Materiaalit
soluviljelmä
ihmisen melanooman Mel Z -, Mel IL-ja Mel MTP-solut saatiin N. N. Blokhin National Medical Research Center of oncology50: ssä hoidettujen potilaiden kasvainmateriaalista. BJ-5ta fibroblastit ja rintasyöpä SK-BR-3-solut olivat ATCC: stä. Muut sellit tarjosivat ystävällisesti tohtori E. Svirchevskaja ja E. Kovalenko (Shemyakin-Ovtšinnikov Institute of Bioorganic Chemistry Ras, Moskova, Venäjä). Kaikki solut kasvatettiin RPMI-1640-kasvualustassa, jota täydennettiin 10% FBS: llä, 2 μМ l-glutamiinilla, 100 µg/mL streptomysiinillä ja 100 U/mL penisilliinillä 37 °C: ssa 5% CO2-kostutetussa ilmakehässä. Medium vaihdettiin 3-4 päivän välein. Melaniinipitoisuus arvioitiin mittaamalla DMSO-solulysaattien absorptiospektri (106 solua / ml) Cary 50 UV-Vis-spektrofotometrillä.
Virtaussytometria
solut kerättiin Verseeniliuoksella, pelletoitiin sentrifugoimalla 300 g: ssa 5 minuutin ajan ja suspendoitiin uudelleen RPMI-1640-väliaineessa ilman seerumia niin, että lopulliseksi pitoisuudeksi tuli 106 solua / ml. Tämän jälkeen solususpensiota siirrettiin 100 µl valolta suojattuihin putkiin virtaussytometriaa varten. FMN: n asianmukaiset työratkaisut rpmi-1640-väliaineessa valmistettiin juuri ennen kokeita. Näitä FMN-liuoksia lisättiin putkiin, ja lopullinen FMN-pitoisuus oli 10 µM, 30 µM ja 100 µM. Sen jälkeen soluja inkuboitiin pimeässä CO2-inkubaattorissa 30 minuuttia. Inkubaation lopussa jokaiseen putkeen lisättiin 1 ml kylmää PBS: ää ja soluja sentrifugoitiin (300 g, 4 °c) 5 minuutin ajan. Supernatantti poistettiin ja solut suspendoitiin uudelleen 300 µl: aan kylmää PBS: ää ja siirrettiin jäähän. Fluoresenssia tutkittiin virtaussytometrillä NovoCyte 2000r (ACEA Biosciences) ja NovoExpress v. 1.2.4-ohjelmistolla. Fluoresenssi mitattiin FITC-fluoresenssia vastaavalla kanavalla, ja jokaisesta näytteestä tutkittiin vähintään 10 000 tapahtumaa. FMN: n kertymätason arvioimiseksi soluissa määritettiin kunkin näytteen fluoresenssiarvojen mediaani ja sen jälkeen suhteellinen fluoresenssitaso (F) laskettiin seuraavan kaavan mukaan:
konfokaalimikroskopia
solut kylvettiin 96-kuoppalevyyn (5 × 103 solua kuoppaa kohti), minkä jälkeen ne inkuboitiin yön yli. Tämän jälkeen kennoihin lisättiin 100 µL sopivia FMN-liuoksia (10 µM, 30 µM ja 100 µM) rpmi-1640-väliaineessa, ja levyä inkuboitiin pimeässä CO2-inkubaattorissa 30 minuutin ajan. Tämän jälkeen solut pestiin 3 kertaa kylmällä PBS: llä ja värjättiin lisäksi Hoechst 33258-väriaineella (50 µM) 15 minuutin ajan. Optiset kuvat ja fluoresenssin intensiteettitiedot hankittiin InCell Analyzer 6000: lla ja Cell Analyzer Workstation software v. 3.7.3: ssa (GE Healthcare, USA).
Sytotoksisuustutkimukset
solut kylvettiin 96-kuoppalevyyn (5 × 103 solua kuoppaa kohti), minkä jälkeen ne inkuboitiin yön yli. FMN: n asianmukaiset työratkaisut täydessä RPMI-1640-väliaineessa valmistettiin juuri ennen kokeita. Sitten väliaine poistettiin 96-kuopan levyltä ja kuhunkin kuoppaan lisättiin FMN-liuoksen aliquotit (100 µl). FMN-valoaktivaation indusoimiseksi levyt käsiteltiin valolla 450 nm: ssä säteilyannoksella 0,2 J/cm2–7 J/cm2. Kontrolleina käytettiin soluja, joita ei käsitelty (100%). Solujen elävyys määritettiin MTT-menetelmällä 48 tunnin inkubaation jälkeen. Tätä tarkoitusta varten soluja käsiteltiin MTT-liuoksella (0,5 mg/ml rpmi-1640: ssä) 3 tunnin ajan. sitten väliaine korvattiin 100 µl: lla DMSO: ta muodostuneiden formatsaanikiteiden liuottamiseksi. Optinen tiheys (OD) aallonpituudella 570 nm mitattiin Varioskan Flash reader-laitteella (Thermo Scientific, USA). Solujen (V) elinkelpoisuus FMN-käsittelyn jälkeen ilmaistiin prosentteina kontrolliin verrattuna seuraavan yhtälön mukaisesti:
FMN-valotuotteiden sytotoksisuuden määrittämiseksi FMN-valotuotteiden soveltuvia työliuoksia täydessä rpmi-1640-väliaineessa säteilytettiin 450 nm: ssä (5 J / cm2) ja inkuboitiin yön yli. Tämän jälkeen nämä FMN-alikiintiöt (100 µl) lisättiin soluihin ja inkuboitiin 48 tunnin ajan. MTT-määritys tehtiin edellä kuvatulla tavalla.
Ros-välitteisen valomyrkyllisyyden määrittämiseksi jokaiseen kuoppaan lisättiin FMN-liuoksen alikiintiöitä (100 µl), jotka käsiteltiin valolla 450 nm: ssä (5 J / cm2). FMN: ää sisältävät elatusaineet poistettiin välittömästi käsittelyn jälkeen ja soluja inkuboitiin tuoreessa RPMI-1640-elatusaineessa 48 tunnin ajan. MTT-määritys tehtiin edellä kuvatulla tavalla.
apoptoosi-ja nekroosimääritys
solut kylvettiin 96-kuoppalevyihin (5 × 103 solua kuoppaa kohti), minkä jälkeen ne inkuboitiin yön yli. Tämän jälkeen kennoihin lisättiin 100 µL sopivia FMN-liuoksia (10 µM, 30 µM ja 100 µM) rpmi-1640-väliaineessa, ja levyä inkuboitiin pimeässä CO2-inkubaattorissa 30 minuutin ajan. Tämän jälkeen soluja säteilytettiin 450 nm: n laserilla annoksella 5 J/cm2. Tämän jälkeen solut pestiin johdonmukaisesti kylmällä PBS: llä ja sitovalla puskurilla ja värjättiin Annexin V-FITC: llä, propidiumjodidilla (pi) ja Hoechst 33258: lla huoneenlämmössä sitovassa puskurissa 15 minuutin ajan. Optiset kuvat ja fluoresenssin intensiteettitiedot hankittiin InCell Analyzer 6000: lla ja Cell Analyzer Workstation software v. 3.7.3: ssa (GE Healthcare, USA).
Elektrodituotanto
hiilinanoelektrodit syövytettiin 0,1 M NaOH: ssa, 10 mM KCl-liuoksessa 30-40 syklin aikana 10 sekunnin ajan kukin luodakseen onkalon hiilipintaan. Käytetty potentiaali oli V: n muotoinen amplitudin ollessa 1,5–2 V. platinalaskeuma toteutettiin lakaisemalla potentiaali 0: sta -1500 mV: iin verrattuna Ag/AgCl: ään liuoksessa, joka sisälsi 2 mM kloroplatinihappoa (H2PtCl6, Sigma). Sykliset voltammogrammit 1 mM ferroseenimetanolissa (FcMeOH, Sigma) saatiin alkuhiilielektrodille, elektrodille nanokyvyillä ja platinalla tuotantoprosessin ohjaamiseksi. PT: n Laskeuma lisäsi vain hieman nanoelektrodin efektiivistä geometrista pinta-alaa (mistä on osoituksena voltammogrammi 1 mM: n fcmeoh: n hapettumista varten), mutta lisäsi dramaattisesti sen katalyyttistä aktiivisuutta kohti ROS: n pelkistymistä. Nanoelektrodi polarisoitui nopeudella 600 mV vs AG / AgCl (H2O2: n diffuusiorajoitettua havaitsemista varten) ja sitä lähestyttiin manuaalisesti yksittäisen syöpäsolun nesteeseen tai pintaan. Kalibroinnissa käytimme liuoksia, joiden H2O2-pitoisuus (Sigma) oli erilainen välillä 10-7-10-4 M.
ROS-mittaus sähkökemiallisella anturilla
tulokset saatiin kuvattuna earlier47: nä muutamin muutoksin. Siten tässä työssä käytettävien elektrodien käyttöön otettu muunnos on platinan parempi tarttuvuus hiilielektrodiin johtuen syövytyksestä hiilikerrokseen ennen Pt-laskeumaa. Kaupallisesti saatavilla oleva levy, muotoinen hiilinanoelektrodit eristetty kvartsi (ICAPPIC Limited, UK) halkaisija 100-500 nm, käytettiin tuotannon anturit Ros detection. Elektrodin suhteellisen inertti hiilipinta funktionalisoitiin edelleen redox-aktiivisten lajien havaitsemiseksi. Elektrodipositoitu platinakerros parantaa elektrokatalyyttistä aktiivisuutta vähentämällä voimakkaasti reaktiivisten happilajien vähentämisen tuottamaa ylipotentiaalia. Parantaaksemme platinan tarttumista hiilipistokkeeseen, – syövytimme hiilielektrodiin nanokaviteetin. Olemme käyttäneet sähkökemiallista menetelmää luodaksemme pieniä lovia hiilinanoelektrodien kärkiin51. Platinananosensorien valmistus suoritettiin kahdessa vaiheessa: etsaus emäksisessä liuoksessa ja platinointi. Kaikkia vaiheita ohjattiin tarkasti sähkökemiallisilla mittauksilla. Uskomme, että nanoelektrodi on herkkä sekä lyhytikäisille että pitkäikäisille ROS-muodoille. Äskettäin osoitimme, että flaviinimononukleotidin (FMN) vesiliuoksen happituotanto indusoituu sinisen valon säteilytyksellä. Tämän tuloksen perusteella osoitamme (lisätietoa 9) hiilinanoelektrodin polarisoidun vasteen +800 mV vs AG/AgCl ROS-tuotannossa FMN: n vesiliuoksessa sinisen valon säteilytyksellä.
solut kylvettiin petrimaljaan, minkä jälkeen ne inkuboitiin yön yli. Sitten soluja inkuboitiin 30 min 100 µM FMN: llä pimeässä ja pestiin 3 kertaa PBS: llä. Sitten platinoitu nanoelektrodi otettiin varovasti käyttöön käyttämällä tarkkaa mikromanipulaattoria yksisoluun optisessa ohjauksessa käänteisellä mikroskoopilla. Elektrodin manipulointiin ja säätöön käytimme micromanipulator Patchstaria (Scientifica, UK). Keräsimme syklisen voltammetric-datan patch-clamp-vahvistinmallilla 2400 (A-M Systems, USA). Signaalin tallennus suoritettiin monitoimisella I / O-laitteella USB-6211 (National instruments, USA) ja tietokoneohjelmalla WinWCP. Kaikki mittaukset tehtiin taulukossa Käänteinen mikroskooppi Nikon (Japani). Kaikissa mittauksissa vertailuelektrodina käytettiin AG/AgCl-elektrodia.
ROS-mittaus loistelampulla
Sytoplasmaisen Ros-arvon arviointi suoritettiin cellrox-Syvänpunaisella loistelampulla (Molekylaariset koettimet / Thermo). Mel IL-ja M-3-melanoomasolut (5 × 103) kylvettiin 96-kuoppalevyille (nunc, Tanska), inkuboitiin 2,5 µM: lla Cellrox Deep Rediä täydessä RPMI-1640-väliaineessa 30 minuutin ajan ja pestiin PBS: ssä kolme kertaa. Sitten soluihin lisättiin 100 µL soveltuvia työliuoksia (10 µM, 30 µM ja 100 µM) FMN: ää rpmi-1640-väliaineessa ilman Fenolipunaa ja levyä inkuboitiin pimeässä CO2-inkubaattorissa 30 minuutin ajan. Tämän jälkeen soluja säteilytettiin 450 nm: n laserilla annoksella 5 J/cm2. Solujen tumia värjättiin lisäksi 50 µM Hoechst 33258-väriliuoksella 15 minuutin ajan. Mel IL-ja a375-melanoomasolujen Optiset kuvat ja Cellrox Deep Red fluoresenssi-intensiteettitiedot hankittiin InCell Analyzer 6000: lla ja Cell Analyzer Workstation software v. 3.7.3: lla (GE Healthcare, USA).
Melaniinipitoisuuden määritys
käytämme rutiinimääritystä spektrofotometriseen melaniininmääritykseen pienin muutoksin52. Neljä melanoomasolulinjaa: Mel MTP, Mel IL, Mel Z, A375 ja kaksi normaalia (ihmisen keratinosyyttien HaCaT ja ihmisen ihon fibroblastien BJ-5ta) solulinjaa laskettiin ja pelletoitiin, jotta lopullinen pitoisuus olisi 2 × 106 solua/ml. Solunsisäisen melaniinipitoisuuden määrittämiseksi solupelletit liuotettiin 1 metriin NaOH: ta, joka sisälsi 10% (v/v) DMSO: ta, ja niitä inkuboitiin 80 °C: ssa 1 tunnin ajan. Inkubaation jälkeen lysaatit sentrifugoitiin (3000 g 5 minuutin ajan) ja absorbanssi mitattiin soluttomassa väliaineessa 405 nm: ssä. Kaikki tulokset ilmoitetaan kolmen riippumattoman kokeen melaniinipitoisuudelle normalisoitujen absorbanssiintensiteettien keskiarvona fibroblasteissa ± keskihajonta (SD). Tilastollinen analyysi tehtiin GraphPad Prism – versiolla 5.0 (GraphPad Software, La Jolla California USA).
eläinkokeet
primaarikasvainten hoito
urospuoliset Balb/c nu / nu–hiiret, jotka olivat iältään 6-7 viikkoa, ostettiin Shemyakin-Ovtšinnikovin Bioorgaanisen kemian instituutin (Venäjän tiedeakatemia) eläintilalta, ja niitä pidettiin valvotuissa ympäristöolosuhteissa tuuletetussa eläinkaapissa a-Box 80 (Noroit, Ranska) 12 tunnin pimeänvalojaksolla ja niille sallittiin steriilin veden ja SPF-hiiriruoan käyttö vapaasti. Kaikki eläinkokeet tehtiin eurooppalaisten ja Venäjän kansallisten eläinkokeita koskevien ohjeiden mukaisesti, ja FSBSI: n eläin-ja eettisen arviointikomitea ”N. N. Blokhin NMRCO” hyväksyi ne viitenumerolla 2017-034.
ksenografttimallin aikaansaamiseksi Mel IL-ja a375-solut kerättiin Versene-liuoksella, pelletoitiin sentrifugoimalla 300 g: n painoon 5 minuutin ajan ja suspendoitiin uudelleen RPMI-1640-väliaineeseen ilman seerumia. Melanoomasolususpensio oli sekoitettu (1:1 tilavuus) Matrigelin (BD Biosciences) kanssa, ja saatu solususpensio (2 × 106 solua injektiota kohden) istutettiin ihon alle hiirten oikeaan kylkeen, jotta varmistetaan onnistunut kasvaimen aloitus ja kasvaimen kasvun mittaaminen.
FMN-hoito aloitettiin 10.päivänä rokotuksen jälkeen, kun kasvaimen koko oli 100-120 mm3. FMN-liuos (150 µl, 10 µg/ml) ruiskutettiin hiiriin suonensisäisesti retroorbitaalisen poskiontelon kautta, ja kasvaimia säteilytettiin sinisellä valolla 450 nm: ssä 15 minuutin ajan, kunnes lopullinen annos oli 20 J/cm2.
kasvaimen tilavuus arvioitiin kalipaation standardimenetelmällä ja laskettiin seuraavalla kaavalla, olettaen hemi-ellipsoidin muodon:
valoaktivoidun FMN: n Antitumor-aktiivisuus määritettiin arvioimalla tuumorikasvun estonopeus (TGI%) laskettuna seuraavasti::
fotodynaaminen hoito kaukaisten kasvainten
käytimme c57bl/6 hiiriä 6-7 viikon iässä, ostettu eläintilalta Shemyakin–Ovtšinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Venäjän tiedeakatemia. Kaikki eläinkokeet tehtiin eurooppalaisten ja Venäjän kansallisten eläinkokeita koskevien ohjeiden mukaisesti, ja FSBI: n eläin-ja eettisen arviointikomitea hyväksyi ne. Blokhin NMRCO”, viitenumero 2017-034.
B16-F10 hiiren melanoomasolut kerättiin Versene-liuoksella, pelletoitiin sentrifugoimalla 300 g: ssa 5 minuutin ajan ja suspendoitiin uudelleen RPMI-1640-väliaineeseen ilman seerumia. Melanoomasolususpensiota sekoitettiin (1:1 tilavuus) Matrigelin (Bd Biosciences) kanssa, ja saatu solususpensio (5 × 105 solua injektiota kohden) istutettiin ihon alle hiirten oikeaan ja vasempaan kylkeen, jotta voitiin varmistaa onnistunut kasvaimen aloitus ja kasvaimen kasvun mittaaminen.
FMN: n Anto alkoi 4.päivänä inokulaation jälkeen, kun tuumorikoko oli 60 ± 16 mm3 FMN-liuosta (150 µl, 10 mg/ml) ruiskutettiin hiiriin suonensisäisesti retroorbitaalisen poskiontelon kautta, ja kasvaimia säteilytettiin sinivalolla 450 nm: ssä 15 minuutin ajan, kunnes lopullinen annos oli 20 J / cm2. Käytettiin kahta kontrolliryhmää: FMN-injektiota ilman valosäteilytystä; lasersäteilyä ilman FMN-injektiota. Fotoaktivoidun FMN: n kasvaimen tilavuus ja antitumor-aktiivisuus arvioitiin edellä kuvatulla tavalla.
Hematoksyliini-ja Eosiinivärjäys
eläinten kaularangan sijoiltaanmeno lopetettiin 24 tunnin kuluessa PDT: n jälkeen. Kaikki kerätyt kasvaimet kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 24 tunnin ajan ja upotettiin sitten parafiiniin. Kudososat (4 µm paksu) värjättiin hematoksyliinilla ja eosiinilla.
tilastollinen analyysi
kaikki kokeet tehtiin kolmena kappaleena, ellei toisin mainittu, ja jokainen koe toistettiin kolme kertaa itsenäisesti. Tiedot ilmoitetaan keskiarvona ± SD. Eroja pidettiin tilastollisesti merkitsevinä, kun P-arvot olivat alle 0, 05. Kaikki tilastolliset analyysit tehtiin Grappad Prism-ohjelmistolla (Grappad Software, La Jolla, San Diego, CA, USA).