het EXPERIMENT
zoals gepresenteerd in de problem‐solving test in the last issue of Biochemistry and Molecular Biology Education , wordt de transcriptie-eenheid die de enzymen van tryptofaan biosynthese codeert gereguleerd door de trp1 repressor: tryptofaan die als corepressor werkt bindt aan en activeert de onderdrukker, die op zijn beurt aan het operatorgebied bindt en de beweging van de polymerase van RNA en, aldus, de transcriptie van de structurele genen trp E, D, C, B, en een codage voor enzymen van tryptofaansynthese blokkeert. Echter, deze remming is “Lek”: er is enige transcriptie van het operon, zelfs in de aanwezigheid van tryptofaan; dit zou energie verspillen voor het produceren van enzymen die niet nodig zijn. Een tweede regulerend mechanisme, genaamd demping, slaat deze resterende transcriptie neer op het TRP operon .
een kort gebied tussen de operator en het eerste structurele gen (trp E), genaamd leader (Fig. 1), is verantwoordelijk voor de verzwakking. De leaderopeenvolging is 140 140 lange basispairs en codes voor het 5 ‘ – eindgebied van trp mRNA dat het initiatiecodon van het eerste structurele gen voorafgaat. De leader regio van trp mRNA heeft een unieke structuur (Fig. 2 bis). Het bevat een korte open lezingskader (ORF) codage voor oligopeptide genoemd leaderpeptide. Twee palindromic opeenvolgingen (gebied 1/2 en gebied 3/4) veroorzaken het zelf‐complementaire basepairing dat tot de vorming van haarspeldstructuren leidt. De tweede haarspeld (regio 3/4) wordt gevolgd door een stuk van ons, het creëren van een structurele karakteristiek van bepaalde transcriptie terminators. De ORF-codering voor het leader-peptide overlapt met Regio 1 en bevat twee codons voor tryptofaan. Bovendien zijn de regio ’s 2 en 3 niet alleen complementair aan respectievelijk de regio’ s 1 en 4, maar ook aan elkaar. Deze nogal ingewikkelde structuur van de leader-sequentie zet de toon voor een ingenieus reguleringsmechanisme voor de transcriptie van het operon.
Fig. 1. De structuur van het tryptofaan operon van E. coli.(P, promotor; O, operator; L, leader; E, D, C, B, en a, structurele genen. Het cijfer wordt niet op schaal getrokken: P, O, en L gebieden zijn veel korter dan eiwitcodagegenen.)
Fig. 2. Verzwakking in de regulatie van het trp operon van E. coli. (a) de structuur van de 5’‐end Regio trp mRNA. B) ontspanning van de demping in laag‐tryptofaanmedium. (C) vroegtijdige beëindiging (verzwakking) van trp transcript in high‐tryptofaan medium (voor details zie de tekst).
demping is gebaseerd op gekoppelde transcriptie/vertaling in prokaryotes: ribosomen binden zich aan opkomende mRNA ‘ s die chromosoom–polysoomcomplexen vormen; zo begint de eiwitsynthese met het kweken van mRNA-ketens. Als tryptofaan niet beschikbaar is (Fig. 2b), kraamt het ribosoom in de leider peptide codage ORFs die haarspeld 1/2 verstoren en tot de vorming van haarspeld 2/3 leiden. Deze haarspeld verhindert de generatie van de beëindigingshaarspeld 3/4 (genoemd attenuator), en, zo, is de polymerase van RNA in staat om verlenging voort te zetten en transcribeert het gehele operon in een volledige lengte transcript. Echter, als tryptofaan aanwezig is, blijft het ribosoom in beweging en voorkomt de vorming van zowel haarspeld 1/2 en 2/3 (Fig. 2c). De attenuator haarspeld 3/4 kan vormen en eindigt transcriptie. Leader peptide en het korte leader RNA worden dan snel afgebroken, en de structurele genen worden niet getranscribeerd. Bekijk het mechanisme en los de volgende test op.
in dit fictieve experiment worden twee TRP-operonmutanten gebruikt: in één van hen werden de twee UGG-codons die voor tryptofaan coderen, omgezet in GGGs (codons voor glycine; gedurende de hele test aangeduid als “trp-codon mutant”); in de andere werd Regio 3 geschrapt (“Regio 3-mutant”).
wildtype E. coli cellen, ” trp codon mutanten “en” Regio 3 mutanten ” worden gekweekt in een rijk medium dat alle aminozuren (inclusief tryptofaan) in optimale concentraties bevat. Wat gebeurt er met hen?
Experimentanalyse
- (a)
als de verklaring wordt ondersteund door de gegeven informatie;
- (b)
als de verklaring wordt tegengesproken door de gegeven informatie;
- (c)
als de verklaring niet wordt ondersteund of tegengesproken door de gegeven informatie.
- 1)
__ _ _ “Trp codon mutant” cellen sterven af.
- 2)
_ _ _ _ _ Wild-type cellen groeien het snelst.
- 3)
____ _ “Region 3 mutant” cellen groeien het traagst onder dergelijke omstandigheden.
- 4)
__ _ _ Chromosoompolysoomcomplexen vormen zich op het TRP-operon in alle drie de cellen.
- 5)
__ _ _ tryptofaan wordt alleen in “region 3 mutant” cellen in significante hoeveelheden gesynthetiseerd.
- 6)
___ _ _ met behulp van een trp‐leider-DNA-fragment als probe identificeert een analyse van de noordelijke vlek van cellulair RNA in “trp-codonmutanten” een sterke band die overeenkomt met een 140-nucleotide-RNA.
- 7)
____ _ met dezelfde sonde worden grote hoeveelheden trp-operonafschriften van volledige lengte gedetecteerd in wild – type CELRNA-monsters.
dezelfde cellen worden nu gekweekt in een medium dat alle aminozuren behalve tryptofaan bevat. Hoe gedragen de cellen zich onder dergelijke omstandigheden?
Experimentanalyse
- (a)
als de verklaring door de gegeven informatie wordt ondersteund;
- (b)
als de verklaring door de gegeven informatie wordt tegengesproken;
- (c)
als de verklaring niet door de gegeven informatie wordt ondersteund of tegengesproken.
- 8)
__ _ _ “Trp codon mutant” cellen sterven af.
- 9)
__ _ _ _ Wild-type cellen groeien het snelst.
- 10)
____ _ “Region 3 mutant” cellen groeien het traagst onder dergelijke omstandigheden.
- 11)
__ _ _ Chromosoompolysoomcomplexen vormen zich op het TRP-operon in alle drie de cellen.
- 12)
__ _ _ tryptofaan wordt alleen in “region 3 mutant” cellen in significante hoeveelheden gesynthetiseerd.
- 13)
___ _ _ met behulp van een trp‐leider-DNA-fragment als probe identificeert een analyse van de noordelijke vlek van cellulair RNA in “trp-codonmutanten” een sterke band die overeenkomt met een 140-nucleotide-RNA.
- 14)
____ _ met dezelfde sonde worden grote hoeveelheden trp-operonafschriften van volledige lengte gedetecteerd in wild – type CELRNA-monsters.