pentru a valorifica puterea endonucleazelor homing vizate, Laboratorul Jerome a lucrat pentru a optimiza un sistem util de livrare atât pentru studiile in vivo, cât și pentru cele in vitro. Ei au folosit un sistem de livrare a virusului adeno-asociat (AAV) pentru a viza ganglionii trigemeni ai mouse-ului cu oricare dintre cele două endonucleaze specifice HSV: HSV1m5, care este conceput pentru a scinda proteina virion VP5 genă și HS1m8, care vizează gena care codifică ADN polimeraza catalitică subunitate. Crearea mutațiilor în oricare dintre aceste gene provoacă perturbarea genomului viral și previne producerea virionului. Pentru a crește în continuare efectele tratamentului Trex-2, a fost co-tradusă o endonuclează 3′-5′, care s-a dovedit a crește mutageneza direcționată. După stabilirea sistemului, laboratorul a început munca in vitro concentrându-se pe neuroni, tipul de celule relevant din punct de vedere biologic. Culturile de neuroni au fost co-transduse cu HSV1m5 sau 8 și Trex-2 și apoi infectate cu HSV. Culturile tratate au arătat o reducere cu 50% a titrului viral, precum și prezența mutațiilor în HSV prin testul de endonuclează T7 1 și secvențierea clonală. Odată ce a fost stabilită întreruperea infecției litice, cercetătorii au început să analizeze efectele asupra diferitelor etape ale infecției cu HSV. Folosind culturi infectate de neuroni cu HSV și tratați ulterior cu HSV1m5 sau 8 cu Trex-2 în diferite momente de timp, cercetătorii ar putea simula diferitele etape ale infecției. Au tratat culturile la 7 zile (faza acută), 14 zile (faza latentă acută/ timpurie târzie) și 32 de zile (faza latentă) și nu au găsit nicio modificare a efectului indiferent de faza virală. Acest lucru sugerează că HSV este în mod similar susceptibil la mutageneza endonucleazei, indiferent de faza virală. Nivelurile mutațiilor la nivelul locului țintă au variat între 4,5-7,6% și 1,1-6,6% pentru HSV1m5 și respectiv HSV1m8. În prezent, acesta este primul studiu care analizează activitatea endonucleazei la neuronii infectați latent.
încurajați de rezultatele in vitro, cercetătorii au efectuat studii in vivo folosind șoareci infectați cu HSV, urmate 32 de zile mai târziu de injecția Aav (exprimând HSV1m5 sau 8 și Trex-2). Neuronii de la șoareci au fost eșantionați la 30 de zile după injectarea AAV pentru titrul viral, încărcătura virală și mutațiile genomului HSV. Grupul a prezentat mutații de 1-2% la 2/4 șoareci pentru HSV1m5 și la 3/4 șoareci pentru HSV1m8. Cu toate acestea, încărcătura virală a acestor animale a fost similară între animalele de control și cele tratate. Răspândirea virusului a fost întârziată cu o zi la animalele tratate, dar a atins niveluri similare în timp, comparativ cu cele netratate. După ce a reflectat asupra rezultatelor, Dr. Jerome a spus: „Aceasta este prima dată când o infecție virală latentă reală a fost stabilită la un animal și apoi dezactivată, chiar parțial, folosind terapia cu endonuclează. Deci, reprezintă un pas critic spre aducerea unor astfel de terapii la aplicarea umană. Principala provocare este acum creșterea potenței terapiei, astfel încât toate sau aproape toate virusurile latente să fie dezactivate genetic. Investigăm nucleaze mai noi, mai eficiente, cum ar fi CRISPR/Cas, și evaluăm noi metode de livrare a nucleazelor către neuronii infectați in vivo.”În viitor, această terapie poate duce la un nou mod de gândire despre tratarea bolilor latente, cum ar fi HSV și HIV, pe care le considerăm în prezent incurabile.
finanțarea pentru această cercetare a fost asigurată de Institutele Naționale de sănătate și Fundația Canadiană.
Aubert M,Madden EA,Loprieno m,DeSilva Feelixge HS,Stensland L,Huang ML,Greninger AL,Roychoudhury P,Niyonzima N,Nguyen T,Magaret A,Galleto R,Piatra D,Jerome KR. 2016. Întreruperea in vivo a HSV latent prin terapia cu endonuclează de designer. JCI Insight, 1(14).