Frontiers in Neuroscience

Introdução

No século xix, ≈80 anos após a descoberta de lactato (La) por Scheele (Kompanje et al., 2007), Louis Pasteur notou que as células de levedura facultativas cresceram mais sob condições aeróbicas do que anaeróbias, no entanto o consumo de açúcar foi diminuído e a fermentação para álcool foi menor sob condições aeróbicas (Pasteur, 1861). Anteriormente, Pasteur (1858) tinha reconhecido que alguns tipos de açúcar fermentado de levedura para La− sob condições anaeróbias, mas não aeróbias. Este fenómeno (tanto para o álcool como para a fermentação de La) tem sido chamado de efeito Pasteur (Barnett e Entian, 2005). Um fenômeno paralelo foi descoberto no músculo esquelético e em animais inteiros. For skeletal muscle Fletcher and Hopkins (1907) reported that La− accurd in anaerobic frog muscles at rest. Durante a estimulação, a concentração de La () aumentou rapidamente no músculo anfíbio anaeróbico, mas desapareceu quando estes músculos fatigados foram autorizados a recuperar em um ambiente rico em oxigênio (O2). Posteriormente, Meyerhof demonstrou conclusivamente que o glicogênio era o precursor dos músculos isolados de La, e a via glicolítica completa foi elucidada no início da década de 1940 (Meyerhof, 1942; Brooks and Gladden, 2003). O dogma tradicional foi construído sobre este quadro e outras pesquisas sobre hipoxia: O piruvato é o produto final da glicólise em condições aeróbias e La− é o produto final quando o O2 é insuficiente. Schurr (2006) discutiu este dogma do ponto de vista do metabolismo cerebral.

é amplamente aceito que os valores de PO2 intracelulares de ≈0.5 Torr ou menos resultam em fosforilação oxidativa limitada a O2, uma condição denominada disoxia (Connett et al., 1990), com a consequente produção e acumulação de La. No entanto, Stainsby E Welch (1966) relataram la− efflux de um músculo contraído ostensivamente bem oxigenado. Posteriormente, Jöbsis e Stainssby (1968) observaram a produção e libertação de um músculo esquelético canino contraído, enquanto o casal NAD+/NADH redox estava se tornando mais oxidado, uma indicação de fornecimento adequado de O2. Usando uma abordagem diferente, mioglobina cryomicrospectroscopy, para determinar PO2 no músculo gracilis cão contraindo a taxas progressivamente mais rápidas, Connett et al. (1986) found increasing La− efflux without evidence of disoxia; the lowest PO2 values were generally on the order of 2 Torr. Richardson et al. (1998) used proton magnetic resonance spectroscopy (MRS) to determine myoglobina saturation (and thereby intracelular PO2) in humans during graded exercise. Em experiências paralelas com o mesmo tipo de exercício, o La− efluxo foi determinado através de diferenças de concentração arteriovenosa e fluxo sanguíneo. Eles encontraram la-efflux na presença de níveis intracelulares de PO2 (~3 Torr) que não devem limitar a fosforilação oxidativa. Véga et al. (1998) also reported that isolated, stimulated nerve tissue releases lactate during aerobic conditions.estes resultados, juntamente com outras provas circunstanciais abundantes,indicam que a produção líquida de La e de efluxo das células pode ocorrer em condições aeróbias (Gladden, 2004a, b). De fato, Brooks (2000) propôs que “lactato foi produzido o tempo todo em células e tecidos totalmente oxigenados. Schurr (2006) discutiu esta proposição em detalhes, propondo que “a glicólise sempre prossegue para o seu passo final, a reação LDH e a formação de lactato” no tecido cerebral, mas mais provável em muitos outros tecidos também. Subsequentemente, Schurr e Payne (2007) e Schurr e Gozal (2012) forneceram provas experimentais de apoio para este postulado em fatias cerebrais hipocampos. Aqui, abraçamos este conceito, propondo que mesmo na ausência de la− acumulação líquida, e na presença de O2 abundante, La− é o produto final natural da glicólise. É importante que utilizemos princípios bioquímicos básicos para compreender este conceito e reintroduzir o vaivém lactato de citosol-a-mitocôndria.

A LDH Reação é uma Perto de Equilíbrio da Reação

La− é formado da seguinte reação que é catalisada pela enzima lactato desidrogenase (LDH):

A constante de equilíbrio é fortemente a favor de La− (1.62 × 1011 M−1) (Lambeth e Kushmerick, 2002), e LDH atividade é alto em relação ao pretenso regulamentar enzimas no meio glicolítico no músculo esquelético (Connett e Sahlin, 2011), fígado, rim, músculo cardíaco, baço, e a gordura (Shonk e Boxer, 1964), cérebro (Iwangoff et al., 1980; Morland et al., 2007), e ambos tumores mamários malignos e benignos (Larner and Rutherford, 1978; Balinsky et al., 1984). É importante notar que a actividade da LDH é também elevada em comparação com as enzimas regulamentares putativas da oxidação de piruvato; ver Spriet et al. (2000) for skeletal muscle, Morland et al. (2007) for brain, and Marie and Shinjo (2011) for brain cancer. Embora as medidas das razões La− piruvato tecidular sejam escassas, alguns valores de exemplo são ≈7: 1 Para fígado (Liaw et al., 1985), ≈10-13: 1 for resting skeletal muscle (Sahlin et al., 1976; Liaw et al., 1985), e valores até 159:1 no músculo esquelético imediatamente após um exercício dinâmico exaustivo (Sahlin et al., 1976). Valores de referência para a razão La-piruvato no cérebro, utilizando sondas de microdiálise, média 23:1 (Reinstrup et al., 2000; Sahuquillo et al., 2014). Tipicamente, a proporção aumenta após lesão cerebral traumática, mesmo na ausência de isquemia ou PO2 de tecidos Baixos (≥25 (Sahuquillo et al., 2014); ≥40 (Vespa et al., 2005)}. Apesar da padronização das técnicas, os valores da microdiálise não refletem necessariamente as concentrações reais dos tecidos (Sahuquillo et al., 2014). No entanto, estes valores de microdiálise de La− a-piruvato para o cérebro humano não estão longe dos valores (≈13:1) obtidos em homogenatos cerebrais de rato (Ponten et al., 1973). Em geral, o alto em relação ao mesmo com uma oferta de O2 adequada, reforça o papel da atividade LDH na determinação da aparência. A alta atividade LDH e a constante de equilíbrio la-leaning da reação LDH são elementos-chave na proposição de que La− é o principal produto final da glicólise em praticamente todas as condições metabólicas. Simplificando, a qualquer momento que a glicólise é operativa, independentemente da tensão local do oxigênio, La-está sendo formada na maioria dos tipos de tecidos. No entanto, a quantidade de La produzida e realmente acumulada (isto é, um aumento ) pode ser alterada por fatores como tensão O2, taxa metabólica, atividade mitocondrial disponível, e outros fatores.

os estados de piruvato

os potenciais estados de piruvato estão listados abaixo. Propomos que nenhum destes processos ocorra a uma taxa que corresponda à conversão inicial de piruvato em La−, garantindo assim que La− é sempre o produto final da glicólise.

1. Efluxo da célula principalmente através de transportadores de monocarboxilato (MCTs). No entanto, La-está sempre presente em uma concentração mais elevada do que o piruvato e vai partir células a uma taxa mais rápida do que o piruvato de will.

2. Conversão à alanina através da reação de alanina aminotransferase de equilíbrio próximo, que tem uma constante de equilíbrio de cerca de 1 (Tiidus et al., 2012), por isso a concentração de alanina deve aproximar−se da concentração de piruvato e a conversão de piruvato em alanina não deve diminuir a conversão de piruvato em La -.

3. Reacções gluconeogénicas / Gliconeogénicas. In gluconeogenic tissues, pyruvate can be converted to oxaloacetate in a reaction catalyzed by pyruvate carboxylase (Pascoe and Gladden, 1996). Na gliconeogénese do músculo esquelético, o piruvato pode ser convertido em malato com catálise pela enzima malica (Pascoe e Gladden, 1996) ou com maior probabilidade de fosfoenolpiruvato através da reversão da reacção de cinase piruvato (Donovan e Pagliassotti, 2000). Estas reacções representam a “reversão” da glicólise e começam com La−, o produto final natural da glicólise. No cérebro, o glicogênio é mais abundante em astrócitos e escasso a insignificante em neurônios (Cataldo e Broadwell, 1986). Embora a carboxilase de piruvato seja expressa em células astrogliais cultivadas, oligodendrócitos, células microgliais e ependimócitos (Murin et al., 2009), desconhecemos qualquer informação sobre a capacidade de qualquer uma destas células sintetizar glicogénio a partir de La -.

4. Transporte através da membrana interna mitocondrial com subsequente conversão em acetil-CoA através da reacção de piruvato desidrogenase (PDH), seguida pela entrada no ciclo do ácido tricarboxílico e oxidação. O piruvato atravessa a membrana mitocondrial interna por difusão simples e difusão facilitada; os transportadores são um MCT (Hashimoto et al., 2006) and the mitochondrial pyruvate carrier (Divakaruni and Murphy, 2012). Para a oxidação contínua do piruvato, o shuttling da NADH para a matriz mitocondrial pelos vaivéns malato-aspartato e fosfato de glicerol é igualmente importante como o transporte de piruvato.

a presença constante de La-e sua acumulação durante períodos de estimulação glicolítica é evidência de que a reação LDH predomina sobre estes destinos alternativos de piruvato.

A Figura 1 ilustra um modelo de metabolismo intracelular que chamamos de “vaivém lactato citosol-a-mitocôndria”; sua origem pode ser atribuída a uma revisão do metabolismo La por Stainsby e Brooks (1990). Devido à alta atividade LDH e uma constante de equilíbrio distante na direção de La−, La− é sempre o resultado predominante da glicólise. No entanto, a formação de La− não é sinônimo de la− acumulação e aumento . As mitocôndrias constituem um sumidouro para o piruvato e, em condições de lenta actividade glicolítica com amplo O2, a oxidação na maioria das células é suficiente para corresponder estreitamente à produção por glicólise; o fluxo la transmembranar variará entre a lenta libertação e a lenta absorção, sendo a libertação a condição mais típica. De forma análoga à creatina cinase e ao vaivém fosfocreatina, o LDH mantém o piruvato e o La− in em equilíbrio ao longo do citosol celular. Neste cenário, La-é a espécie primária que viaja para a vizinhança do retículo mitocondrial, mais provavelmente para o espaço intermembranar onde LDH Está ligado ao lado exterior da membrana mitocondrial interna (Hashimoto et al., 2006; Gladden, 2008). Aqui, La-é convertido em piruvato para entrada na mitocôndria, dado o relativo “lava-loiça” para piruvato. Simultaneamente, NADH é regenerado a partir da reversão da reação LDH e seu par de elétrons é empurrado através da membrana mitocondrial interna pelos vaivéns de malato-aspartato e fosfato de glicerol. Uma diferença importante em relação ao vaivém fosfocreatina é que dois componentes− chave, La-e piruvato, ao contrário da fosfocreatina, podem atravessar a membrana plasmática e deixar a célula.

o paradigma citosol-a-mitocôndria postula que o La− é sempre formado durante a glicólise, mesmo que o La− não se acumule e seja estável. Naturalmente, se o O2 é tão baixo que a fosforilação oxidativa é inibida, então a La-produção vai exceder a taxa a que o metabolismo oxidativo pode usar piruvato e NADH, causando e La− efluxo a aumentar. Além disso, se a atividade glicolítica aumentar mesmo com amplos níveis de O2, como no músculo esquelético contraindo em intensidade moderada ou talvez em astrocitos ativados (Pellerin e Magistretti, 2011), A La− produção não será acompanhada por oxidação de piruvato e irá aumentar como o transporte de La− para fora da célula. Da mesma forma, se a atividade enzimática glicolítica é potenciada e/ou a função mitocondrial (atividade enzimática oxidativa) é desregulada de tal forma que a glicólise é favorecida sobre a oxidação, haverá um desfasamento contínuo entre a La− produção e subsequente oxidação piruvato e NADH resultando em elevada e La− efluxo. Esta última situação é observada em células cancerígenas “Warburg” (Semenza, 2008) e em doentes com DPOC durante todo o exercício corporal in vivo (Maltais et al., 1996).

com treino de exercício de resistência, o conteúdo mitocondrial do músculo esquelético é aumentado (Holloszy e Coyle, 1984), e agora há uma maior pia para o piruvato. O aumento da atividade oxidativa mitocondrial requer níveis mais baixos de estimuladores (por exemplo, ADP) para uma determinada taxa de fosforilação oxidativa; estes mesmos estímulos são estimuladores alostéricos de enzimas glicolíticas-chave para que a glicólise seja reduzida. Além disso, se o transporte La− membrana é inibido, particularmente em células que já têm um desfasamento no qual a glicólise é favorecida sobre o metabolismo oxidativo, é provável que o celular aumente com efeitos potencialmente deletérios sobre a célula (Le Floch et al., 2011). Além disso, uma forte inibição da actividade LDH total nas células glicolíticas deve impedir o equilíbrio e, assim, reduzir a produção, acumulação e efluxo de La (Fantin et al., 2006). No entanto, o efeito de alterar o padrão da isoenzima LDH independentemente da inibição ou redução da actividade total da LDH ainda não está completamente resolvido (Downer et al., 2006).futuras direcções: influência da isoforma LDH e aplicações no metabolismo tumoral

Que impacto tem a isoforma LDH e como pode este conhecimento ser aplicado ao tratamento de doenças com metabolismo alterado, como os cancros?em primeiro lugar, a LDH é uma enzima tetramérica composta por duas subunidades proteicas que totalizam aproximadamente 135 kDa (Cahn et al., 1962). O tetramer pode montar como cinco isozymes por formar todas as combinações de M (músculo) formulário (produto do que o de Ldh-Um gene) ou H (coração) formulário (produto da Ldh-B do gene) produção: M4= A4 = LDH5), M3H1 (= A3B1 = LDH4), M2H2 (= A2B2 = LDH3), M1H3 (= A1B3 = LDH2) e H4 (= B4 = LDH1). Os resultados de investigações in vitro indicam propriedades cinéticas diferentes relativamente à afinidade e inibição do substrato entre estas isoenzimas. As isoenzimas dominadas por M têm valores de Km 3,5 a 7 vezes mais altos para piruvato e La do que as formas dominadas por H. Além disso, os tipos H4 são inibidos pelo piruvato em concentrações superiores a ~0,2 mM, enquanto os tipos M4 são pouco afectados por concentrações de piruvato tão elevadas como 5 mM (Plagemann et al., 1960; Stambaugh and Post, 1966; Quistorff and Grunnet, 2011b). A isoenzima H4 é inibida por mais de 20-40 mM, enquanto a isoenzima M4 é menos inibida por alta (Stambaugh e Post, 1966). Estes pontos têm sido oferecidos como evidência para diferenças funcionais no metabolismo celular de vários tecidos com as formas cardíacas promovendo oxidação, enquanto as formas musculares facilitam a formação de La – (Cahn et al., 1962). A distribuição de isoenzima LDH encontrada na natureza encaixa-se nestas características determinadas in vitro. Por exemplo, o twitch rápido, glicolítico, as fibras do músculo esquelético tipo II têm uma maior proporção de isoenzima LDH tipo M, enquanto os músculos esqueléticos tipo I oxidativos, tipo I, bem como o músculo cardíaco têm uma maior proporção da isoenzima LDH tipo H (Van Hall, 2000). Congruentemente, o treino de exercício de resistência diminui a proporção da isoenzima LDH tipo M nos músculos treinados (Van Hall, 2000). No cérebro, os astrócitos (que são postuladas para ter um maior glycolytic metabolismo), tem uma proporção maior do tipo M-LDH isozyme, enquanto que os neurônios (que são afirmou ter um alto metabolismo oxidativo), tem uma proporção maior do H-tipo de LDH isozyme (Schurr, 2006; Pellerin e Magistretti, 2011). Nos tumores, as células glicolíticas do tipo Warburg têm uma maior proporção de isoenzima LDH do tipo M, enquanto que as células cancerígenas oxidativas têm uma maior proporção de isoenzima LDH do tipo H (Semenza, 2008). Assim, a evidência circunstancial dos padrões de distribuição da isoenzima LDH coincide com a função perceptível das isoenzimas LDH determinada in vitro.

a evidência acima citada levou à conclusão de que o padrão de isoenzima LDH é um fator causativo no metabolismo La. Para elucidar ainda mais o papel da repartição da isoenzima LDH como coordenadora do metabolismo La, Summermatter et al. (2013) realizou uma investigação para testar o papel de o receptor activado receptor-γ proliferação 1α (PGC-1α) como regulador da LDH isozyme subtipo de expressão. O PGC-1α é conhecido por ser importante na coordenação do metabolismo da energia celular (Wu et al., 1999). Em resposta a uma variedade de estímulos, a PGC-1α estimula a biogénese mitocondrial, promove a transição do músculo esquelético para um fenótipo mais oxidativo e contribui para a alteração do metabolismo dos hidratos de carbono e lípidos (Liang e Ward, 2006).Summermatter et al. (2013) estudou os ratos transgénicos específicos do músculo PGC-1α, bem como os ratos nocaute PGC-1α específicos do músculo e encontrou (1) sangue mais baixo nos animais transgénicos, e sangue mais elevado nos animais nocaute em resposta ao exercício de resistência, e (2) expressão reduzida de LDH do tipo M nos animais transgénicos e LDH reduzida nos animais nocaute. Estes autores concluíram, como seu título afirma, que ” músculo esquelético PGC-1 α controla a homeostase de todo o corpo através da ativação dependente do receptor α-do estrogênio da LDH B E repressão da LDH A.”Em sua opinião, o padrão de isozima LDH é um importante jogador em todo o metabolismo do corpo de La−.no entanto, existem advertências pouco apreciadas relativamente às funções da isoenzima LDH e aos seus potenciais papéis no metabolismo. Em primeiro lugar, as propriedades cinéticas acima referidas para isoformas de LDH foram determinadas in vitro a 20 ou 25°C, e os valores-Km para o piruvato aumentam com a temperatura, duplicando aproximadamente a 37°C em comparação com 25°C (Latner et al., 1966; Quistorff and Grunnet, 2011b). Anteriormente, newsholme et al., e Leech (1983), Van Hall (2000), newsholme et al. (2004), Alegre (2008), e Quistorff e Grunnet (2011a), têm levantado questões importantes sobre o papel da LDH isozyme perfis em La− produção vs. utilização, observando que: (1) as enzimas não alteram a constante de equilíbrio de uma reação; (2) a LDH reação é perto de equilíbrio, minimizando efeitos alostéricos; (3) diferenças na LDH isozyme função in vivo são, possivelmente, bastante pequena, devido à maior fisiológicas temperaturas e a ligação a estruturas ou outras proteínas; (4) as concentrações de La e piruvato necessárias para a inibição da LDH in vitro são muito superiores às concentrações mais elevadas observadas in vivo; e (5) a inibição da LDH in vitro pode ser devida a Vestígios da forma de enol de piruvato que são menos prováveis de estar presente in vivo.

embora Summermatter et al. (2013) afirmar com convicção que o padrão isoforma LDH é um fator importante em todo o corpo La− metabolismo, há uma falha fatal em seu projeto. Ignoraram o facto de os ratinhos transgénicos PGC-1 terem aumentado a proliferação mitocondrial e as enzimas de fosforilação oxidativas, enquanto os ratinhos knockout PGC-1α têm reduções significativas nas actividades da citocromo oxidase e citrato sintase (Arany et al., 2005). Na nossa opinião, estas alterações na função mitocondrial, a elevada actividade LDH total anteriormente observada, independentemente do padrão de isoenzima, e a natureza de quase equilíbrio desta reacção tornam as conclusões da Summermatter et al. (2013) insustentável. Portanto, concluímos que os papéis fisiológicos e bioquímicos exactos das isoenzimas LDH in vivo permanecem por esclarecer definitivamente.finalmente, no que diz respeito ao metabolismo tumoral, compreender que La− é o produto final da glicólise é fundamental para a concepção de intervenções para atingir cancros. Brevemente, experiments by Cori and Cori (1925) and by Warburg et al. (1927) showed that tumors appeared to be avidly consuming glucose and producing La−. Dogma subseqüente no metabolismo tumoral tem mantido que os tumores exibem um “efeito Warburg”, produzindo e exportando La−. No entanto, agora sabemos que não só diferentes tipos de tumor lidar La de forma diferente (alguns são os produtores líquidos; alguns são os consumidores líquidos), mas mesmo dentro de um único tumor pode ser transportado entre diferentes tipos de células; uma célula para célula La− serviço de transporte (Semenza, 2008). Muitas células cancerosas são pobres consumidores de lactato (Sonveaux et al., 2008) sparking speculation that a La–protected hypocemia may be therapeutic (Nijsten and van Dam, 2009). Em contraste, alguns tumores avidamente usam La− como combustível, e respondem a la suplementar-com maior proliferação e vascularidade, provavelmente um resultado direto da regulação do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e fator de hipoxia-indutível 1α (HIF-1α). In a recent study on an animal model of a sarcoma, Goodwin et al. (2014) reported that La− drove sarcomagenesis in the absence of hypoxia. Surpreendentemente, a nossa compreensão do metabolismo de La no câncer permanece inquieta quase 90 anos após os primeiros estudos de Warburg.

conclusões

nossa compreensão da formação La mudou drasticamente desde a sua descoberta. Tradicionalmente, pensa− se que o piruvato seja o produto final da glicólise quando o O2 está presente e La-o produto final durante períodos de disoxia. No final do século XX e início do século XXI foi descoberto que o O2 não está limitando à fosforilação oxidativa sob a maioria das condições celulares, e La-é realmente produzido mesmo quando não há limitação na taxa de entrega de O2 para mitocôndria. Mais reflexão sobre a atividade da enzima LDH e a constante de equilíbrio de sua reação faz avançar a proposição de que La− é o produto final primário da glicólise sob a maioria, se não todas as condições metabólicas na maioria das células. O papel das diferentes isozimas LDH no metabolismo não é tão claramente evidente como a maioria dos pesquisadores sugerem, e concluímos que sua função exata permanece por descobrir. Se estamos ou não correctos sobre o vaivém lactato de citosol-a-mitocôndria, tal como descrito aqui, e o papel incerto das isoformas de LDH será difícil de avaliar em condições In vivo. Uma abordagem é modelagem em silício. Compreender os mecanismos exatos da glicólise e do La− metabolismo não só aprofundará a nossa compreensão do metabolismo em tecidos saudáveis, como também dará uma visão dos tecidos doentes ou feridos, sendo as aplicações mais óbvias o metabolismo dos hidratos de carbono demente presente nas células cancerosas (Vander Heiden et al., 2009) e metabolismo cerebral após lesão cerebral traumática (Brooks e Martin, 2014).

Declaração de conflito de interesses

os autores declaram que a investigação foi realizada na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que possam ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.Cahn, R., Zwilling, E., Kaplan, N., and Levine, l. (1962). Natureza e desenvolvimento das desidrogenases lácticas os dois principais tipos desta enzima formam híbridos moleculares que mudam na composição durante o desenvolvimento. Science 136, 962-969. doi: 10.1126 / science.136.3520.962

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