, aproximativ dublându-se la 37 CTC față de 25 CTC (Latner et al., 1966; Quistorff și Grunnet, 2011b). Anterior, Newsholme și Leech (1983), Van Hall (2000), Newsholme (2004), Gladden (2008) și Quistorff și Grunnet (2011a), au ridicat întrebări semnificative cu privire la rolul profilurilor izoenzimelor LDH în producția La vs. utilizare, menționând că: (1) enzimele nu modifică constanta de echilibru a unei reacții; (2) reacția LDH este aproape de echilibru, minimizând efectele alosterice; (3) diferențele în LDH funcția izozimei in vivo este posibil destul de mică din cauza temperaturilor fiziologice mai ridicate și a legării de structuri sau alte proteine; (4) concentrațiile de La− și piruvat necesare pentru inhibarea LDH in vitro sunt mult mai mari decât cele mai mari concentrații observate in vivo; și (5) inhibarea LDH in vitro se poate datora urmelor formei enol a piruvatului care sunt mai puțin susceptibile de a fi prezente in vivo.

deși Summermatter și colab. (2013) afirmă cu convingerea că modelul izoformei LDH este un factor major în metabolismul întregului corp, există un defect fatal în proiectarea lor. Ei au ignorat faptul că șoarecii transgenici PGC-1 au crescut proliferarea mitocondrială și enzimele de fosforilare oxidativă, în timp ce șoarecii knockout PGC-1 au reduceri semnificative ale activităților citocrom oxidazei și citratului sintazei (Arany și colab., 2005). În opinia noastră, aceste modificări ale funcției mitocondriale, activitatea LDH totală ridicată observată anterior, indiferent de modelul izozimei, și natura aproape de echilibru a acestei reacții fac concluziile Summermatter și colab. (2013) de nesuportat. Prin urmare, concluzionăm că rolurile fiziologice și biochimice exacte ale izoenzimelor LDH in vivo rămân a fi elucidate definitiv.în cele din urmă, în ceea ce privește metabolismul tumoral, înțelegerea faptului că La− este produsul final al glicolizei este esențială pentru proiectarea intervențiilor pentru direcționarea cancerelor. Pe scurt, experimente de Cori și Cori (1925) și de Warburg și colab. (1927) a arătat că tumorile păreau să consume cu aviditate glucoză și să producă La−. Dogma ulterioară în metabolismul tumorii a susținut că tumorile prezintă un „efect Warburg”, producând și exportând La−. Cu toate acestea, acum știm că nu numai că diferite tipuri de tumori se ocupă de La− diferit (unii sunt producători neți; unii sunt consumatori neți), dar chiar și într− o singură tumoare pot exista navete între diferite tipuri de celule; o celulă la celulă la-shuttle (Semenza, 2008). Multe celule canceroase sunt consumatori săraci de lactat (Sonveaux și colab., 2008) speculații care au stârnit că hipoglicemia protejată la-poate fi terapeutică (Nijsten și van Dam, 2009). În schimb, unele tumori folosesc cu aviditate La – ca combustibil și răspund la La suplimentar− cu proliferare și vascularitate crescută, probabil un rezultat direct al reglării ascendente a factorului de creștere endotelial vascular (VEGF) și a factorului inductibil de hipoxie 1 inkt (HIF-1 inkt). Într-un studiu recent asupra unui model animal al unui sarcom, Goodwin și colab. (2014) a raportat că sarcomageneza la− a condus în absența hipoxiei. În mod uimitor, înțelegerea noastră despre metabolismul La în cancer rămâne neliniștită la aproape 90 de ani de la primele studii ale lui Warburg.

concluzii

înțelegerea noastră despre formarea La s− a schimbat drastic de la descoperirea sa. În mod tradițional, piruvatul a fost considerat a fi produsul final al glicolizei atunci când O2 este prezent și La− produsul final în perioadele de disoxie. La sfârșitul secolului al XX-lea și începutul secolului al XXI− lea s-a descoperit că O2 nu se limitează la fosforilarea oxidativă în majoritatea condițiilor celulare, iar La-este într-adevăr produs chiar și atunci când nu există nicio limitare a ratei de livrare a O2 la mitocondrii. O reflecție suplimentară asupra activității enzimei LDH și a constantei de echilibru a reacției sale avansează propoziția că La-este produsul final primar al glicolizei în majoritatea, dacă nu în toate condițiile metabolice din majoritatea celulelor. Rolul diferitelor izoenzime LDH în metabolism nu este atât de evident pe cât sugerează majoritatea cercetătorilor și concluzionăm că funcția lor exactă rămâne nedescoperită. Indiferent dacă avem sau nu dreptate cu privire la naveta lactatului citosol-mitocondrial așa cum este descris aici și rolul incert al izoformelor LDH va fi dificil de evaluat în condiții in vivo. O abordare este modelarea in silico. Înțelegerea mecanismelor exacte ale glicolizei și metabolismului La nu numai că va aprofunda înțelegerea metabolismului în țesuturile sănătoase, dar va oferi, de asemenea, o perspectivă asupra țesuturilor bolnave sau rănite, cele mai evidente aplicații fiind metabolismul carbohidraților deranjați prezenți în celulele canceroase (Vander Heiden și colab., 2009) și metabolismul cerebral în urma leziunilor cerebrale traumatice (Brooks și Martin, 2014).

Declarație privind conflictul de interese

autorii declară că cercetarea a fost realizată în absența oricăror relații comerciale sau financiare care ar putea fi interpretate ca un potențial conflict de interese.Cahn, R., Zwilling, E., Kaplan, N. și Levine, L. (1962). Natura și dezvoltarea dehidrogenazelor lactice cele două tipuri majore ale acestei enzime formează hibrizi moleculari care se schimbă în machiaj în timpul dezvoltării. Știință 136, 962-969. doi: 10.1126 / știință.136.3520.962

Pubmed Abstract | Pubmed Full Text | CrossRef Full Text | Google Scholar