1 Theorie
oligonucleotiden worden gesynthetiseerd door de toevoeging van één base per keer, die zich uitstrekt van de 3′ tot de 5′-end, gekoppeld aan een solid-phase-ondersteuning. Wanneer de chemische synthese van oligonucleotide volledig is, wordt de keten van DNA vrijgegeven van de stevige steun door incubatie met ammoniumhydroxide. Ammonium werkt ook als een deprotectief middel, het splijten van de groepen die de fosfaten in de fosfodiësterbindingen beschermen. Hierna wordt hete ammoniak toegevoegd om de beschermende groepen van de exocyclische aminogroepen van deoxyadenosine, deoxycytosine, en deoxyguanosine te hydrolyseren. Oligonucleotide kan aan de gebruiker in de ammoniakoplossing als ruw preparaat worden geleverd. In dit geval kan het nodig zijn om vóór gebruik een extra stap uit te voeren om de zouten en bijproducten te verwijderen uit het oligonucleotidepreparaat dat tijdens de deprotectie wordt gegenereerd.
na deprotectie wordt het oligonucleotidepreparaat gewoonlijk ontzouten, gekwantificeerd, verdampt tot droogheid in een lyophilizer en aan de gebruiker geleverd in de vorm van een poeder. De ontzilte oligonucleotideoplossing bevat de volledige oligonucleotide maar bevat ook een mengsel van afgeknotte producten die tijdens de chemische synthese werden geaccumuleerd. Afkappen vindt plaats wanneer de opgegeven base niet aan de keten in de corresponderende cyclus kan toevoegen (Hecker & Rill, 1998). Het percentage afgeknotte producten dat zich in het preparaat ophoopt, wordt dus bepaald door de syntheseefficiëntie (de fractie van het volledige product na de synthese) en de lengte van het molecuul. De lange oligonucleotides, die meer cycli vereisen om worden samengesteld, zijn minder zuiver dan korte oligonucleotides. Deze mislukkingen kunnen met het volledige product in sommige toepassingen concurreren en kunnen verwijdering vereisen alvorens oligonucleotide kan worden gebruikt. Ontzouten oligonucleotidepreparaten zijn echter meestal geschikt voor vele toepassingen, zoals standaard PCR of microarrays, vooral als het oligonucleotide < 20 nucleotiden lang is.
verdere zuivering voor oligonucleotiden langer dan 50 basen wordt aanbevolen omdat het percentage van het volledige product in het preparaat doorgaans niet hoger is dan 80%. Voor veeleisende toepassingen waar de exacte lengte van het oligonucleotide belangrijk is, zoals gel-shift assays, site-directed mutagenese, sequencing, productie van het klonen adapters, of eerste-streng cDNA synthese voor het genereren van bibliotheken, wordt extra zuivering aanbevolen, zelfs voor kortere oligonucleotiden (zie meer informatie over de technieken hierboven over Standaard In vitro Assays voor eiwit-nucleïnezuur interacties – Gel shift Assays voor RNA en DNA Binding en Site-Directed mutagenese).
zuivering kan nodig zijn na synthese of na enzymatische modificatie van het oligonucleotide. Er zijn verscheidene methodes om dit te bereiken, en de keus hangt van de aard van oligonucleotide en de toepassing af dat het voor wordt bedoeld.
Reverse-phase HPLC zuivering is gebaseerd op hydrofobiciteit. Het gebruikt een niet-polaire stationaire fase, en waterige buffers en organische oplosmiddelen als mobiele fase om de analyten te elute; de polaire samenstellingen worden eerst geëlueerd, terwijl de niet-polaire samenstellingen worden behouden. Dit is de beste methode om oligonucleotides te zuiveren die met een hydrophobic groep, zoals biotine, fluorescente kleurstofetiketten, of NHS-estervervoegingen worden gewijzigd. De massaterugwinning is hoger dan wanneer het gebruiken van PAGINAREINIGING en het is vatbaar voor de zuivering van grotere hoeveelheden oligonucleotides (mmole-schaal), hoewel het onvolledige producten zo effectief niet verwijdert. De cartridges van de oligonucleotidereiniging, die op omgekeerde-fasechromatografie worden gebaseerd, verstrekken een snelle methode om oligonucleotides te ontzouten en te zuiveren.
polyacrylamidegelelektroforese (PAGE) Lost oligonucleotiden op volgens hun lengte en biedt daardoor voldoende resolutie om producten van volledige lengte te onderscheiden van mislukte moleculen (Atkinson and Smith, 1984). Polyacrylamide gels zijn effectiever voor het scheiden van kleine fragmenten van DNA dan agarose gels (zie analyse van RNA door analytische polyacrylamide gelelektroforese en Agarose gelelektroforese). Het enige nadeel van polyacrylamide gels is dat ze moeilijker te bereiden en te hanteren dan agarose gels. Polyacrylamide gels worden uitgevoerd in een verticale configuratie in een constant elektrisch veld. Na elektroforese, wordt oligonucleotide geëlueerd van het gel en geconcentreerd, gebruikend ethanolprecipitatie (vind meer op precipitatie van nucleic zuren op de zuiverings – precipitatie methodes van RNA) of omgekeerde-fasechromatografie. Dit is de methode van keus wanneer het hoogste percentage oligonucleotides van volledige lengte voor het eisen van toepassingen wordt gewenst. Het wordt ook sterk geadviseerd voor oligonucleotides langer dan 30 basissen. Ook kunnen meerdere monsters gelijktijdig worden uitgevoerd en is er geen dure apparatuur nodig. Het enige nadeel van deze techniek is de kleine hoeveelheid oligonucleotide die per zuivering wordt verkregen. Gewoonlijk worden oligonucleotiden gebruikt op een schaal van 1 µmol of minder, en de massaterugwinning na PAGINAZUIVERING is < 50% en zelfs lager in het geval van gemodificeerde oligonucleotiden. Niettemin, hoewel de opbrengst laag is, is het bevredigend voor de meeste biochemische toepassingen.
het oligonucleotidepreparaat wordt geladen op een denaturerende polyacrylamidegel in een hoeveelheid van ten minste 1 mg per rijstrook. Het bereik van de resolutie van de gel hangt af van de concentratie van polyacrylamide. Voor korte oligonucleotiden (van 15 tot 35 basen) worden 13-15% polyacrylamidegelen aanbevolen; voor langere oligonucleotiden (van 35 tot 70 basen) worden 8-13% polyacrylamidegelen aanbevolen. Het percentage van de gel moet worden aangepast aan het lopende systeem. Wij gebruiken gewoonlijk het Bio-Rad Mini Protean II systeem en lopen 15% gels om oligonucleotides van 25 basissen in lengte te zuiveren. Na identificatie van de juiste band door UV-visualisatie, wordt de band uitgesneden en uit de gel gehaald.
twee verschillende methoden voor het zuiveren van oligonucleotiden uit polyacrylamidegelen worden in dit hoofdstuk beschreven. De eenvoudigste methode is elutie door middel van diffusie. Dit is gebaseerd op de beweging van molecules van een gebied van hogere concentratie aan één van een lagere concentratie. Het resultaat van diffusie is een geleidelijke menging van materiaal. Deze methode is tijdrovend, maar het vereist niet te veel arbeid of apparatuur. Fundamenteel, wordt de polyacrylamideband die oligonucleotide van belang bevat in kleine stukken gesneden en met elutionbuffer behandeld. Na incubatie wordt DNA gezuiverd uit het supernatant door ethanolprecipitatie. De opbrengst is beperkt, tussen 20% en 70%, afhankelijk van de lengte van oligonucleotide. Hoe groter de hoeveelheid gebruikte elutiebuffer, des te oligonucleotide wordt verspreid van het gel.
de tweede methode is electroelutie in een dialysezak (McDonell et al., 1977). Het gelstuk dat oligonucleotide bevat, wordt uitgesneden en met een buffer in een dialysezak geplaatst. De toepassing van een elektrische stroom veroorzaakt DNA om uit het gel in de buffer van de dialysezak te migreren. Oligonucleotide wordt hersteld van deze buffer en gezuiverd. Gebruikend deze methode, kan oligonucleotide met een goede opbrengst worden geà soleerd, hoewel het tijdrovend is als een groot aantal steekproeven tegelijkertijd worden gezuiverd, omdat het de toevoeging van elke gelband in individuele dialysezakken vereist. Deze methode werkt ook goed voor grotere fragmenten van DNA en kan zelfs worden gebruikt om DNA uit agarose-gels te halen.