medicamento Experimental e terapêutico

introdução

um sistema de análise de monitorização celular em tempo real (RTCA) foi previamente desenvolvido para monitorização contínua das culturas celulares aderentes (1). Este método isento de rótulos e não invasivo baseia-se na medição daimpedência Eléctrica (índice celular, IC) entre regiões interdigitadas na base de placas de cultura de tecidos. A medição da IC fornece informação quantitativa sobre o estado biológico das células aderentes. Na verdade, o Significado de CI é o número de células de sobrevivência na superfície da placa-E. Estes dados incluem o número de células, viabilidade e morfologia como um perfil em tempo real (2-4). RTCAsystem é conhecido por dispositivo de detecção precoce da reação celular como fenótipo adinâmico contra alguns reagentes (5).

Em nosso estudo anterior, o imatinib citotoxicidade em oralsquamous carcinoma de células (OSCC) foi avaliada utilizando o WST-8(5– 3-(2- metoxi – 4-nitrofenil)- 2-(4-nitrofenil)-2H – tetrazole – 3 – io) ensaio como anendpoint de medição (6), e thenlater com um RTCA do sistema (7).As medições dos parâmetros por MTT (brometo de 3–2,5-difeniltetrazólio) e WST-8 são utilizadas apenas para avaliar a citotoxicidade. Contudo, estes ensaios são limitados por variações nos efeitos de diferentes agentes anticancerígenos em diferentes linhas celulares. Além disso, os valores da IC50 calculados por parâmetros de avaliação In vitro tendem a ser mais elevados do que as concentrações efectivas In vivo (8, 9).no nosso estudo anterior, os valores IC50 medidos pelo sistema RTCA foram inferiores aos medidos pelo ensaio WST-8, sugerindo que o sistema RTCA pode avaliar sensibilitamentea citotoxicidade e a influência do imatinib na lesão celular. No entanto, não está claro se a avaliação de theIC50 valores de outros agentes anticâncer usando o RTCAsystem seria útil porque há diferenças na cytotoxicreactions entre drogas alvo moleculares, tais como o imatinib andanticancer agentes ao longo do tempo.

neste estudo, precisamos selecionar o tipo de linhas de células para determinar a diferença do perfil de reação celular contra reagentes anticancerígenos em tempo real usando o sistema RTCA.A linha celular SQUU-A não invasiva e a linha celular SQUU-B invasiva que foram estabelecidas a partir de tumores recorrentes locais de cancro da língua em um único paciente, foram selecionados porque estávamos envolvidos em metástases de pesquisa de células SQUU-B usando linha celular SQUU-A E Linha SQUU-Bcell (10-12). A linha de células SAS foi estabelecida a partir do carcinoma espinocelular da língua(13), com diferenciação das células escamosas humanas. A linha celular NA foi estabelecida como uma linha celular produtora de fibronectina (14). Além disso, foi relatado que a citotoxicidade dos reagentes anticancerígenos na OSCC foi avaliada em linha celular SQUU-A e linha celular SQUU-B (15), linha celular SAS (16), linha celular NA (17) utilizando vários métodos convencionais.Foi por isso que seleccionámos quatro linhas celulares com cada característica caraterística no presente estudo, que também foram utilizadas em ensaio citotóxico no estudo anterior.neste estudo, concentrámo-nos num novo dispositivo RTCA desenvolvido para medição em tempo real e avaliámos os valores C50 como uma escala para avaliar a citotoxicidade dos agentes anticancerígenos em quatro linhas celulares OSCC. Isto permitiu-nos obter informações sobre as variações observadas entre os diferentes reagentes anticancerígenos e as linhas celulares em tempo real.

O objectivo do presente estudo foi obter 50 perfis imediatamente após a adição de agentes anticancer utilizando um sistema de RTCA. Este estudo demonstrou a vantagem de avaliar a citotoxicidade dos agentes anticancerígenos que utilizam um sistema RTCA em comparação com um ensaio de avaliação final.

materiais e métodos

reagentes e materiais

5-fluorouracilo (5-FU) foi diluído para 100 mM de indimetilsulfóxido (DMSO; Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA).A doxifluridina e a carboplatina foram diluídas para 100 e 50 mM,respectivamente, em água destilada. O Docetaxel foi diluído para 10 mM de inetanol. Todos os reagentes anticancerígenos foram obtidos da Wako PureChemical Industries, Ltd., (Osaka, Japão) e conservada a -20°C.

cultura celular

linhas celulares OSCC humanas SQUU-a, SQUU-B, SAS e NAwere derivadas de amostras de língua humana. SQUU-a e SQUU-B, fornecidos por Morifuji-Wilson m (Universidade Kumamoto, Kumamoto, Japão), foram estabelecidos a partir de tumores tonguecancer recorrentes locais (18). A SAS (13,19,20) foi adquirida pelo Riken BRC Cell Bank (Tsukuba, Japão). NA (14) foi gentilmente fornecida pelo Dr. Jun-ichi Iwata (Universidade de Kyushu; Fukuoka, Japão). Todas as células foram mantidas no meio modificado da Águia de Dulbecco (DMEM; Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japão) contendo 10% de soro de vitelo fetal (Biowest, Nuaille, França) a 37°C em uma atmosfera humidificada com 5% de CO2.A Medição da proliferação de células OSCC através do ensaio de citotoxicidade RTCA foi adquirida pelo sistema iCELLigence (ACEABiosciences, Inc., San Diego, CA, EUA) como o sistema RTCA. Allmonitoring was performed at 37 ° C with regulated CO2content (5%). As placas E (placas de cultura para o sistema iCELLigence)contendo 200 µl de meio de cultura por alvéolo foram equilibradas até 37°C, e CI foi ajustado para zero nestas condições. As células(2×104 células/alvéolo, salvo indicação em contrário) foram adicionadas a 560 µl de meio de cultura, adicionando-se agentes anticancerígenos a 24 horas após a selecção das células. O IC foi monitorizado em tempo real durante 96 horas após a sementeira. Os valores IC50 foram calculados pela RTCAData Analysis Software version 1.0 (ACEA Biosciences, Inc.).com base nos valores da Cmáx no estudo anterior(21-25) foram estabelecidos oito pontos de concentração de quatro anticancerígenos. Além disso, foram estabelecidos pontos temporais durante 72 H, incluindo 24 h E 48 h, que foram um método geral para avaliar a citotoxicidade no ensaio de ponto final.

ajuste na curva do IC50data

usámos a seguinte fórmula sigmoidal de dose-resposta para calcular os valores IC50: Y = baixo IC + (alto IC-baixo IC)/{1+10 ^ (Log IC50-X)}, em que “Baixo IC” representa os valores mínimos de CI, “alto IC” representa os valores máximos do Índice de células, Y é o índice de células, e X é o log da concentração (M).após a sementeira inicial e a cultura das células OSCC,o meio de cultura foi removido e substituído por um meio anticanceragente. Depois de 24, 48, e 72 H de incubação, 20µL WST-8 corante (Contagem de células Kit-8; Dojindo Corporation, Tóquio, Japão) foi adicionado a cada poço. Após 3 h, as placas foram lidas a 450 nm/655 nm. A taxa de sobrevivência celular foi calculada utilizando aformula abaixo (7). Os valores de CI50 foram calculados por regressão linear de aproximação da sobrevivência depercentagem em relação à concentração do fármaco.

taxa de sobrevivência das células (%)=(A-C) / (b-C) ×100(a=absorvância a cada concentração do reagente anticancerígeno,b=absorvância a 0 µM do reagente anticancerígeno e c=absorvância do branco).

análise estatística

Todos os dados são mostrados como a média ± desvio-padrão (DP) de três experiências independentes. As correlações entre os valores de C50 obtidos utilizando o sistema RTCA e o WST-8assay foram avaliadas quanto à significância estatística pelo Spearmantest. Os valores de duas caudas de P<0,05 foram considerados significativos.

Resultados

Efeito da quimioterapia agentconcentration no OSCC proliferação de células usando o RTCA do sistema

foi avaliada a citotoxicidade de quatro anticancerreagents (5-FU, doxifluridine, carboplatin, e docetaxel) em fourOSCC linhas de células através do monitoramento de CI valores para 96 h após thecells foram semeadas em 2×104 células/poço em E-chapas(Figs. 1–4). Os valores de IC diminuíram de forma dependente da dose nas quatro linhas celulares OSCC. Por conseguinte, a redução dos valores de IC correlacionou-se com a diminuição da number.As mostrado na Fig. 2, o valor IC para a linha celular SQUU-B invasiva foi inferior ao de outra OSCC cells.As mostrado na Fig. 3, CI profileobtained for SAS cell line showed delayed increase after 48 h. Asshown in Fig. 4, a taxa de proliferação e o valor máximo de IC nas linhas celulares foram mais elevados do que em qualquer outra linha celular.os perfis IC50 dos quatro agentes anticancerígenos nas quatro linhas celulares OSCC foram determinados pelo RTCAsystem e calculados pelo software comercial fornecido com o instrumento (um subconjunto dos dados SQUU-B é mostrado na Fig. 5). Os valores de CI50 foram marcados para 72 h após a adição de agentes anticancerígenos. Os valores de teic50 a 24, 48 e 72 h para todas as quatro células são resumidos nos quadros I-IV. como se pode ver na Fig. 5, verificou-se um desfasamento temporal nas acções citotóxicas de 5-FU (Fig. 5A) anddocetaxel (Fig. 5D), and recovery ofcell proliferation was observed at about 24 h after treatments.However, cytotoxic reactions were observed immediately aftertreatment with anticancer agents such as doxifluridine (Fig. 5B) and carboplatin (Fig. 5C).

Dose-response curves in SQUU-B cell line using RTCAsystem were shown in supplemental materials (Figs. S1–S4) in order to show how to conversion thedata of Fig. 2 into Fig. 5. Embora as curvas de viabilidade celular do squu-B utilizando o ensaio WST-8 também tenham sido apresentadas em materiais suplementares (figos. S5-S8). Os valores de R2 a 72 h dos reagentes anticancerígenos do ensaio WST-8 foram baixos em quatro reagentes anticancerígenos em comparação com um de 24 h e 48 h. estes resultados mostraram que é desejável que o ensaio de ponto final seja realizado a 24 H ou 48 h para ser utilizado como protocolo geral. Neste estudo, as curvas de viabilidade celular do ensaio WST-8 mostraram-se insuficientes devido à ausência de novidade no cálculo dos valores IC50 utilizando o ensaio WST-8.

correlações entre medições em tempo real dos valores IC50 utilizando o sistema RTCA e medições do ponto de paragem dos valores IC50 usando o WST-8assay nas células OSCC

Como mostrado na Fig. 6, Os valores de CI50 a 24, 48 e 72 h utilizando dois métodos foram pontilhados. O eixo horizontal mostra os valores de CI50 em tempo real medidos através do sistema RTCA, enquanto o eixo longitudinal apresenta os valores de CI50 emendpoint medidos através do ensaio WST-8. Observou-se uma correlação positiva entre os dois tipos de assaymethod para medir a CI50 para cada agente anticancerígeno.Os resultados do 5-FU, doxifluridine, carboplatin, e docetaxcelwere y=8.19 x+346.02 (R2=0.94,rs=0.66, *P<0,05), com y=1,00 x+172.70(R2=0.91, rs=0.82, **P<0.01),y=1,90 x+206.81 (R2=0.92,rs=0.96, **P<0.01), andy=13.53 x+0.08 (R2=0.95,rs=0.73, *P<0.05), respectivamente. Os valores em tempo real50 tenderam a ser inferiores aos valores correspondentes do ponto IC50.os valores de

discussão

IC calculados pela RTCA estão também a representar o estado da célula (3). Asshown em figos. 1-5, Os valores de DP dos valores de IC foram demasiado pequenos para se verificarem. Por exemplo, todos os valores SD na Fig.1 estava abaixo de 0,05. A razão para os baixos valores IC de SQUU-B wassuggested that the adhesion protein e-cadherin playes an essentialrol in metastasis, with reduced levels of e-cadherin promotingcell migration and cell invasion (26). A razão para valores elevados de IC ofNA max foi sugerida como tendo sido relatado que a proliferação celular fibronectinaccelerada e a adesão devido à característica da linha celular de ofNA como linha celular produtora de fibronectina (6). Assim, as reacções celulares de cada célula contra quatro reagentes anticancerígenos foram variáveis. Não foi possível encontrar a relação causal entre os valores de CI50 e a temperatura das linhas celulares neste estudo. No entanto, é importante identificar uma reacção celular em tempo real como um perfil de IC para avaliar a toxicidade do reagente anticancerígeno quando se considera a aplicação farmacêutica ao ser humano.

o perfil IC50 da linha celular SQUU-B foi descrito na Fig. 5 Como perfil IC50 arepresentativo, porque não houve diferenças no padrão do perfil IC50 na mesma linha de células com o mesmo reagente, embora tenhamos calculado os valores IC50 em todas as linhas de células usando quatro reagentes anticancerígenos. Descobrimos que os perfis de theIC50 variavam para cada agente anticancerígeno e em cada linha celular da OSCC. Como mostrado na Fig.5, 5-FU e docetaxel necessitaram de mais de 24 h (48 h na configuração) para começar a exercer um efeito citotóxico nas células do OSCC,enquanto os valores de CI50 recuperaram de cerca de 24 h(48 h na figura) após a adição de doxifluridina e carboplatina. Assim, sugerimos que as diferenças dos perfis em tempo real50 foram causadas pelo reagente anticanceroso. Estas observações não teriam sido possíveis sem a contratação em tempo real utilizando a RTCA. A monitorização em tempo Real dos valores da CT50 revelou também que estes valores se alteraram marcadamente ao longo do tempo. Existe a possibilidade de não detectaralterações utilizando métodos convencionais, uma vez que apenas um ponto temporal da CI50 após o tratamento com o agente anticancerígeno é avaliado por um ensaio final.o sistema RTCA é diferente dos testes finais tradicionais porque a medição da impedância não é invasiva e pode fornecer dados quantitativos de alta qualidade sobre a citotoxicidade de forma contínua. Como mostrado na Fig.6, verificaram-se correlações positivas significativas entre os valores de IC50 obtidos com o sistema RTCA e o WST-8assay, apesar de existirem algumas diferenças nos valores absolutos de IC, tais como valores de IC Baixos obtidos para a linha celular SQUU-B. Estes resultados sugeriram que mesmo um IC baixo obtido para algumas linhasde células seria capaz de avaliar a sensibilidade elevada à citotoxicidade no sistema RT. Embora os valores de CI50 em tempo real tenham sido inferiores aos valores de CI50 em thanendpoint quando os valores de CI50 em tempo real obtidos com o sistema RTCA foram comparados com os valores de CI50 emendpoint obtidos com o doseamento WST-8.Estes resultados sugerem que o sistema RTCA pode ser utilizado para avaliar de forma sensível o efeito dos agentes anticancerígenos na proliferação celular e na adesão.no sistema RTCA, a célula aderente actua como isolador na superfície do eléctrodo e altera o meio iónico da solução do electrodo, aumentando a impedância (27). Assim, CI é função do número de células e razão de células em diferentes intervalos de tempo. IC = 0 quando não existe aderência celular (5). As CIchanges descritas pelo sistema RTCA são um fenótipo dinâmico da célula. Esta monitorização dinâmica da interacção célula-droga permite a obtenção de uma melhor compreensão dos efeitos temporais do invitro, especialmente imediatamente após o tratamento com o fármaco(28). A característica cinética das células oferece informação perspicaz que não pode ser adquirida a partir de um ensaio único de ponta convencional, como o ensaio WST-8. While, results of WST-8 assay is reflected metabolic reaction of survivalcell (29). A toxicidade utilizando o método WST-8 pode ser subestimada se se mantiver a reacção metabólica celular apesar de se ter verificado uma reacção celular dinâmica. Sugerimos que estas diferenças de capital em dois métodos foram induzidas grandes diferenças de valor IC50 até 8 vezes entre duas gamas, como mostrado na Fig. 6A. o nosso estudo anterior relatou que a CI50 do imatinib em células SQUU-Acells calculada pelo sistema RTCA e ensaio WST-8 foi de 4 µM e 60 µM, respectivamente (sensibilidade de 15 vezes) (6, 7). Outros grupos de pesquisa relataram que a cisplatina em HK-2cells calculada pelo sistema RTCA e ensaio WST-8 foi de 0, 76 µM e 25 µM, respectivamente (sensibilidade de 33 vezes) (30, 31).Estes dados anteriores suportaram nossos dados para mostrar a validade.é importante obter medições imediatamente após o tratamento com agentes anticancerígenos para avaliar tanto os efeitos secundários destes agentes como os seus efeitos pretendidos. No entanto, existem poucos relatos de métodos úteis que correlacionam dados do invitro com dados humanos in vivo. Considerámos que a medição em tempo real utilizando o sistema RTCA beneficiaria a avaliação dos efeitos secundários dos agentes anticancerígenos nas células normais.valores de Cmax de 5-FU,doxifluridina, carboplatina e docetaxel notificados anteriormente são: 60 (21), 40-800 (22), 40 (23), e 2 µM (24,25),respectivamente, quando utilizados para tratamento intravenoso em seres humanos. Os nossos dados correlacionaram-se com os dados humanos porque os valores de Cmax foram incluídos na gama das doses experimentais utilizadas neste estudo.os sistemas RTCA são o novo dispositivo principal para avaliar a citotoxicidade, que utiliza a intensidade de impedância da lesão celular e não a actividade enzimática nas células-alvo, como o MTTassay. Os valores de CI50 dos agentes anticancerígenos calculados pelo sistema RTCA estavam significativamente correlacionados com os níveis de CI50 calculados pelo ensaio de avaliação final convencional. Além disso, o sistema RTCA obteve medições automaticamente em tempo real imediatamente após o tratamento com agentes anticancerígenos.

na verdade,o sistema RTCA não pode avaliar a citotoxicidade directliconcreta, como morte celular ou apoptose, e assim por diante, porque o índice de células foi calculado com base na impedância. É por isso que o ensaio de combinação entre o sistema RTCA e a medição da morte celular pode ser um método eficaz em caso de avaliação da reacção celular de secretismo, como a morte celular ou apoptose com precisão.Por exemplo, a coloração ou expressão da caspase-3 do Anexo V para a detecção da apoptose, a desidrogenase lactato (LDH) pode ser utilizada como método eficaz para a detecção da morte celular(32,33). Além disso, pode ser útil avaliar a expressão da proteína inflamatória nas células normais para detectar efeitos secundários quando o reagente anti-cancro foi adicionado às células normais semeadas na placa E. A monitorização dinâmica em tempo real durante a cultura da célula, incluindo os reagentes anticancerígenos, pode fornecer dados valiosos para a detecção precoce da eficiência terapêutica e do efeito secundário, que não podem ser avaliados em métodos convencionais no ponto final. Assim, o valor IC50 calculado pelo sistema RTCA pode ser um parâmetro útil para, por exemplo, o rastreio do ponto de vista da medição em tempo real, automatizado, evitando problemas colorimétricos ou contaminação. Além disso, o sistema RTCA permite aanálise de todo o período do experimento e não requer a rotulagem que pode afetar negativamente os experimentos da cultura celular.

a novidade deste estudo é que o sistema de ACR pode afectar a elevada sensibilidade da citotoxicidade em comparação com um método convencional, o método WST-8. Além disso, o sistema RTCA poderia avaliar valor50 preciosamente em tempo real, sem restrições do período experimental durante pelo menos 72 horas após a adição de reagentes anticancer.em conclusão, os nossos resultados demonstraram que os RTCAsystems são úteis para avaliar a citotoxicidade e podem ser utilizados no desenvolvimento futuro de agentes quimioterapêuticos utilizando células cancerígenas e na avaliação dos seus efeitos secundários em células normais. Além disso,um sistema RTCA pode ser usado para avaliar os perfis de reação celular, tais como terapia combinada e interações de células de anticorpos ou drogas, de reagentes anticancerígenos.

material suplementar

dados de apoio

agradecimentos

Não aplicável.

financiamento

não foi recebido qualquer financiamento.os conjuntos de dados utilizados e / ou analisados durante o presente estudo estão disponíveis no autor correspondente no reasonablerequest.

as contribuições dos autores

MH e MN conceberam e conceberam o estudo. MH andTN realizou os experimentos e adquiriu os dados. MH analisou os dados, preparou as figuras e redigiu o manuscrito. MH, TKY andMN interpretou os resultados. MH and TKY edited and revised themanuscript. Todos os autores leram e aprovaram o finalmanuscript.Não aplicável.autorização do doente para publicação Não aplicável.

interesses concorrentes

os autores declaram que não têm interesses concorrentes.

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