presynaptische hyperpolarisatie induceert een snelle analoge modulatie van spike-opgewekte transmissie gemedieerd door axonale natriumkanalen

hyperpolarisatie-geïnduceerde ad facilitering

we hebben eerst de incidentie van korte hyperpolarisatie van de presynaptische cel gemeten bij synaptische transmissie. Paren van monosynaptisch verbonden CA3 neuronen werden geregistreerd in organotypische culturen van de rattenhipocampus na 8-10 dagen in vitro (DIV)21. Een 200-lidstaten hyperpolariserende pre-impuls die vóór de presynaptische piek werd geleverd werd gevonden om synaptische sterkte met ∼20% (Fig. 1 bis). Deze toename werd waargenomen bij het meten van de amplitude of lading van de postsynaptische respons (aanvullende Fig. 1). In deze experimenten was het presynaptische rustpotentieel -74±3 mV (n=10). De H-ADF was vergelijkbaar wanneer de presynaptische hyperpolarisatie -84 of -102 mV bedroeg (respectievelijk 124±8% versus 119±5%, n = 10; Wilcoxon test P>0.1), wat suggereert dat een presynaptische hyperpolarisatie van ∼10 mV voldoende is om verzadigde h-ADF te verkrijgen. h-ADF werd geassocieerd met een verminderde gepaarde pulsverhouding (PPR, van 99±7 tot 88±5%, n=12; Wilcoxon-test P<0,05; aanvullende Fig. 1), wat aangeeft dat het het gevolg is van een presynaptische toename van de glutamaatafgifte.

een 200 ms lange hyperpolarisatie is onwaarschijnlijk in een fysiologische context. Daarom onderzochten we het tijdsverloop van h-ADF voor kortere hyperpolarisaties (15, 50, 100 en 200 ms). h-ADF werd waargenomen voor alle geteste duur van hyperpolarisatie (15 ms: 111±3%, 50 ms: 116±4%, 100 ms: 109±4%, 200 ms: 120±6% Wilcoxon, p<0,05 voor alle duur, n=7, Fig. 1 ter). Volgens dit resultaat, zal H-ADF waarschijnlijk door fysiologische hyperpolarisatie worden veroorzaakt.

CA3 piramidale neuronen drukken depolarisatie-geïnduceerde ad facilitering (d-ADF)uit die het gevolg is van de langzame inactivering van KV1. 1 kanalen (tijdconstante: 3,3 s)13. We hebben dus onderzocht of zowel d – Als h-ADF werden uitgedrukt op dezelfde CA3–CA3 verbindingen. Presynaptic APs werden alternatief teweeggebracht van het rusten membraanpotentieel (-78 MV controle), na een lange subthreshold depolarisatie (10 s, -62.6 mV, d-ADF), na een korte hyperpolarisatie (200 ms, -96.1 mV, h-ADF) of na de combinatie van een lange depolarisatie en een korte hyperpolarisatie (D – en h-ADF; Fig. 1c, links). In feite gaf de combinatie van de twee vormen van ADF, in dezelfde verbindingen, een grotere facilitering (113±3%, N = 16; Fig. 1c) dan die afzonderlijk geproduceerd door elk protocol (alleen d-ADF: 105±3%, N = 16, alleen h-ADF: 108±4%, N = 11; Fig. 1c). In het bijzonder, gemiddeld h – en D-ADF werden gevonden om lineair samen te tellen, die twee onafhankelijke moleculaire mechanismen voorstellen. Bovendien waren d – en H-ADF gemeten in dezelfde paren positief gecorreleerd (aanvullende Fig. 1), wat suggereert dat sommige synaptische verbindingen vatbaarder zijn voor ad-facilitering, waarschijnlijk omdat analoge signaalpropagatie langs het axon afhankelijk is van de afstand tussen de soma en de presynaptische terminals. Deze gegevens tonen aan dat H-en d-ADF naast elkaar bestaan in CA3 piramidale neuronen en dat de onderliggende mechanismen waarschijnlijk onafhankelijk zijn.

h-ADF werd waargenomen bij jonge CA3–neuronen (DIV8–10 bereid uit P5-P7-ratten) en kon dus voornamelijk het gevolg zijn van de lage dichtheid of onvolgroeide eigenschappen van spanningsgesloten ionenkanalen. We bepaalden daarom of h-ADF ook werd gevonden in volwassen CA3 piramidale cellen. Gepaarde opnames van verbonden CA3 neuronen werden verkregen in div24–DIV32 slice culturen. Korte presynaptische hyperpolarisatie (200 ms) aanzienlijk verhoogde synaptische sterkte (104.2±1,1% n = 25; Wilcoxon, P<0,01; aanvullende Fig. 2). h-ADF gemeten in volwassen cellen was kleiner dan die gemeten in ontwikkelende neuronen (Mann-Whitney, P<0,01; aanvullende Fig. 2). We concluderen daarom dat h-ADF in vitro ontwikkeld wordt in CA3 neuronen.

alle opnames werden verkregen met een hoge extracellulaire calcium (3 mM) om de synaptische sterkte te optimaliseren. Onder deze omstandigheden is de kans op presynaptische afgifte hoog en kan presynaptische facilitering zoals h-ADF worden onderschat. Daarom hebben we h-ADF gemeten in volwassen CA3 neuronen (DIV24–DIV32) geregistreerd met fysiologisch extracellulair calcium (1,3 mM)22. Onder deze omstandigheden bleek h-ADF ongeveer +16,4% te bedragen (Wilcoxon, P<0,01; aanvullend Fig. 2). Wij concluderen dat h-ADF robuust wordt uitgedrukt in Rijpe neuronen geregistreerd in fysiologisch extracellulair calcium.

h-ADF wordt geïnduceerd door gesimuleerde IPSP ‘ s en oscillaties

om de rol van h-ADF onder bijna fysiologische omstandigheden te onderzoeken, werd een GABAA-achtige geleidbaarheid geïntroduceerd in het presynaptische neuron met behulp van dynamische klem (Fig. 2a, links). In overeenstemming met de in Fig. 1, ApS voorafgegaan door de injectie van een IPSC-achtige stroom, produceerde een grotere respons in het postsynaptische neuron vergeleken met APs veroorzaakt door rusten membraanpotentiaal (Wilcoxon P<0,001, n=11). Consistent met een presynaptische verhoging van de glutamaatafgifte, was de PPR verminderd wanneer gesimuleerde Gabaerge IPSPs voorafgingen aan APs (van 121% in controle tot 96%; Wilcoxon P<0,05, n=7; gegevens niet getoond). Interessant is dat de grootte van de synaptische potentiëring afhankelijk bleek te zijn van de grootte van de gesimuleerde IPSP (R2=0,39, P<0,05), wat erop wijst dat h-ADF is gesorteerd tussen rustmembraan potentiaal (-74 MV) en 10-mV hyperpolarisatie (-84 MV; Fig. 2a, rechts). In feite, werd de faciliteringsfactor in deze waaier gevonden om 1,8% per MV van hyperpolarisatie te zijn.

vervolgens onderzochten we de modulatie van synaptische sterkte tijdens presynaptische membraanpotentiaal oscillatie. Oscillatie van de presynaptische membraanpotentiaal bij 4 Hz werd veroorzaakt door het injecteren van sinusoïdale stroom, en enkele presynaptische pieken werden opgeroepen in verschillende fasen van de oscillatie. In overeenstemming met de vorige resultaten werd h-ADF waargenomen wanneer de cel vuurde tijdens hyperpolariserende fasen van de oscillatie (0 ms: 124,3±7%, 250 ms: 122±7%, Wilcoxon P<0,05, n = 8; Fig. 2b). In andere fasen is de synaptische sterkte onveranderd (56 ms: 112,2±6%, 163 ms: 95,8±5%, 211 ms: 110,5±6%, Wilcoxon P>0,1, n=8). In het bijzonder wordt geen d-ADF waargenomen bij de depolarisatie omdat de duur ervan te kort is om KV1.1-kanalen te inactiveren13. We concluderen dat oscillaties in het θ bereik h-ADF induceren in CA3 neuronen.

h-ADF wordt geassocieerd met een toename in axonale piekamplitude

vervolgens onderzochten we de onderliggende mechanismen van h-ADF. Een mogelijk mechanisme voor h-ADF is een modulatie van de presynaptische piekamplitude die door de hyperpolarisatie wordt veroorzaakt. We onderzochten daarom het gevolg van hyperpolarisatie op de piekamplitude gemeten in het axon. CA3 neuronen werden gevuld met Alexa 488 (50 µM) om de Axon arborization te visualiseren, en cell-attached opnames werden verkregen van het axon op afstanden variërend tussen 60 en 240 µm (Fig. 3a). Bij somatische hyperpolarisatie werd de amplitude van de axonale piek verhoogd (106±1% van de controleamplitude, n = 6, Wilcoxon, P<0,05; Fig. 3b). Echter, de grootte van axonale spike facilitering bleek te verminderen met de axonale afstand met een ruimteconstante van 212 µm (Fig. 3b). Concluderend, wordt h-ADF in CA3 neuronen geassocieerd met een lokale verhoging van spike amplitude in het axon.

terwijl opname van hele cellen uit CA3-axonen uiterst moeilijk is in organotypische culturen, kan het worden verkregen in L5 piramidale neuronen uit acute slices5,6. Daarom hebben we eerst gemeten of h-ADF ook kon worden waargenomen bij L5–L5 opwindende verbindingen. Paren van monosynaptisch verbonden L5 piramidale neuronen werden geregistreerd in acute plakjes van de sensori-motorische cortex van jonge ratten (P14–P20). Korte hyperpolarisatie in het soma (200 ms, 10-15 mV) van het presynaptische neuron bleek synaptische sterkte te verhogen (109,6±2,3%, N=13, Wilcoxon test, P<0,05; Fig. 4a).

om te bevestigen dat H-ADF in L5 piramidale neuronen geassocieerd was met een toename van axonale piekamplitude, werden gelijktijdige opnames van hele cellen van het soma en cut-end axonen (blebs) verkregen (50-80 µm van het soma) in L5 piramidale neuronen. Voorbijgaande hyperpolarisatie van het soma (ongeveer -13 mV) verhoogde de amplitude van de piekoverschoot in het axon maar niet in het soma (+5,5±1,5 versus -0,3±1,1 mV, n=5, Mann–Whitney, P<0,05; Fig. 4b). De snelheid van depolarisatie werd ook verhoogd (van 251±59 tot 289±56 mV ms−1, n=5) en de piekdrempel werd hyperpolariseerd (van -35,7±5,2 tot -38,8±4,3 mV, n=5). We concluderen dat H-ADF in zowel CA3 als L5 piramidale cellen geassocieerd is met de toename van de piekamplitude gemeten in het axon.

h-ADF wordt geassocieerd met verbeterde axonale calciumsignalen

vervolgens gebruikten we Ca2+ beeldvorming om het gevolg te bepalen van hyperpolarisatie-geïnduceerde versterking van spike amplitude in het axon. CA3 piramidale neuronen werden gevuld met 50µm Alexa-594; 250 µM Fluo-4 en spike-opgeroepen calcium signalen werden gemeten in vermeende en passant boutons op afstanden variërend tussen 150 en 250 µm van de soma (Fig . 5a). De integraal van de piek-opgeroepen Ca2+ transiënte was verhoogd wanneer de presynaptische piek werd opgeroepen na een voorbijgaande hyperpolarisatie van ∼20 mV (126±10%, N=5; Fig. 5b). Wij concluderen dat, tijdens h-ADF, presynaptic hyperpolarisatie zowel presynaptic spike amplitude als spike-veroorzaakte Ca2+ instroom verbetert, die vervolgens glutamaatversie verbetert.

Nav-kanaalinactivatie in het axon bepaalt h-ADF

de verhoogde amplitude van de axonale piek tijdens hyperpolarisatie kan te wijten zijn aan het herstel van Nav-kanalen na inactivatie. Om de rol van natriumkanaalinactivatie in h-ADF te bevestigen, gebruikten we een NEURONMODEL van twee monosynaptisch verbonden CA3 neuronen. Vervolgens bepaalden we de incidentie van modificerende inactivatie van natriumkanalen in het axon op h-ADF. Toen de half-inactivatie van axonale natriumkanalen aan -80 mV (refs 18, 19) werd geplaatst, verbeterde somatische hyperpolarisatie de aaramplitude, de last van AAR-opgeroepen calciumstroom en synaptische transmissie (Fig. 6a, links). Dit is toe te schrijven aan het herstel van Nav kanalen van inactivering door hyperpolarisatie (Fig. 6b, links). Er trad echter geen verandering op als de halve inactivatie van de axonale natriumkanalen werd ingesteld op -70 mV (Fig. 6a, rechts). In dit laatste geval is het aandeel van de beschikbare Nav-kanalen reeds zeer hoog bij rustmembraan potentieel, het produceren van een AP van volledige amplitude (Fig. 6a, B, rechts). Daarom heeft het herstel van inactivatie geen verdere invloed op de presynaptische piekamplitude. Aldus, is H-ADF in het model toe te schrijven aan de terugwinning van Nav kanalen van inactivatie en door hyperpolariserende NAV half-inactivatie (Fig. 6c).

bovendien hebben we ons NEURONMODEL gebruikt om de beschikbaarheid van axonale Nav-kanalen te simuleren tijdens een Theta-oscillatie die vergelijkbaar is met die in Fig. 2b. Nav kanalen werden gevonden om te inactiveren tijdens depolarisatie en te herstellen tijdens hyperpolarisatie, verklaren de epsc modulatie tijdens de oscillatie (aanvullende Fig. 4). Inactivatie is echter sneller dan herstel tijdens de oscillatie vanwege de tragere kinetiek van de Nav bij gedepolariseerde potentialen (aanvullende Fig. 4). Dit verklaart waarom epscs bij 163 lidstaten produceerde geen h-ADF presenteerde, hoewel de piek van een lichtjes hyperpolarized potentieel wordt uitgezonden (Fig. 2b). In feite, op dit punt van de oscillatie Nav kanalen had niet genoeg tijd om te herstellen van inactivering (aanvullende Fig. 4).

al met al ondersteunen deze resultaten het feit dat h-ADF te wijten is aan de recuperatie van Nav-kanalen na inactivatie.

Nav-kanaaldichtheid bepaalt de sterkte van h-ADF

h-ADF hangt af van de beschikbaarheid van natriumkanalen in het axon. Het verminderen van de dichtheid van Nav-kanalen zou dus invloed moeten hebben op h-ADF. In feite toonde ons model aan dat het verminderen van de Nav-kanaaldichtheid tot 70% van de controleconditie h-ADF Verbeterde van 130 tot 180% (Fig. 7a). De kritische parameter hier was de winst van presynaptische piek overshoot die afhangt van activeerbare na geleidbaarheid (Fig. 7 ter). Onder controlevoorwaarde, was deze waarde al hoog, en hyperpolariserend het presynaptic element van -78 aan -93 MV verbeterde de amplitude van de piek met 28%. Toen de dichtheid van Nav werd verminderd, verbeterde dezelfde hyperpolarisatie de amplitude van presynaptic AP met 42%.

vervolgens hebben we experimenteel geverifieerd dat het verminderen van de Nav-kanaaldichtheid h-ADF verhoogde in CA3-neuronen. Daarom hebben we de Nav-kanalen met een lage concentratie tetrodotoxine (TTX) in het bad gedeeltelijk geblokkeerd (15-25 nM). Bij deze concentratie blokkeert TTX ∼80% van de Na + stroom, maar behoudt de inductie van snelle Na + spikes24, 25. In aanwezigheid van TTX werd de piekamplitude in het soma verminderd met 45±4% (n=9) en de synaptische transmissie bij CA3–CA3 verbindingen werd verminderd met 55±8% (N=9; aanvullende Fig. 5). Het belangrijkste is dat het verminderen van het aandeel van activeerbare Nav-kanalen met 15-25 nM TTX h-ADF in Rijpe neuronen die geen h-ADF tot expressie brengen (van 103±3% in controle tot 121±4% in aanwezigheid van TTX, n=6, Wilcoxon P<0,05; Fig. 7c, d). Deze gegevens bevestigen daarom dat h-ADF in CA3 neuronen afhangt van de beschikbaarheid van Nav kanalen.

T-type Ca2+ kanalen zijn aanwezig in het axon. Zij konden tijdens de hyperpolarisatie–depolarisatieopeenvolging worden geactiveerd die wordt gebruikt om h-ADF te veroorzaken en zo kunnen h-ADF verklaren. H-ADF bleek echter stabiel te blijven in aanwezigheid van 100 nM mibefradil, een T-type kanaalblokker (van 112,2±1,1% in controle tot 116,2±11,9% met mibefradil, n=3; gegevens niet getoond), wat erop wijst dat T-type Ca2+-kanalen niet deelnemen aan h-ADF.

h-ADF bevordert netwerksynchronie

vervolgens testten we de implicatie van h-ADF in netwerksynchronie met behulp van een hippocampaal netwerkmodel gevormd door 80 piramidale-achtige prikkelende cellen (e-cellen) en 20 interneuron-achtige remmende cellen (i-cellen) onderling verbonden (Fig. 8a; zie methoden). e-en i-cellen werden gevoed door stochastische input. Het netwerk van e-cellen werd gesynchroniseerd, en oscillaties in het gamma-bereik verscheen als synaptische sterkte tussen e-cellen toegenomen (aanvullende Fig. 6). Deze oscillaties werden gedreven door i-cellen: activering van e-cellen werd gevonden om de activering van i-cellen te bevorderen, die op zijn beurt het hele netwerk tot zwijgen bracht (aanvullende Fig. 6). Aangezien h-ADF interpyramidale synaptische sterkte verhoogt wanneer de presynaptische piek door IPSP wordt voorafgegaan, is h-ADF een goede kandidaat om deze I-Cel-gedreven oscillaties te bevorderen.

De H-ADF-regel werd in het netwerk opgenomen door de synaptische sterkte tussen e-cellen te verhogen volgens de membraanpotentiaal gemeten 17 ms vóór de piek. In feite werd de synaptische sterkte met 20% verhoogd als het presynaptische potentieel lager was dan -84 mV (Fig. 8 ter). Deze regel werd rechtstreeks afgeleid uit experimenteel gemeten waarden (zie Fig.1a en 2a). Voor een e-cel-synaptische sterkte van 2.8 mS, verbeterde het toevoegen van h-ADF in het netwerk duidelijk zowel de het vuren frequentie als synchronie over e-cellen (Fig. 8c-e). In feite, werd de neiging om in het gamma waaier te oscilleren sterk vergemakkelijkt als h-ADF tussen e-cellen efficiënt was (Fig. 8e). Interessant is dat in een netwerk met rangeerremming (ECl=-73 mV in plaats van -80 MV in controleconditie), h-ADF regel de synchronie niet verbeterde en geen gamma oscillaties bevorderde (aanvullende Fig. 6). Nochtans, aangezien h-ADF de synaptische sterkte tussen e-cellen verhoogt, zou zijn synchroniserend effect eenvoudig toe te schrijven aan de verhoging van de spike tarief van het netwerk kunnen zijn. Om de pieksnelheid te verhogen zonder de synaptische sterkte te beïnvloeden, hebben we besloten om de inter-e-celsterkte op 2,5 mS te bevestigen en de frequentie van de externe schijf van e-cellen te verhogen van 6 tot 20 Hz. We hebben de synchronisatiecoëfficiënt uitgezet tegen de pieksnelheid van het netwerk. Zelfs als de synchronie om lineair aan piektarief bleek te worden gecorreleerd, verhoogde h-ADF de coëfficiënt van synchronisatie voor om het even welk gegeven piektarief in de waaier van 4-14-Hz (aanvullende Fig. 6). Dit toonde aan dat voor lage piektarief, h-ADF synchrony onafhankelijk van de gemiddelde netwerkactiviteit verhoogt. Concluderend, in ons model verhoogt h-ADF de netwerksynchronisatie en bevordert het oscillaties door interpyramidale synaptische sterkte te koppelen aan de activiteit van interneurons.