Materiály
Buněčné kultury
Lidskému melanomu Mel Z, Mel IL, a Mel MTP buňky byly získány z nádoru materiálu pacientů, kteří podstoupili léčbu v N. N. Blokhin Národní Lékařské Výzkumné Centrum oncology50. Fibroblasty BJ-5ta a buňky SK-BR-3 karcinomu prsu pocházely z ATCC. Ostatní buňky byly laskavě poskytnuty Dr. E. Svirchevskaya A E. Kovalenko (Shemyakin – Ovchinnikovův Ústav bioorganické chemie RAS, Moskva, Rusko). Všechny buňky byly pěstovány v RPMI-1640 růstové médium doplněno 10% FBS, 2 μМ L-glutaminu, 100 µg/mL streptomycin, a 100 U/mL penicilinu při 37 °C v 5% CO2 zvlhčené atmosféře. Médium bylo nahrazeno každé 3-4 dny. Obsah melaninu byl odhadnut měřením absorpčního spektra v buněčných lyzátech DMSO (106 buněk na ml) pomocí spektrofotometru Cary 50 UV-Vis.
průtoková cytometrie
Buňky byly sklizeny s Versene řešení, peletována centrifugací při 300 g po dobu 5 min a resuspendovány v RPMI-1640 média bez séra na konečnou koncentraci 106 buněk na ml. Poté bylo 100 µl buněčné suspenze přeneseno do zkumavek chráněných světlem pro průtokovou cytometrii. Bezprostředně před experimenty byly připraveny vhodné pracovní roztoky FMN v médiu RPMI-1640. Tyto roztoky FMN byly přidány do zkumavek a konečná koncentrace FMN byla 10 µM, 30 µM a 100 µM. Poté byly buňky inkubovány ve tmě v inkubátoru CO2 po dobu 30 minut. Na konci inkubace se do každé zkumavky přidá 1 ml studeného PBS a buňky se odstředí (300 g, 4 °C) po dobu 5 minut. Supernatant byl odstraněn a buňky byly resuspendovány ve 300 µl studeného PBS a přeneseny do ledu. Fluorescence byla zkoumána pomocí průtokového cytometru NovoCyte 2000R (ACEA Biosciences) a softwaru NovoExpress v. 1.2.4. Fluorescence byla měřena na kanálu odpovídajícím fluorescenci FITC a pro každý vzorek bylo vyšetřeno nejméně 10 000 událostí. Pro odhad akumulace úroveň FMN v buňkách, medián fluorescence hodnoty v každém vzorku byla stanovena, a pak relativní fluorescence úroveň (F) byl vypočten podle následujícího vzorce:
Konfokální mikroskopie
Buňky byly nasazeny do 96 dobře desky (5 × 103 buněk na jamku), následuje inkubace přes noc. Poté bylo do buněk přidáno 100 µL vhodných pracovních roztoků FMN (10 µM, 30 µM a 100 µM) v médiu RPMI-1640 a destička byla inkubována ve tmě v inkubátoru CO2 po dobu 30 minut. Poté byly buňky 3krát promyty studeným PBS a dodatečně obarveny barvivem Hoechst 33258 (50 µM) po dobu 15 minut. Optické obrazy a fluorescenční intenzita údaje byly získány pomocí InCell Analyzátor 6000 a V Cele Analyzátoru Workstation software v. 3.7.3 (GE Healthcare, USA).
studie Cytotoxicity
buňky byly naočkovány do 96jamkové destičky (5 × 103 buněk na jamku), po níž následovala inkubace přes noc. Bezprostředně před experimenty byly připraveny vhodné pracovní roztoky FMN v plném médiu RPMI-1640. Potom bylo médium odstraněno z 96jamkové desky a do každé jamky byly přidány alikvoty roztoku FMN (100 µl). K vyvolání FOTOAKTIVACE FMN byly destičky ošetřeny světlem při 450 nm, ozařovací dávkou 0,2 J / cm2-7 J / cm2. Buňky bez jakékoli léčby byly použity jako kontroly (100%). Životaschopnost buněk byla stanovena testem MTT po inkubaci 48 hodin. Pro tento účel byly buňky ošetřeny roztoku MTT (0,5 mg/ml RPMI-1640) po dobu 3 h. Poté bylo médium nahrazeno 100 µl DMSO, aby se rozpustily tvořil krystaly formazanu. Optická hustota (od) při 570 nm byla měřena pomocí Varioskan Flash reader (Thermo Scientific, USA). Životaschopnost buněk (V) po léčbě FMN byla vyjádřena v % ve srovnání s kontrolou podle následující rovnice:
s Cílem určit cytotoxicitu FMN fotoprodukty, vhodné pracovní roztoky FMN v plné RPMI-1640 médiu, ozářených při 450 nm (5 J/cm2) a inkubovány přes noc. Poté byly tyto alikvoty FMN (100 µl) přidány do buněk a inkubovány po dobu 48 hodin. MTT test byl proveden, jak je popsáno výše.
za účelem stanovení fototoxicity zprostředkované ROS byly do každé jamky přidány alikvoty roztoku FMN (100 µl) a ošetřeny světlem při 450 nm (5 J/cm2). Média obsahující FMN byla odstraněna ihned po ošetření a buňky byly inkubovány v čerstvém médiu RPMI-1640 po dobu 48 hodin. MTT test byl proveden, jak je popsáno výše.
Apoptóza a nekróza test
Buňky byly nasazeny do 96 dobře desky (5 × 103 buněk na jamku), následuje inkubace přes noc. Poté bylo do buněk přidáno 100 µL vhodných pracovních roztoků FMN (10 µM, 30 µM a 100 µM) v médiu RPMI-1640 a destička byla inkubována ve tmě v inkubátoru CO2 po dobu 30 minut. Poté byly buňky ozařovány pomocí 450 nm laseru v dávce 5 J / cm2. Pak, buňky byly důsledně omýt studenou PBS a závazné pufru a barveny s Annexin V-FITC, propidium jodid (PI) a Hoechst 33258 při pokojové teplotě v závazné pufru po dobu 15 min. Optické obrazy a fluorescenční intenzita údaje byly získány pomocí InCell Analyzátor 6000 a V Cele Analyzátoru Workstation software v. 3.7.3 (GE Healthcare, USA).
výroba elektrod
uhlíkové nanoelektrody byly leptány v roztoku 0,1 M NaOH, 10 mM KCl během 30-40 cyklů po dobu 10 sekund, aby se vytvořila dutina v povrchu uhlíku. Aplikovaný potenciál je ve tvaru s amplitudou 1,5–2 V. Platinum depozice byla provedena pomocí zametání potenciál od 0 do -1500 mV vs. Ag/AgCl v roztoku obsahující 2 mM chloroplatinic kyseliny (H2PtCl6, Sigma). Cyklické voltammograms v 1 mM ferocenové methanol (FcMeOH, Sigma) byly získány pro uhlíkové elektrody, pro elektrody s nanocavities a s platinum pro kontrolu výrobního procesu. Ukládání Pt jen mírně zvýšila efektivní geometrické plochy nanoelectrode (jak o tom svědčí voltammogram pro oxidaci 1 mM FcMeOH), ale výrazně zvyšuje jeho katalytickou aktivitu vůči ROS snížení. Nanoelektroda byla polarizována při 600 mV vs Ag/AgCl (pro detekci H2O2 omezenou difuzí) a ručně se přiblížila k kapalině nebo povrchu jediné rakovinné buňky. Pro kalibraci jsme použili roztoky s různou koncentrací H2O2 (Sigma) v rozsahu 10-7-10-4 M.
ROS měření s elektrochemickou sondu
výsledky byly získány, jak bylo popsáno earlier47 s některými změnami. Zavedenou modifikací elektrod použitých v této práci je tedy lepší přilnavost platiny k uhlíkové elektrodě v důsledku leptání dutiny v uhlíkové vrstvě před ukládáním Pt. Pro výrobu senzorů pro detekci ROS byly použity komerčně dostupné disky, tvarované uhlíkové nanoelektrody izolované v křemenu (ICAPPIC Limited, UK) o průměru 100-500 nm. Relativně inertní uhlíkový povrch elektrody byl dále funkcionalizován pro detekci redoxně aktivních druhů. Elektrodepositovaná Platinová vrstva zvyšuje elektrokatalytickou aktivitu drastickým snížením nadpotenciálu produkovaného redukcí reaktivních druhů kyslíku. Pro zvýšení adheze platiny k uhlíkové zátce jsme v uhlíkové elektrodě leptali nanokavitu. Použili jsme elektrochemickou metodu k vytvoření malých zářezů ve špičkách uhlíkových nanoelektrod51. Výroba platinových nanosenzorů byla provedena ve dvou fázích: leptání v alkalickém roztoku a platinizace. Všechny stupně byly přesně řízeny elektrochemickými měřeními. Věříme, že nanoelektroda je citlivá jak na krátkodobé, tak na dlouhodobé formy ROS. Nedávno jsme prokázali, že produkce singletového kyslíku ve vodném roztoku flavin mononukleotidu (FMN) je indukována ozářením modrým světlem. Na základě tohoto výsledku demonstrujeme (doplňující údaje 9) odezvu uhlíkové nanoelektrody polarizované při + 800 mV vs Ag / AgCl na výrobu ROS ve vodném roztoku FMN za ozáření modrým světlem.
buňky byly naočkovány do Petriho misky s následnou inkubací přes noc. Poté byly buňky inkubovány po dobu 30 minut se 100 µM FMN ve tmě a 3krát promyty PBS. Poté byla platinizovaná nanoelektroda opatrně zavedena pomocí přesného mikromanipulátoru do jedné buňky pod optickou kontrolou s invertovaným mikroskopem. Pro manipulaci s elektrodami a seřízení jsme použili mikromanipulátor PatchStar (Scientifica, UK). Shromáždili jsme cyklická voltametrická data s patch-clamp zesilovačem Model 2400 (A-M Systems, USA). Záznam signálu byl proveden pomocí multifunkčního I / O zařízení USB-6211 (National instruments, USA) a počítačového programu WinWCP. Všechna měření byla provedena na stole invertovaného mikroskopu Nikon (Japonsko). Ve všech měřeních byla jako referenční elektroda použita AG / AgCl elektroda.
měření ROS pomocí fluorescenční sondy
vyhodnocení cytoplazmatického ROS bylo provedeno pomocí Cellrox Deep Red fluorescent probe (Molecular Probes / Thermo). Krátce, Mel IL a M-3 melanomové buňky (5 × 103) byly nasazeny v 96jamkových destičkách (Nunc, Dánsko) a inkubováno s 2,5 µM CellROX tmavě Červená, v plné RPMI-1640 media po dobu 30 minut a promyty v PBS třikrát. Pak 100 µL vhodné pracovní roztoky (10 µM, 30 µM a 100 µM) FMN v RPMI-1640 médiu bez Fenolové Červeně bylo přidáno k buňkám a deska byla inkubována ve tmě, v CO2 inkubátoru po dobu 30 minut. Poté byly buňky ozařovány pomocí 450 nm laseru v dávce 5 J / cm2. Buněčná jádra byla dodatečně obarvena 50 µM roztoku barviva Hoechst 33258 po dobu 15 minut. Optické obrazy a CellROX tmavě Červené fluorescence intenzita údaje Mel IL a A375 melanomové buňky byly získány pomocí InCell Analyzátor 6000 a V Cele Analyzátoru Workstation software v. 3.7.3 (GE Healthcare, USA).
stanovení obsahu melaninu
používáme rutinní test pro spektrofotometrické stanovení melaninu s menšími změnami52. Čtyři melanomových buněčných linií: Mel MTP, Mel IL, Mel Z, A375 a dva normální (lidských keratinocytů HaCaT a lidské kožní fibroblasty BJ-5ta) buněčné linie byly počítány a peletovaného v tak, aby konečná koncentrace 2 x 106 buněk/ml. Pro stanovení obsahu intracelulárního melaninu byly buněčné pelety rozpuštěny v 1 M NaOH obsahujícím 10% (obj./obj.) DMSO a inkubovány při 80 °C po dobu 1 hodiny. Po inkubaci byly lyzáty odstředěny (3000 g po dobu 5 minut) a absorbance byla měřena v bezbuněčném médiu při 405 nm. Všechny výsledky jsou vyjádřeny jako střední hodnota intenzit absorbance normalizovaných na obsah melaninu ve fibroblastech ± směrodatná odchylka (SD) tří nezávislých experimentů. Statistická analýza byla provedena s GraphPad Prism verze 5.0 (GraphPad Software, La Jolla California USA).
pokusy na Zvířatech
Terapie primárních nádorů
Samců Balb/c nu/nu myší ve věku 6-7 týdnů byly zakoupeny z farmy zvířat z Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganická Chemie, ruská Akademie Věd, a sídlí v kontrolovaných podmínkách prostředí v vypuštěné zvíře kabinetu A-Box 80 (Noroit, Francie) na 12 h tma-světlo cyklu a povolen přístup do sterilní vody a SPF-myši chow volně. Všechny pokusy na zvířatech byly prováděny v souladu s Evropskými a ruské národní pokyny pro pokusy na zvířatech a byly schváleny zvířat a etický přezkum výboru FSBSI „N. N. Blokhin NMRCO“, referenční číslo 2017-034.
Chcete-li vytvořit myším modelu xenograft, Mel IL a A375 buňky byly sklizeny s Versene řešení, peletována centrifugací při 300 g po dobu 5 min a resuspendovány v RPMI-1640 media bez séra. Suspenze melanomových buněk byla smíšena (1:1 objem) s Matrigel (BD Biosciences), a získaná suspenze buněk (2 × 106 buněk / injekci) byla implantována subkutánně do pravého boku myši pro zajištění úspěšného nádor zahájení a růst nádoru měření.
podávání FMN začalo 10. den po inokulaci, kdy velikost nádoru dosáhla 100-120 mm3. FMN roztoku (150 µl, 10 µg/ml) byl vložen do myši intravenózně pomocí retro-orbitální dutiny, a nádory byly ozářeny modrá-světle při 450 nm po dobu 15 min do konečné dávce 20 J/cm2.
objem Nádoru byla odhadnuta pomocí standardní metody calipation a byla vypočtena podle následujícího vzorce, za předpokladu, že hemi-elipsoid tvar:
Protinádorové aktivity fotoaktivovaná FMN byla určena na základě vyhodnocení nádor inhibice růstu sazby (TGI%) se vypočítá jako:
Fotodynamická terapie vzdálených nádorů
použili Jsme C57BL/6 myší v 6-7 týdnech věku, zakoupit z farmy zvířat z Shemyakin–Ovchinnikov Ústavu Bioorganické Chemie ruské Akademie Věd. Všechny pokusy na zvířatech byly prováděny v souladu s Evropskými a ruské národní pokyny pro pokusy na zvířatech a byly schváleny zvířat a etický přezkum výboru FSBI „N. N. Blokhin NMRCO“, referenční číslo 2017-034.
B16-F10 myší melanomové buňky byly sklizeny s Versene řešení, peletována centrifugací při 300 g po dobu 5 min a resuspendovány v RPMI-1640 media bez séra. Melanom buněčné suspenze bylo smícháno (1:1 objem) s Matrigel (BD Biosciences), a získané buněčné suspenze (5 × 105 buněk / injekci) byla implantována subkutánně do pravého a levého boku myši pro zajištění úspěšného nádor zahájení a růst nádoru měření.
Správa FMN začal 4. den po inokulaci, kdy velikost nádoru dosáhl 60 ± 16 mm3 FMN roztoku (150 µl, 10 mg/ml) byl vložen do myši intravenózně pomocí retro-orbitální dutiny, a nádory byly ozářeny modrá-světle při 450 nm po dobu 15 min do konečné dávce 20 J/cm2. Byly použity dvě kontrolní skupiny: injekce FMN bez ozařování světlem; laserové ozařování bez injekce FMN. Objem nádoru a protinádorová aktivita fotoaktivovaného FMN byla odhadnuta, jak bylo popsáno výše.
barvení hematoxylinem a eosinem
zvířata byla obětována cervikální dislokací za 24 hodin po PDT. Všechny sklizené nádory byly fixovány 4% paraformaldehydem po dobu 24 hodin a poté vloženy parafínem. Tkáňové řezy (tloušťka 4 µm) byly obarveny hematoxylinem a eosinem.
Statistická analýza
všechny experimenty byly provedeny ve trojím vyhotovení, pokud není uvedeno jinak, a každý experiment byl opakován třikrát nezávisle. Údaje jsou vyjádřeny jako průměr ± SD. Rozdíly byly považovány za statisticky významné, pokud byly hodnoty P menší než 0,05. Všechny statistické analýzy byly provedeny pomocí softwaru GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, San Diego, CA, USA).