a fim de aproveitar o poder das endonucleases direcionadas, o laboratório Jerome trabalhou para otimizar um sistema de entrega útil tanto para estudos in vivo quanto in vitro. Eles usaram um vírus adeno-associado (AAV) sistema de entrega ao destino mouse trigeminal gânglios com qualquer uma das duas HSV endonucleases específicas: HSV1m5, que é projetado para decompor o virion proteína VP5 gene, e HS1m8 ,que tem como alvo o gene que codifica a polimerase do DNA subunidade catalítica. Criar mutações em qualquer um destes genes causa a ruptura do genoma viral e previne a produção de viriões. A fim de aumentar ainda mais os efeitos do tratamento com Trex-2, foi co-transduzida uma endonuclease 3′-5′, que demonstrou aumentar a mutagénese dirigida. Depois de estabelecer o sistema, o laboratório começou o trabalho in vitro focando nos neurônios, o tipo de célula biologicamente relevante. Culturas de neurônios foram co-transdutores com HSV1m5 ou 8 e Trex-2 e depois infectados com HSV. As culturas tratadas mostraram uma redução de 50% no título viral, bem como a presença de mutações no HSV pelo ensaio de Endonuclease 1 T7 e sequenciação clonal. Uma vez que a ruptura da infecção lítica foi estabelecida, os pesquisadores começaram a olhar para os efeitos nas diferentes fases da infecção HSV. Usando culturas infectadas de neurônios com HSV e posteriormente tratados com Hsv1m5 ou 8 com Trex-2 em diferentes pontos de tempo, os pesquisadores poderiam simular os vários estágios de infecção. Eles trataram culturas em 7 dias (fase aguda), 14 dias (fase aguda tardia/ latente precoce), e 32 dias (fase latente) e não encontraram alteração no efeito, independentemente da fase viral. Isto sugere que o HSV é igualmente susceptível à mutagenese da endonuclease, independentemente da fase viral. Os níveis de mutações no local alvo variaram entre 4, 5-7, 6% e 1, 1-6, 6% para HSV1m5 e HSV1m8 respectivamente. Atualmente, este é o primeiro estudo a analisar a atividade da endonuclease em neurônios infectados latentemente.encorajados pelos resultados in vitro, os investigadores realizaram estudos in vivo utilizando ratinhos infectados com HSV, seguidos 32 dias depois por AAV (expressando HSV1m5 ou 8 e Trex-2). Os neurónios dos ratinhos foram amostrados 30 dias após a injecção de AAV para o título viral, Carga viral e mutações do genoma HSV. O grupo mostrou mutações a 1-2% em ratinhos 2/4 para HSV1m5 e em ratinhos 3/4 para HSV1m8. No entanto, a carga viral destes animais foi semelhante entre os animais de controlo e os animais tratados. A disseminação Viral foi adiada por um dia nos animais tratados, mas atingiu níveis semelhantes ao longo do tempo em comparação com os não tratados. Ao refletir sobre os resultados, o Dr. Jerome disse: “esta é a primeira vez que uma infecção viral latente real foi estabelecida em um animal, e então desativada, mesmo parcialmente, usando terapia de endonuclease. Assim, representa um passo crítico para trazer tais terapias para a aplicação humana. O principal desafio agora é aumentar a potência da terapia, para que todo ou quase todo o vírus latente seja geneticamente desativado. Estamos investigando nucleases mais recentes e eficientes como CRISPR/Cas, e avaliando novos métodos de entrega das nucleases aos neurônios infectados in vivo.”No futuro, esta terapia pode levar a uma nova forma de pensar sobre o tratamento de doenças latentes, como HSV e HIV, que atualmente consideramos incuráveis.o financiamento desta investigação foi assegurado pelos Institutos Nacionais de Saúde e pela Fundação Canadiana.Aubert m, Madden EA, Loprieno M,Silva Feelixge HS,Stensland l,Huang ML,Greninger AL,Roychoudhury P,Niyonzima N,Nguyen T,Magaret a,Galleto R,Stone D, Jerome KR. 2016. Interrupção In vivo do HSV latente pela terapêutica com endonuclease do desenhador. JCI Insight, 1 (14).