| Taq polymerase, exonuclease | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|
 Full Taq DNA polymerase bound to a DNA octamer
|
||||||
| Identifiers | ||||||
| Symbol | Taq-exonuc | |||||
| Pfam | PF09281 | |||||
| InterPro | IPR015361 | |||||
| SCOP2 | 1qtm / SCOPe / SUPFAM | |||||
| Available protein structuren: | Pfam | VOB | PDBsum | |||
Taq PolA is een algemene structuur die lijkt op die van E. coli PolA. Het middelste 3′ -5 ‘ exonuclease domein verantwoordelijk voor het proeflezen is dramatisch veranderd en is niet functioneel. Het heeft een functioneel 5’ -3 ‘ exonuclease domein bij de amino terminal, hieronder beschreven. De overige twee domeinen handelen in coördinatie, via gekoppelde domein beweging.
Exonuclease domainEdit
Taq-polymerase exonuclease is een domein dat wordt aangetroffen in de amino-terminal van Taq DNA-polymerase I (thermostabiel). Het veronderstelt een ribonuclease h-achtig motief. Het domein verleent 5′ -3 ‘ exonucleaseactiviteit aan de polymerase.
In tegenstelling tot hetzelfde domein in E. coli, dat primers zou afbreken en door vertering voor PCR-gebruik moet worden verwijderd, wordt van dit domein niet gezegd dat het de primer afbreekt. Deze activiteit wordt gebruikt in de Taqman-sonde: aangezien de dochterbundels worden gevormd, komen de complementaire sondes aan het malplaatje in contact met de polymerase en in fluorescente stukken gespleten.
Binding met DNAEdit
Taq-polymerase wordt gebonden aan de polymerase actieve plaats gespleten met het stompe uiteinde van duplex-DNA. Aangezien de polymerase Taq in contact is met gebonden DNA, vormen zijn zijkettingen waterstofbanden met purines en pyrimidines van DNA. Het zelfde gebied van Taq-polymerase dat aan DNA heeft gebonden bindt ook met exonuclease. Deze structuren gebonden aan de Taq polymerase hebben verschillende interacties.
MutantsEdit
een site-directed mutagenesexperiment dat de restigale 3′-5′ exonucleaseactiviteit met een factor 2 verbetert is gemeld, maar er is nooit gerapporteerd of hierdoor het foutenpercentage daalt. Het volgen van een gelijkaardige lijn van gedachte, zijn de Chimera proteã nen gemaakt door kersen-plukken domeinen van E. coli, Taq, en T. neapolitana polymerase I. Het verwisselen van het overblijfseldomein voor functionele één van E. coli creëerde een proteã ne met proof-reading capaciteit maar een lagere optimale temperatuur en lage thermostability.
versies van de polymerase zonder het 5′-3′ exonuclease domein zijn geproduceerd, waaronder Klentaq of het Stoffel fragment zijn het best bekend. Het volledige gebrek aan exonucleaseactiviteit maakt deze varianten geschikt voor inleidingen die secundaire structuur vertonen evenals voor het kopiëren van cirkelmolecules. Andere variaties zijn het gebruik van Klentaq met een high-fidelity polymerase, een Thermosequenase die substraten herkent zoals T7 DNA-polymerase, mutanten met hogere toleranties op remmers, of “domein-tagged” versies die een extra helix-haarspeld-helix motief rond de katalytische site hebben om het DNA strakker vast te houden ondanks ongunstige omstandigheden.
significantie in disease detectionEdit
vanwege de verbeteringen die Taq-polymerase levert in PCR DNA-replicatie: hogere specificiteit, Minder niet-specifieke producten, en eenvoudiger processen en apparatuur, het is instrumenteel geweest in de inspanningen om ziekten op te sporen. “Het gebruik van polymerasekettingreactie (PCR) in infectieziektediagnose, heeft geresulteerd in een vermogen om vroeg te diagnosticeren en op de juiste wijze ziekten te behandelen als gevolg van veeleisende pathogenen, de antimicrobiële gevoeligheid van langzaam groeiende organismen te bepalen en de kwantum van infectie vast te stellen.”De implementatie van Taq polymerase heeft talloze levens gered. Het heeft een essentiële rol gespeeld bij de detectie van veel van ‘ s werelds ergste ziekten, waaronder: tuberculose, streptokokken faryngitis, atypische longontsteking, AIDS, mazelen, hepatitis en ulceratieve urogenitale infecties. PCR, de methode die wordt gebruikt om exemplaren van specifieke steekproeven van DNA opnieuw te maken, maakt ziekteopsporing mogelijk door een specifieke opeenvolging van DNA van een gerichte ziekteverwekker van de steekproef van een patiënt te richten en spoorhoeveelheden van de indicatieve opeenvolgingen te versterken door hen tot miljarden tijden te kopiëren. Hoewel dit de meest nauwkeurige methode van ziektedetectie is, vooral voor HIV, wordt het niet zo vaak uitgevoerd als alternatieve, inferieure tests vanwege de relatief hoge kosten, arbeid en tijd die nodig zijn.
de afhankelijkheid van Taq-polymerase als katalysator voor het PCR-replicatieproces is benadrukt tijdens de Covid-19-pandemie van 2020. Tekorten aan het noodzakelijke enzym hebben het vermogen van landen over de hele wereld om testkits voor het virus te produceren, aangetast. Zonder Taq-polymerase is het ziekteopsporingsproces veel langzamer en vervelend.
ondanks de voordelen van het gebruik van Taq-polymerase bij de detectie van PCR-ziekten, is het enzym niet zonder tekortkomingen. Retrovirale ziekten: HIV, HTLV-1, en HTLV-II; omvatten vaak mutaties van guanine aan adenine in hun genoom. De veranderingen zoals deze zijn wat PCR tests toestaan om de ziekten te ontdekken maar het vrij lage getrouwheidstarief van Taq polymerase maakt de zelfde mutatie G-Aan-a voorkomen en mogelijk een vals positief testresultaat opleveren.