materialer
cellekultur
humant melanom Mel s, Mel IL og Mel MTP-celler blev opnået fra tumormaterialet hos patienter, der blev behandlet på N. N. Blokhin National Medical Research Center of oncology50. BJ-5ta fibroblaster og brystkræft SK-BR-3 celler var fra ATCC. De andre celler blev venligt leveret af Drs. E. Svirchevskaya og E. Kovalenko (Shemyakin – Ovchinnikov Institut for bioorganisk kemi RAS, Moskva, Rusland). Alle celler blev dyrket i rpmi-1640 vækstmedium suppleret med 10% FBS, 2 liter L-glutamin, 100 liter/ml streptomycin og 100 U/ml penicillin ved 37 liter C i en 5% CO2 befugtet atmosfære. Mediet blev udskiftet hver 3-4 dage. Melaninindholdet blev estimeret ved at måle absorptionsspektret i DMSO-cellelysater (106 celler pr.ml) ved hjælp af et Cary 50 UV-Vis-spektrofotometer.
Strømningscytometri
celler blev høstet med Versene-opløsning, pelleteret ved centrifugering ved 300 g i 5 minutter og resuspenderet i RPMI-1640-medier uden serum til den endelige koncentration på 106 celler pr.ml. Derefter blev 100 liter af cellesuspensionen overført til de lysbeskyttede rør til strømningscytometri. Passende arbejdsopløsninger af FMN i RPMI-1640 medium blev fremstillet umiddelbart før forsøgene. Disse FMN-opløsninger blev føjet til rørene, og den endelige FMN-koncentration var 10 liter, 30 liter og 100 liter. Derefter blev cellerne inkuberet i mørket i en CO2-inkubator i 30 minutter. Ved slutningen af inkubationen blev 1 ml kold PBS tilsat til hvert rør, og cellerne blev centrifugeret (300 g, 4 liter C) i 5 minutter. Supernatanten blev fjernet, og cellerne blev resuspenderet i 300 liter kold PBS og overført til is. Fluorescens blev undersøgt ved hjælp af et strømningscytometer NovoCyte 2000r (ACEA Biosciences) og Novoekspress v. 1.2.4 program. Fluorescens blev målt på en kanal svarende til FITC fluorescens, og mindst 10.000 hændelser blev undersøgt for hver prøve. For at estimere akkumuleringsniveauet for FMN i cellerne blev medianfluorescensværdierne i hver prøve bestemt, og derefter blev det relative fluorescensniveau (F) beregnet efter følgende formel:
konfokal mikroskopi
celler blev podet i en 96-brøndsplader (5 til 103 celler pr.brønd) efterfulgt af inkubation natten over. Derefter blev 100 liter passende arbejdsopløsninger af FMN (10 liter, 30 liter og 100 liter) i rpmi-1640-medium tilsat til celler, og pladen blev inkuberet i mørke i en CO2-inkubator i 30 minutter. Derefter blev cellerne vasket 3 gange med kolde PBS og desuden farvet med Hoechst 33258 farvestof (50 liter) i 15 minutter. Optiske billeder og fluorescensintensitetsdata blev indhentet ved hjælp af InCell-analysator 6000 og i Celleanalysator-Arbejdsstationsprogram v. 3.7. 3 (GE Healthcare, USA).
Cytotoksicitetsstudier
celler blev podet i en 96-brøndsplade (5 til 103 celler pr.brønd) efterfulgt af inkubation natten over. Passende arbejdsopløsninger af FMN i fuld RPMI-1640 medium blev fremstillet umiddelbart før forsøgene. Derefter blev mediet fjernet fra 96-brøndspladen, og FMN-opløsnings alikvoter (100 liter) blev tilsat i hver brønd. For at inducere FMN-fotoaktivering blev pladerne behandlet med lys ved 450 nm, bestrålingsdosis 0,2 J/cm2–7 J/cm2. Celler uden nogen behandling blev anvendt som kontroller (100%). Cellelevedygtighed blev bestemt ved MTT-analyse efter 48 h inkubation. Til dette formål blev celler behandlet med MTT-opløsning (0,5 mg/ml i RPMI-1640) i 3 timer. derefter blev mediet erstattet med 100 liter DMSO for at opløse dannede formasankrystaller. Den optiske densitet (OD) ved 570 nm blev målt ved hjælp af Varioskan Flash reader (Thermo Scientific, USA). Levedygtigheden af celler (V) efter FMN-behandling blev udtrykt i % sammenlignet med kontrollen ifølge følgende ligning:
Med henblik på at bestemme cytotoksiciteten af FMN-fotoprodukter blev passende arbejdsopløsninger af FMN i fuld RPMI-1640-medium bestrålet ved 450 nm (5 J/cm2) og inkuberet natten over. Derefter blev disse FMN-alikvoter (100 liter) tilsat til cellerne og inkuberet i 48 timer. MTT-assay blev udført som beskrevet ovenfor.
Med henblik på at bestemme ROS-medieret fototoksicitet blev FMN-opløsnings alikvoter (100 liter) tilsat i hver brønd og behandlet med lys ved 450 nm (5 J/cm2). FMN-holdige medier blev fjernet umiddelbart efter behandlingen, og celler blev inkuberet i friske rpmi-1640-medier i 48 timer. MTT-analyse blev udført som beskrevet ovenfor.
apoptose og nekroseassay
celler blev podet i en 96-brøndsplade (5 til 103 celler pr.brønd) efterfulgt af inkubation natten over. Derefter blev 100 liter passende arbejdsopløsninger af FMN (10 liter, 30 liter og 100 liter) i rpmi-1640-medium tilsat til celler, og pladen blev inkuberet i mørke i en CO2-inkubator i 30 minutter. Derefter blev celler bestrålet ved anvendelse af 450 nm laser i en dosis på 5 J/cm2. Derefter blev cellerne konsekvent vasket med kold PBS og bindingsbuffer og farvet med bilag V-FITC, propidiumiodid (PI) og Hoechst 33258 ved stuetemperatur i bindingsbuffer i 15 minutter. Optiske billeder og fluorescensintensitetsdata blev indhentet ved hjælp af InCell-analysator 6000 og i Celleanalysator-Arbejdsstationsprogram v. 3.7. 3 (GE Healthcare, USA).
Elektrodeproduktion
carbon nanoelektroderne blev ætset i en 0,1 M NaOH, 10 mM KCl-opløsning under 30-40 cyklusser i 10 sekunder hver for at skabe et hulrum i carbonoverfladen. Det påførte potentiale var V-formet med amplitude på 1,5-2 V. Platinaflejring blev udført ved at feje potentialet fra 0 til -1500 mV vs Ag/AgCl i en opløsning indeholdende 2 mM chloroplatinsyre (H2PtCl6, Sigma). De cykliske voltammogrammer i 1 mM ferrocenmethanol (FcMeOH, Sigma) blev opnået for den indledende carbonelektrode, for elektroden med nanokaviteter og med platin for at kontrollere produktionsprocessen. Aflejringen af Pt øgede kun det effektive geometriske overfladeareal af nanoelektroden (som det fremgår af voltammogrammet til iltning af 1 mM FcMeOH), men forbedrede dramatisk dens katalytiske aktivitet mod ROS-reduktion. Nanoelektroden blev polariseret ved 600 mV vs Ag / AgCl (til diffusionsbegrænset påvisning af H2O2) og nærmede sig manuelt til væsken eller overfladen af den enkelte kræftcelle. Til kalibreringen anvendte vi opløsninger med forskellig koncentration af H2O2 (Sigma) i området 10-7-10-4 M.
ROS-måling med elektrokemisk sonde
resultaterne blev opnået, som det blev beskrevet tidligere47 med nogle ændringer. Således er den indførte modifikation af elektroder, der anvendes i dette arbejde, den bedre vedhæftning af platin til carbonelektrode på grund af ætsning af et hulrum i carbonlag før Pt-aflejring. Kommercielt tilgængelig disk, formede carbon nanoelektroder isoleret i kvarts (ICAPPIC Limited, UK) med diameter 100-500 nm, blev brugt til produktion af sensorer til ROS-detektion. Den relativt inerte carbonoverflade af elektroden blev yderligere funktionaliseret til påvisning af redoksaktive arter. Et elektrodepositum platinlag forbedrer den elektrokatalytiske aktivitet ved drastisk at reducere den overpotentiale, der produceres ved reduktion af reaktive iltarter. For at forbedre vedhæftningen af PLATINET til carbonpluggen ætsede vi en nanocavity i carbonelektroden. Vi har brugt en elektrokemisk metode til at skabe små hak i spidserne af carbon nanoelektrodes51. Fremstilling af platin nanosensorer blev udført i to faser: ætsning i alkalisk opløsning og platinisering. Alle faser blev nøjagtigt styret af elektrokemiske målinger. Vi mener, at nanoelektroden er følsom både over for kortvarige og langlivede ROS-former. For nylig demonstrerede vi, at singlet-iltproduktionen i vandig opløsning af flavinmononukleotid (FMN) induceres ved bestråling med blåt lys. Baseret på dette resultat demonstrerer vi (supplerende data 9) respons af carbon nanoelektrode polariseret ved +800 mV vs Ag/AgCl på ROS produktion i vandig opløsning af FMN under blå lysbestråling.
celler blev podet i en petriskål efterfulgt af inkubation natten over. Derefter blev cellerne inkuberet i 30 minutter med 100 liter FMN i mørke og vasket 3 gange med PBS. Derefter blev den platinerede nanoelektrode omhyggeligt introduceret ved anvendelse af den præcise mikromanipulator i enkeltcellen under optisk kontrol med inverteret mikroskop. Til elektrode manipulation og justering brugte vi micromanipulator PatchStar (Scientifica, UK). Vi indsamlede en cyklisk voltammetrisk data med patch-clamp forstærker Model 2400 (A-M Systems, USA). Optagelse af signalet blev udført med multifunktionel I / O-enhed USB-6211 (National instruments, USA) og computerprogram. Alle målinger blev udført på bordet af inverteret mikroskop Nikon (Japan). I alle målinger blev Ag / AgCl elektrode anvendt som referenceelektrode.
ROS måling med fluorescerende probe
evaluering af den cytoplasmatiske ROS blev udført ved hjælp af Cellroks dyb rød fluorescerende probe (molekylære prober / Thermo). Kort fortalt blev mel IL-og M-3-melanomceller (5 g 103) podet i 96-brøndsplader (Nunc, Danmark) og inkuberet med 2,5 g Cellroks dyb rød i fuld rpmi-1640 medier i 30 minutter og vasket i PBS tre gange. Derefter blev 100 liter passende arbejdsopløsninger (10 liter, 30 liter og 100 liter) FMN i RPMI-1640 medium uden Phenolrød tilsat til celler, og pladen blev inkuberet i mørke i en CO2-inkubator i 30 minutter. Derefter blev celler bestrålet ved anvendelse af 450 nm laser i en dosis på 5 J/cm2. Cellekerner blev desuden farvet med 50 liter Hoechst 33258 farvestofopløsning i 15 minutter. Optiske billeder og dybrøde fluorescensintensitetsdata for mel IL-og a375-melanomceller blev erhvervet ved hjælp af InCell-analysator 6000 og i Celleanalysatorarbejdsstationsprogram v. 3.7.3 (GE Healthcare, USA).
bestemmelse af melaninindhold
Vi bruger rutinemæssig analyse til spektrofotometri melaninbestemmelse med mindre ændringer52. Fire melanomcellelinjer: Mel MTP, Mel IL, Mel å, A375 og to normale (humane keratinocytter HaCaT og humane hudfibroblaster BJ-5ta) cellelinjer blev talt og pelleteret for at have en endelig koncentration på 2 liter 106 celler/ml. Til bestemmelse af intracellulært melaninindhold blev cellepellets opløst i 1 M NaOH indeholdende 10% (v/v) DMSO og inkuberet ved 80 liter C i 1 time. Efter inkubation blev lysaterne centrifugeret (3000 g i 5 minutter), og absorbansen blev målt i cellefrie medier ved 405 nm. Alle resultaterne er udtrykt som middelværdi af absorbansintensiteter normaliseret til melaninindholdet i fibroblaster, der er standardafvigelse (SD) i tre uafhængige eksperimenter. Statistisk analyse blev udført med GraphPad Prism version 5.0 (GraphPad, La Jolla California USA).
dyreforsøg
terapi af primære tumorer
mandlige BALB/c nu / nu–mus i alderen 6-7 uger blev købt fra Animal farm of Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, og anbragt under kontrollerede miljøforhold i udluftet dyreskab a-boks 80 (Noroit, Frankrig) ved en 12 timers mørkelyscyklus og tillod fri adgang til sterilt vand og SPF-mus. Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med europæiske og russiske nationale retningslinjer for dyreforsøg og blev godkendt af fsbsi ‘ s dyre-og etiske vurderingsudvalg “N. N. Blokhin NMRCO”, referencenummer 2017-034.Mel IL og a375 celler blev høstet med Versene-opløsning, pelleteret ved centrifugering ved 300 g i 5 minutter og resuspenderet i rpmi-1640 medier uden serum. Melanomcellesuspension blev blandet (1:1 volumen) med Matrigel (BD Biosciences), og den opnåede cellesuspension (2 kg 106 celler pr.injektion) blev implanteret subkutant i musens højre flanke for at sikre vellykket tumorinitiering og tumorvækstmålinger.
Administration af FMN startede på dag 10 efter podning, når tumorstørrelsen nåede 100-120 mm3. FMN-opløsning (150 liter, 10 liter/ml) blev injiceret i musene intravenøst gennem en retro-orbital sinus, og tumorerne blev bestrålet med blåt lys ved 450 nm i 15 minutter til den endelige dosis på 20 J/cm2.
tumorvolumen blev estimeret ved standardmetoden for kalipation og blev beregnet ved hjælp af følgende formel under forudsætning af en hemi-ellipsoid form:
antitumoraktivitet af fotoaktiveret FMN blev bestemt ved at evaluere tumorvækstinhiberingshastigheden (TGI%) beregnet som:
fotodynamisk terapi af fjerne tumorer
vi brugte C57BL/6 mus i alderen 6-7 uger, købt fra animal farm of Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences. Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med europæiske og russiske nationale retningslinjer for dyreforsøg og blev godkendt af fsbi “N. N. Blokhin NMRCO”, referencenummer 2017-034.
B16-F10 musemelanomceller blev høstet med Versene-opløsning, pelleteret ved centrifugering ved 300 g i 5 minutter og resuspenderet i rpmi-1640-medier uden serum. Melanomcellesuspension blev blandet (1: 1 volumen) med Matrigel (BD Biosciences), og den opnåede cellesuspension (5 liter 105 celler pr.injektion) blev implanteret subkutant i højre og venstre flanke af musene for at sikre vellykket tumorinitiering og tumorvækstmålinger.
Administration af FMN startede på dag 4 efter inokulation, når tumorstørrelsen nåede 60 liter 16 mm3 FMN-opløsning (150 liter, 10 mg/ml) blev injiceret i musene intravenøst gennem en retro-orbital sinus, og tumorerne blev bestrålet med blåt lys ved 450 nm i 15 minutter til den endelige dosis på 20 J / cm2. To kontrolgrupper blev anvendt: FMN-injektion uden lysbestråling; laserbestråling uden FMN-injektion. Tumorvolumen og antitumoraktivitet af fotoaktiveret FMN blev estimeret som det blev beskrevet ovenfor.
Hæmatoksylin og eosin farvning
dyr blev ofret ved cervikal dislokation i 24 timer efter PDT. Alle høstede tumorer blev fikseret med 4% paraformaldehyd i 24 timer og derefter indlejret med paraffin. Vævssektioner (4 liter tykke) blev farvet med hæmatoksylin og eosin.
statistisk analyse
alle eksperimenter blev udført i tre eksemplarer, medmindre andet er angivet, og hvert eksperiment blev gentaget tre gange uafhængigt. Data udtrykkes som middelkr. Forskelle blev anset for at være statistisk signifikante, når P-værdier var mindre end 0,05. Alle statistiske analyser blev udført med GraphPad prisme (GraphPad, La Jolla, San Diego, CA, USA).