Probanden
Einunddreißig gesunde, widerstandstrainierte Männer (22,1 ± 5,0 Jahre, 180 ± 0,1 cm, 86,1 ± 13,0 kg, 18,1 ± 6,4% Körperfett) wurden über das von der Institution genehmigte Studienprotokoll informiert Prüfungsausschuss an der Baylor University vor der Teilnahme. Der Trainingsstatus wurde selbst gemeldet, und Personen, denen vor dem Studium mindestens ein Jahr Erfahrung fehlte, wurden ausgeschlossen. Darüber hinaus wurden Probanden ausgeschlossen, wenn sie: 1) eine Vorgeschichte von Stoffwechsel-, Bluthochdruck-, Hepatorenal-, Muskel-Skelett-, Autoimmun- oder neurologischen Erkrankungen hatten; 2) nahmen derzeit Schilddrüsen-, antihyperlipidämische, hypoglykämische, antihypertensive oder androgene Medikamente ein; und 3) hatten Nahrungsergänzungsmittel eingenommen, die die Muskelmasse und / oder den anabolen / katabolen Hormonspiegel innerhalb von drei Monaten nach Beginn der Studie beeinflussen können.
Basistests
Geeignete Probanden wurden über eine mündliche und schriftliche Erklärung des Studiendesigns mit dem Studienprotokoll vertraut gemacht. Die Probanden unterzeichneten eine Einverständniserklärung nach Aufklärung, schlossen persönliche und medizinische Anamnese ab und absolvierten vor dem Basistest einen Wingate-Test zur anaeroben Kapazität. Die Probanden wurden angewiesen, 48 Stunden lang auf anstrengende Übungen zu verzichten und 10 Stunden lang zu fasten vor dem Basistest (d. H. Tag 0), der 3-4 Tage nach der Einarbeitung stattfand, um die Aufzeichnung der Nahrungsaufnahme zu ermöglichen. Diese Studie verwendete ein doppelblindes, placebokontrolliertes, paralleles Studiendesign, bei dem die Probanden gleichmäßig nach Alter und Körpermasse in Cluster eingeteilt wurden.
Versuchsprotokoll
An den Tagen 0, 25 und 50 meldete sich jedes Subjekt nach einem 10-stündigen Fasten im Labor. Die Körpergröße wurde unter Verwendung der Standardanthropometrie und die Gesamtkörpermasse unter Verwendung einer kalibrierten elektronischen Healthometer-Digital-Dehnungsmessstreifen-Waage (Bridgeview, IL) mit einer Genauigkeit von ± 0,02 kg gemessen. Die Körperzusammensetzung wurde dann mit einem kalibrierten Hologic Discovery W Dual-Energy-Röntgenabsorptiometer (DXA) (Hologic Inc., Bedford, MA), während Blutdruck und Ruheherzfrequenz unter Verwendung von Standardverfahren bestimmt wurden. Die Probanden spendeten dann ungefähr 25 ml Nüchternblut unter Verwendung von Standard-Venenpunktionstechniken für hämatologische, klinische Chemie-Panels und später Zytokin- und Hormonanalysen. Zwei 10-ml-Serumseparations-Vacutainer-Röhrchen und ein 5-ml-K3-EDTA-Vacutainer-Röhrchen wurden nacheinander zur Blutentnahme unter Verwendung mehrerer Probenphlebotomietechniken in den Vacutainerhalter eingeführt. Vollblut wurde sofort auf ein vollständiges Blutbild analysiert, während Serum-Vacutainer-Röhrchen bei Raumtemperatur für 15 min bei 1.500 g zentrifugiert wurden, der Serumüberstand in Mikrozentrifugenröhrchen überführt wurde und die Serumproben für nachfolgende Hormon- und Metabolitenanalysen bei -20 ° C gelagert wurden. Nur an den Tagen 0 und 50 spendeten die Probanden ungefähr 60 mg Skelettmuskel aus dem Vastus lateralis unter Verwendung der Bergstrom-Biopsietechnik. Die Ober- und Unterkörperkraft wurde unter Verwendung von Standard-1RM-Testverfahren mit einem Bankdrücken und einer 35 ° -Hüftschlittenmaschine (Nebula, Versailles, OH) bewertet. Test-Retest Zuverlässigkeit dieser Festigkeitstests an widerstandstrainierten Probanden in unserem Labor haben eine hohe Zuverlässigkeit für das Bankdrücken (r = 0,94) und Beindrücken (r = 0,91) ergeben. Nach der Bestimmung des Hüftschlittens 1RM ruhten sich die Probanden 10 Minuten aus, bevor sie einen 30-Sekunden-Wingate-anaeroben Kapazitätstest auf einem computergesteuerten Fahrradergometer (Lode Excalibur, Lode, Groningen, Niederlande) durchführten, um die anaerobe Kraft des Unterkörpers zu beurteilen. Dieser Test bestand darin, dass jedes Subjekt 30 Sekunden lang auf dem Fahrradergometer gegen eine Standardbelastung von 0,075 kg · kg-1 Körpergewicht sprintete. Test-Retest-Zuverlässigkeit für absolute Spitzenleistung und mittlere Leistung in unserem Labor haben ebenfalls hohe Zuverlässigkeitswerte ergeben (r = 0,69 und r = 0.95 bzw. P < 0.05).
Perkutane Muskelbiopsien
Muskelbiopsien wurden an den Tagen 0 und 50 vor allen Krafttests durchgeführt, um mögliche myofibrilläre Störungen aufgrund von Bewegung zu vermeiden . Die Probanden wurden angewiesen, 48 Stunden vor jeder Muskelbiopsie auf Bewegung zu verzichten. Muskel wurde aus dem lateralen Teil des Vastus lateralis in der Mitte zwischen Patella und Beckenkamm des dominanten Beins unter Verwendung einer 5-mm-Biopsienadel mit angewendeter Absaugung extrahiert . Kurz gesagt, 1,5 ml 1.0% Lidocain HCl wurde subkutan injiziert, bevor eine kleine Pilotinzision vorgenommen wurde. Unter Verwendung von Double-Chop-Verfahren und angewendetem Absaugen wurden zunächst das gesamte sichtbare Fett und Bindegewebe entfernt, bevor es in flüssigem Stickstoff blitzgefroren wurde. Alle Proben wurden anschließend bis zu späteren Analysen bei -80°C gelagert.
Supplementierungsprotokoll und Ernährungsüberwachung
In doppelblinder Weise nahmen die Probanden über 50 Tage nach dem Basistest vier 250-mg-Kapseln mit einem Maisöl-Placebo oder AA (X-Factor, Molecular Nutrition, Jupiter, FL) ein. Ergänzungen wurden in Kapselform hergestellt und in generischen Flaschen von Molecular Nutrition verpackt. Die Compliance wurde überwacht, indem die Probanden nach 25 und 50 Tagen Supplementierung leere Ergänzungsflaschen zurückgeben ließen. In Übereinstimmung mit früheren Richtlinien und in dem Bemühen, sicherzustellen, dass die Energie- und Proteinzufuhr ausreichend war, um die Muskelhypertrophie zu erleichtern, wurden alle Probanden angewiesen, die Kalorienzufuhr um etwa 500 kcal · Tag-1 zu erhöhen, während auch eine geschätzte Proteinaufnahme von 2 g · kg-1 · Tag-1 im Vergleich zur Baseline-Diätanalyse . Die Probanden erhielten ein im Handel erhältliches Mahlzeitenersatzpulver (Lean Body, Labrada Nutrition, Houston, TX), das ungefähr 290 Kilokalorien, 24 g Kohlenhydrate, 45 g Protein und 1 g Fett pro Portion enthielt, um den oben genannten Energie- und Proteinbedarf zu decken. Abhängig von der Ausgangsproteinaufnahme wurden die Probanden angewiesen, morgens und / oder unmittelbar nach jedem Training 1 bis 2 Päckchen des Mahlzeitenersatzpräparats einzunehmen . Zusätzlich wurden die Probanden angewiesen, den regelmäßigen Verzehr von Lebensmitteln zu vermeiden, von denen bekannt ist, dass sie reich an ω-3-Fettsäuren sind, einschließlich Fischöl, Leinsamenöl, Kaltwasserfisch, Olivenöl, Sesamöl, Erdnussbutter, N-Acetyl-Cystein, konjugierte Linolsäure sowie entzündungshemmende Medikamente einschließlich Paracetamol, Ibuprofen, Aspirin und andere nichtsteroidale entzündungshemmende Medikamente . Nahrungsaufnahme sowie Linolsäure (18:2, ω-6), Linolensäure (18:3, ω-3) und AA-Aufnahme wurden mit 4-tägigen diätetischen Rückrufen an den Tagen 0, 25 und 50 überwacht und mit der Food Processor III Nutrition Software (ESHA Nutrition Research, Salem, OR) bewertet.
Widerstandstrainingsprotokoll
Über einen Zeitraum von 50 Tagen absolvierten die Probanden ein 4-tägiges · Woche-1-Split-Body-Programm mit linearer Periodisierung des Widerstandstrainings. Oberkörperlifte beinhalteten Bankdrücken, Latzug, Schulterpresse, Sitzreihen, Schulterzucken, Brustfliegen, Bizeps-Locken und Trizeps-Press-Downs, während Unterkörperlifte Beinpresse, Rückenverlängerung, Step-Ups, Beinlocken, Beinverlängerung enthielten, Fersenheben und Bauchknirschen zweimal pro Woche. Die Probanden führten 3 Sätze mit 10 Wiederholungen mit so viel Gewicht durch, wie sie pro Satz heben konnten (d. H. 60-80% von 1RM). Die Ruhezeiten zwischen den Übungen betrugen nicht mehr als 3 Minuten, während der Rest zwischen den Sätzen 2 Minuten nicht überschritt. Die Schulung wurde im Student Life Center der Universität durchgeführt, in Schulungsprotokollen dokumentiert und von ausgewiesenen Mitarbeitern zur Überprüfung der Einhaltung und Überwachung des Fortschritts unterzeichnet. Dieses Protokoll wurde in früheren Forschungen gezeigt, um signifikante Gewinne in Muskelkraft, Muskelausdauer und fettfreie Masse zu fördern .
Serum- und Vollblutanalysen
Serum- und Vollblutproben wurden verwendet, um die klinische Sicherheit während der Supplementierungsprotokolle zu bewerten. Serum samples were assayed for comprehensive metabolic panels including glucose, total protein, blood urea nitrogen (BUN), creatinine, BUN/creatinine ratio, uric acid, aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), creatine kinase (CK), lactate dehydrogenase (LDH), gamma-glutamyl transpeptidase (GGT), albumin, globulin, sodium, chloride, calcium, carbon dioxide, total bilirubin, alkaline phosphatase (ALP), triglycerides, cholesterol, HDL and LDL using a Dade Dimension XL clinical chemistry system (Dade Behring Inc., Newark, DE). Vollständige Blutzellzahlen einschließlich Erythrozytenzahlen, Hämoglobin, Hämatokrit, mittleres Zellvolumen, mittleres korpuskuläres Hämoglobin, mittlere korpuskuläre Hämoglobinkonzentration, Verteilungsbreite der roten Blutkörperchen, Anzahl der weißen Blutkörperchen, Neutrophile, Lymphozyten, Monozyten, Eosinophile und Basophile wurden mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung des Cell-DYN 1800 (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) analysiert. Die Test-zu-Test-Zuverlässigkeit (innerhalb und zwischen) der Durchführung dieser Assays lag zwischen 2 und 6% für einzelne Assays mit einem durchschnittlichen Variationskoeffizienten (C V) von 3,0%. Die Proben wurden doppelt durchgeführt, um die Ergebnisse zu überprüfen, ob die beobachteten Werte außerhalb der Kontrollwerte und / oder der klinischen Normen lagen nach Standardverfahren.Nachfolgende Serumproben wurden später auf Cortisol (CORT), freies Testosteron (fTEST), Gesamttestosteron (tTEST), Interleukin-6 (IL-6), Prostaglandin E2 (PGE2) und Prostaglandin F2a (PGF2a) untersucht. Kommerzielle Enzymimmunoabsorber-Assays wurden verwendet, um die Serumkonzentrationen von PGF2a, PGE2 und IL-6 (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) und CORT, fTEST und tTEST (Diagnostic Systems Laboratories, Webster, TX) zu analysieren. Die C V der Durchführung dieser UVP-basierten Assays lag zwischen 3,0 und 5,0%.
Gesamt-RNA-Isolierung
Die gesamte zelluläre RNA wurde aus dem Homogenat von Biopsieproben mit einer einphasigen Lösung von Phenol und Guanidinisothiocyanat extrahiert, die im TRI-Reagenz (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) . Die Gesamt-RNA-Konzentrationen aus jeder Probe wurden spektrophotometrisch mit einer optischen Dichte von 260 nm (OD260) bestimmt, wobei die Endkonzentration auf 200 ng · µl-1 eingestellt wurde, indem die rohen Gesamt-RNA-Extrakte in DEPC-behandeltes nukleasefreies H2O verdünnt wurden. Es wurde gezeigt, dass dieses Verfahren nicht abgebaute RNA liefert, die frei von DNA und Proteinen ist, wie durch prominente 28S- und 18S-ribosomale RNA-Banden sowie ein OD260 / OD280-Verhältnis von ungefähr 2,0 angezeigt. Die RNA-Proben wurden bis zu späteren Analysen bei -80°C gelagert.
Reverse Transkription und klonale DNA-Synthese
Die standardisierten Lösungen der gesamten zellulären RNA wurden wie zuvor beschrieben reverse transkribiert, um klonale DNA (cDNA) zu synthetisieren . Kurz gesagt, ein Reverse-Transkriptions-Reaktionsgemisch wurde 40 Minuten bei 42 ° C inkubiert, 5 Minuten auf 85 ° C erhitzt und dann schnell auf Eis gekühlt, wobei das cDNA-Produkt erhalten wurde. Die cDNA-Template-Ausgangskonzentrationen wurden vor der Echtzeit-Amplifikation der Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) auf 200 ng · µl-1 standardisiert, indem rohe cDNA-synthetisierte Produkte spektrophotometrisch bei einer Wellenlänge von 260 nm nachgewiesen und in nukleasefreiem H2O verdünnt wurden. Die standardisierten cDNA-Lösungen wurden bei -80 ° C eingefroren, bis eine Echtzeit-RT-PCR durchgeführt wurde.
RT-PCR
Anti-Sense- und Sense-Oligonukleotid-Primerpaare wurden unter Verwendung kommerziell erhältlicher Beacon Designer-Software (Bio-Rad, Hercules, CA) aus bekannten mRNA-Sequenzen konstruiert, die in der GenBank Nucleotide Database veröffentlicht und kommerziell synthetisiert wurden (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). Zur Isolierung der drei adulten MHC-Isoformen (Typ I, IIa und IIx) wurden folgende 5′ Sense- und 3′ Anti-Sense-Oligonukleotid-Primer verwendet: Typ I MHC mRNA (5′ Primer: Basen 776-796, 3′ Primer: Basen 1398-1378, GenEMBL AC X06976), Typ IIa MHC mRNA (5′ Primer:: basen 1785-1805, 3′ Primer: Basen 2440-2420, GenEMBL AC AF111784), Typ IIx MHC mRNA (5′ Primer: Basen 1138-1158, 3′ Primer: Basen 1746-1726, GenEMBL AC AF111785). Diese Primer amplifizieren Fragmente von 141, 145 und 148 Basenpaaren für Typ I, IIa, IIx MHC. β-Aktin wurde als externer Referenzstandard zum Nachweis einer relativen Veränderung der Menge an Ziel-mRNA verwendet aufgrund seiner Berücksichtigung als konstitutiv exprimiertes Housekeeping-Gen amplifizieren diese β-Aktin-Primer ein PCR-Fragment von 135 Basenpaaren. Zweihundert ng cDNA wurden zu jeder der vier PCR-Reaktionen für MHC Typ I, -IIa und -IIx und β-Aktin gegeben. Im Einzelnen enthielt jede PCR-Reaktion die folgenden Mischungen: 2 µl cDNA-Template wurden zusammen mit 12,5 µl 2 × SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA), 1,5 µl Sense- und Anti-Sense-Primern und 7,5 µl nukleasefreiem dH2O] zugegeben. Jede PCR-Reaktion wurde mit einem Thermocycler (Bio Rad, Hercules, CA) amplifiziert, und die Amplifikationssequenz umfasste einen Denaturierungsschritt bei 95 ° C für 30 Sekunden, ein Primer-Annealing bei 55 ° C für 30 Sekunden und eine Verlängerung bei 72 ° C für 60 Sekunden. Die RT-PCR wurde über 40 Zyklen durchgeführt, wobei nach jedem Zyklus die emittierte Fluoreszenz des SYBR-Grünfluorophors gemessen wurde. Eine Emission von Fluoreszenz tritt aufgrund der Integration des SYBR-Grüns in die während der PCR-Reaktion erzeugte doppelsträngige cDNA auf. Alle CT-Werte wurden im linearen Teil der Amplifikation bewertet und nach der Amplifikation wurde eine DNA-Schmelzkurvenanalyse durchgeführt, um sicherzustellen, dass die einzelnen Genprodukte in Abwesenheit von Primer-Dimeren amplifiziert wurden. Die Quantifizierung aller mRNA wurde relativ zur β-Aktin-Expression exprimiert. Ein Vergleich der CT-Wertverhältnisse wurde verwendet, um Änderungen der basalen Genexpression zwischen den AA- und PLA-Gruppen zu vergleichen. Die Agarosegelelektrophorese unter Verwendung von 25 µl Aliquots der finalisierten PCR-Reaktionsgemische wurde in 1 durchgeführt.5% Agarosegele unter Verwendung von 1 × Tris-Borsäure-EDTA (TBE) -Puffer und beleuchtet mit einem UV-Transilluminator (Chemi-Doc XRS, Bio-Rad, Hercules, CA), um eine positive Amplifikation der Ziel-mRNA zu verifizieren (Daten nicht gezeigt) . Die C V für MHC I, IIa und IIx betrugen 2,06%, 3,18% bzw. 2,73% .
Quantifizierung des Gesamtmuskelproteins
Das aus dem Gesamt-RNA-Isolationsverfahren verbleibende Gesamtprotein wurde mit Isopropanol, Ethanol und 0,3 M Guanidinhydrochlorid isoliert. Myofibrilläres Protein wurde mit 0 isoliert.1% Natriumdodecylsulfat (SDS), bevor der Proteingehalt spektrophotometrisch unter Verwendung eines Bradford-Assays bei einer Wellenlänge von 595 nm bestimmt wird. Eine Standardkurve wurde unter Verwendung von (r2 = 0,98, P < 0,001) Rinderserumalbumin als Standard erzeugt und relativ zum Muskelfeuchtgewicht dargestellt. Jede Proteinprobe wurde anschließend für das anschließende Immunoblotting auf 50 µg Protein pro 30 µl SDS-Puffer verdünnt. Der Cv für myofibrilläres Protein betrug 2,03% .
Quantifizierung der MHC-Protein-Isoformen
Die Zusammensetzung der MHC-Protein-Isoformen in jeder Muskelhomogenatprobe wurde durch automatisierte SDS-PAGE unter Verwendung von Experion Pro260-Chips (Bio-Rad, Hercules, CA) bestimmt. Ungefähr 6 µl Aliquots jeder Probe wurden in jede Probenwanne auf dem Mikrochip pipettiert. Jede unbekannte Probe wurde aus 4 µl der Proteinverdünnung jedes Probanden (oder 4 µl der Molekulargewichtsleiter), 2 µl Probenpuffer mit β-Mercaptoethanol und 84 µl entionisiertem Wasser hergestellt. Basierend auf den Ergebnissen von Gazith und Kollegen wurde erwartet, dass alle drei MHC-Isoformen in der 200-210-Kilodatton-Region innerhalb des Polyacrylamidgels relativ zur Molekulargewichtsleiter wandern. Die Gele wurden mit der Experion-Software (Bio-Rad, Hercules, CA) digital visualisiert und die MHC-Konzentrationen in jeder Probe wurden durch Vergleichen der beliebigen Dichte jeder MHC-Isoform mit den beliebigen Dichten von Molekulargewichtsmarkern mit bekannten Konzentrationen bewertet. Der C V der Proteinbanden ≥10 kD betrug ≤1,1%.
Protein Immunoblotting
Die Quantifizierung des PGF2a (FP) – und PGE2 (EP3) -Rezeptors wurde bei Raumtemperatur durchgeführt, indem das gesamte Muskelprotein aus dem Homogenat extrahiert und 50 µg des Gesamtproteins mit einem Bio-Dot-Protein-Blotting-System (Bio-Rad, Hercules, CA) auf Nitrozellulosemembranen slot-blottiert wurden. Die geblotteten Membranen wurden 1 Stunde mit Blockierlösung auf einer Orbitalwippe inkubiert, dekantiert und Membranen für insgesamt drei Wäschen 5 Minuten mit einer TTBS-Waschlösung inkubiert. Die Membranen wurden mit spezifischen Anti-FP-Rezeptor- und Anti-EP3-Rezeptor-polyklonalen Antikörpern (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI), verdünnt auf 4 µg·ml-1, für 1 bis 2 Stunden auf einer Orbitalwippe inkubiert. Primäre Antikörperlösungen wurden dann dekantiert und die Membranen mit TTBS-Lösung für 5 Minuten auf einer Orbitalwippe für insgesamt drei Wäschen gewaschen. Die TTBS-Waschlösung wurde dekantiert und die Membranen mit einer sekundären biotinylierten Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörperlösung (Bio-Rad, Hercules, CA) für 1 Stunde auf einer Orbitalwippe inkubiert. Anschließend wurde die sekundäre biotinylierte Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörperlösung dekantiert und die Membranen in TTBS-Waschlösung für insgesamt drei Wäschen bei 5 Minuten pro Wäsche inkubiert. Die Membranen wurden mit einer Streptavidin-biotinylierten alkalischen Phosphatase-Komplexlösung (Bio-Rad, Hercules, CA) für 1 Stunde auf einer Orbitalwippe inkubiert. Schließlich wurde die Streptavidin-biotinylierte alkalische Phosphatase-Komplexlösung dekantiert und die Membranen dreimal mit TTBS-Lösung bei 5 Minuten pro Wäsche auf einem Orbitalschüttler gewaschen. Farbentwicklungslösung enthaltend BCIP/NBT (Bio-Rad, Hercules, CA) wurde zugegeben und die Farbentwicklung über 30 – 60 Minuten überwacht. Die Farbentwicklung wurde durch Inkubation der Membran in doppelt destilliertem H2O für 10 Minuten auf einer Orbitalwippe gestoppt. Blotted Membranen wurden mittels Densitometrie mit einem Chemi-Doc XRS Imaging System (Bio-Rad, Hercules, CA) digitalisiert und die Banddichte in integrierten Dichteeinheiten relativ zum Muskelgewicht ausgedrückt.
Statistische Analyse
Statistische Analysen wurden mit SPSS (Version 14.0, SPSS Inc., Chicago, IL). Vollblut-, Serum-, Leistungs- und Körperzusammensetzungsvariablen wurden unter Verwendung einer 2 × 3-Varianzanalyse (Gruppe × Testsitzung) (ANOVA) mit univariaten Tests mit wiederholten Messungen analysiert. Die MHC-Protein-, FP- und EP3-Rezeptorproteinspiegel wurden unter Verwendung einer separaten 2 × 2-ANOVA (Gruppe × Testsitzung) mit wiederholten Messungen analysiert. Zusätzlich wurde im Falle eines signifikanten Haupteffekts für die Gruppe für jede Gruppe eine Einweg-Anova mit wiederholten Messungen bei Testsitzungen durchgeführt, um Unterschiede zwischen den Tests zu bewerten. Unabhängige t-Tests wurden verwendet, um die Veränderungen der MHC-mRNA-Expression nach 50 Tagen Supplementierung zu analysieren. Zusätzlich zur Raw-Score-Analyse wurde eine Delta-Score-Analyse (d. H. Tag 0-Werte subtrahiert von Tag 25 und / oder 50) für Variablen durchgeführt, die am Tag 0 eine Fremdvariation zwischen den Gruppen aufwiesen. Wie bei Raw-Scores erwähnt, wurde eine 2 × 3 (Gruppe × Testsitzung) Varianzanalyse (ANOVA) mit wiederholten Messungen univariate Tests wurden verwendet, um Delta-Scores für Körperzusammensetzung, Leistungsvariablen und Hormonkonzentrationen zu analysieren, während eine 2 × 2 wiederholte Messungen ANOVA wurde verwendet, um alle intramuskulären Delta-Scores zu analysieren. In Fällen, in denen gleiche Abweichungen innerhalb der Gruppen nicht angenommen werden konnten, wurde der Hunyhs-Feldt-Epsilon-Korrekturfaktor verwendet, um die F-Verhältnisse innerhalb der Gruppe anzupassen. Unter Umständen, in denen statistische Trends zu existieren schienen (d. H. P = 0,05 bis 0.10) wurden die Effektgrößen auch als partielles Eta-Quadrat (np2) angegeben. Partielle Eta-Quadrat-Effektgrößen wurden wie zuvor beschrieben als schwach (np2 ≤ 0,01), mittel (np2 = 0,06), stark = (np2 = 0,14) bestimmt. Die Signifikanz für alle statistischen Analysen wurde mit einem Alpha-Wert von 0,05 bestimmt. Es sollte beachtet werden, dass eine a-priori-Leistungsanalyse des Designs ergab, dass eine n-Größe von 15 Teilnehmern pro Behandlung eine hohe Leistung ergeben würde (> 0.8) für Kriteriumvariable Delta-Werte von 0.75 bis 1.25. Es sollte auch beachtet werden, dass eine Post-hoc-Ausreißeranalyse unter Verwendung von Boxplots unter Umständen durchgeführt wurde, in denen signifikante Gruppeninteraktionen auftraten, um sicherzustellen, dass keine Ausreißer vorhanden waren. Alle Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichungen (SD) angegeben.