1 Theory
Oligonucleotides are synthesized by the addition of one base at a time, extending from the 3′ to the 5′-end, attached to a solid-phase support. Quando a síntese química do oligonucleótido está completa, a cadeia de ADN é libertada do suporte sólido por incubação com hidróxido de amónio. O amônio também atua como um agente Desprotetor, separando os grupos que protegem os fosfatos nas ligações fosfodiester. Depois disso, amônia quente é adicionada para hidrolizar os grupos protectores dos grupos amino exocíclicos de desoxiadenosina, desoxicitosina e deoxiguanosina. O oligonucleótido pode ser fornecido ao utilizador na solução de amoníaco como preparação bruta. Neste caso, antes da utilização, pode ser necessário efectuar uma etapa adicional para remover os sais e subprodutos da preparação de oligonucleótidos gerada durante a desprotecção.após a desprotecção, a preparação de oligonucleótidos é normalmente dessalinizada, quantificada, evaporada até à secura num liofilizador e fornecida ao Utilizador sob a forma de pó. A solução de oligonucleótido dessaltado contém o oligonucleótido de comprimento total, mas também contém uma mistura de produtos truncados que foram acumulados durante a síntese química. Truncação ocorre quando a base especificada não consegue adicionar à cadeia no ciclo correspondente (Hecker & Rill, 1998). Assim, a percentagem de produtos truncados acumulados na preparação é determinada pela eficiência de síntese (a fracção do produto de comprimento completo após síntese) e pelo comprimento da molécula. Oligonucleótidos longos, que requerem mais ciclos para serem sintetizados, são menos puros do que oligonucleótidos curtos. Estas falhas podem competir com o produto de comprimento total em algumas aplicações e podem precisar de remoção antes que o oligonucleótido possa ser usado. No entanto, as preparações de oligonucleótidos dessaltados são geralmente adequadas para muitas aplicações, tais como PCR padrão ou microarrays, especialmente se o oligonucleótido é < 20 nucleótidos em comprimento.recomenda-se a purificação adicional para oligonucleótidos com mais de 50 bases, uma vez que a percentagem de produto de comprimento total na preparação não é normalmente superior a 80%. Para aplicações exigentes, onde o comprimento exato do oligonucleotide é importante, tais como gel shift ensaios, site-directed mutagenesis, o seqüenciamento, a produção de clonagem de placas, ou first-strand cDNA a síntese para a geração de bibliotecas, de purificação adicional é recomendado, mesmo para o mais curto oligonucleotídeos (veja mais informações sobre as técnicas acima, no Padrão de Ensaios in vitro de Proteínas, Ácidos Nucleicos Medicamentosas – Gel shift Ensaios para o RNA e o DNA de Vinculação e Site-Directed Mutagenesis).a purificação pode ser necessária após síntese ou modificação enzimática do oligonucleótido. Existem vários métodos para conseguir isso, e a escolha depende da natureza do oligonucleótido e da aplicação a que se destina.a purificação de HPLC de fase reversa é baseada na hidrofobicidade. Ele usa uma fase estacionária não-Solar, e tampões aquosos e solventes orgânicos como a fase móvel para eluir os analitos; os compostos polares são eluídos primeiro, enquanto os compostos não-polares são mantidos. Este é o melhor método para purificar oligonucleótidos modificados com um grupo hidrofóbico, tais como biotina, etiquetas de corantes fluorescentes, ou conjugações NHS-ester. A recuperação de massa é maior do que quando se utiliza a purificação de páginas e é passível de purificação de maiores quantidades de oligonucleótidos (escala de mmole), embora não remova os produtos incompletos de forma tão eficaz. Os cartuchos de purificação de oligonucleótidos, baseados na cromatografia de fase reversa, fornecem um método rápido de dessalinização e purificação de oligonucleótidos.
a electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) resolve oligonucleótidos de acordo com o seu comprimento e, assim, oferece resolução suficiente para diferenciar produtos de comprimento total de moléculas falidas (Atkinson e Smith, 1984). Os géis de poliacrilamida são mais eficazes na separação de pequenos fragmentos de ADN do que os géis de agarose (Ver análise do ARN por electroforese em gel de poliacrilamida analítica e electroforese em Gel de Agarose). A única desvantagem dos géis de poliacrilamida é que são mais difíceis de preparar e manusear do que os géis de agarose. Os géis de poliacrilamida são executados numa configuração vertical num campo eléctrico constante. Após a eletroforese, o oligonucleótido é eluído do gel e concentrado, usando precipitação de etanol (encontrar mais sobre a precipitação de ácidos nucleicos em métodos de purificação de RNA – precipitação) ou cromatografia de fase reversa. Este é o método de escolha quando a maior porcentagem de oligonucleótidos de comprimento completo é desejada para aplicações exigentes. Também é fortemente recomendado para oligonucleótidos com mais de 30 bases. Além disso, várias amostras podem ser executadas simultaneamente e nenhum equipamento caro é necessário. A única desvantagem desta técnica é a pequena quantidade de oligonucleótido obtida por purificação. Tipicamente, oligonucleótidos são usados na escala de 1 µmol ou menos, e a recuperação de massa após a purificação da página é < 50% e ainda menor no caso de oligonucleótidos modificados. No entanto, embora o rendimento seja baixo, é satisfatório para a maioria das aplicações bioquímicas.a preparação de oligonucleótidos é carregada num gel de poliacrilamida desnaturante numa quantidade de, pelo menos, 1 mg por via. O intervalo de resolução do gel depende da concentração de poliacrilamida. Para oligonucleótidos curtos (de 15 a 35 bases), recomenda-se a utilização de géis de poliacrilamida a 13-15%; para oligonucleótidos mais longos (de 35 a 70 bases), recomenda-se a utilização de géis de poliacrilamida a 8-13%. A percentagem do gel deve ser adaptada ao sistema de funcionamento. Usualmente usamos o sistema Bio-Rad Mini Protean II e executamos 15% de géis para purificar oligonucleótidos de 25 bases de comprimento. Após a identificação da faixa correta por visualização UV, a faixa é excisada e extraída do gel.o presente capítulo descreve dois métodos diferentes de purificação de oligonucleótidos a partir de géis de poliacrilamida. O método mais simples é eluição por meio da difusão. Isto é baseado no movimento de moléculas de uma região de maior concentração para uma de menor concentração. O resultado da difusão é uma mistura gradual de material. Este método é demorado, mas não requer muito trabalho ou qualquer equipamento. Basicamente, a banda de poliacrilamida que contém o oligonucleótido de interesse é cortada em pequenos pedaços e coberta com tampão de eluição. Após incubação, o ADN é purificado do sobrenadante por precipitação de etanol. O rendimento é limitado, entre 20% e 70%, dependendo do comprimento do oligonucleótido. Quanto maior for a quantidade de tampão de eluição utilizado, mais oligonucleótido é difundido a partir do gel.o segundo método é a electroelução num saco de diálise (McDonell et al., 1977). A peça de gel que contém o oligonucleótido é excisada e colocada num saco de diálise com um tampão. A aplicação de uma corrente eléctrica faz com que o ADN migre do gel para o tampão do saco de diálise. O oligonucleótido é recuperado deste tampão e purificado. Usando este método, o oligonucleotide pode ser isolado com um bom rendimento, embora seja demorado se um grande número de amostras são purificados, ao mesmo tempo, porque requer a inserção de cada gel banda em sacos de diálise. Este método também funciona bem para fragmentos de DNA maiores e pode até ser usado para extrair DNA de géis de agarose.