Presynaptisk hyperpolarisering induserer en rask analog modulering av spike-fremkalt overføring mediert av aksonal natriumkanaler

Hyperpolarisering-indusert AD tilrettelegging

vi først målt forekomsten av kort hyperpolarisering av presynaptisk celle på synaptisk overføring. Par monosynaptisk tilkoblede CA3-nevroner ble registrert i organotypiske kulturer av rotthippocampus etter 8-10 dager in vitro (DIV)21. En 200 ms hyperpolariserende pre-puls levert før presynaptisk spike ble funnet å øke synaptisk styrke med ∼20% (Fig. 1a). Denne økningen ble observert ved måling av enten amplitude eller ladning av postsynaptisk respons (Supplerende Fig. 1). I disse forsøkene var det presynaptiske hvilepotensialet -74±3 mV (n=10). H-ADF var sammenlignbar når presynaptisk hyperpolarisering utgjorde -84 eller -102 mV (henholdsvis 124±8% versus 119±5%, n=10; Wilcoxon test P> 0.1), noe som tyder på at en presynaptisk hyperpolarisering av ∼10 mV er tilstrekkelig til å oppnå mettende h-ADF. h-ADF var assosiert med et redusert par-puls-forhold (PPR, fra 99±7 til 88±5%, n=12; Wilcoxon test p< 0,05; Supplerende Fig. 1), noe som indikerer at det skyldes en presynaptisk økning i glutamatfrigivelse.

en 200 ms lang hyperpolarisering er usannsynlig å forekomme i en fysiologisk sammenheng. Derfor undersøkte vi tiden for h-ADF for kortere hyperpolariseringer (15, 50, 100 og 200 ms). h-ADF ble observert for alle testede hyperpolariseringsvarigheter (15 ms: 111±3%, 50 ms: 116±4%, 100 ms: 109±4%, 200 ms: 120±6% Wilcoxon, P<0,05 for alle varigheter, n=7, Fig. 1b). Ifølge dette resultatet vil h-ADF sannsynligvis bli indusert ved fysiologisk hyperpolarisering.CA3 pyramidale nevroner uttrykker depolariseringsindusert ad-tilrettelegging (D-ADF) som skyldes langsom inaktivering Av Kv1. 1 kanaler (tidskonstant: 3.3 s)13. Vi undersøkte således om både d – og h-ADF ble uttrykt ved DE SAMME CA3-CA3-tilkoblingene. Presynaptisk APs ble utløst alternativt fra hvilemembranpotensial (-78 mV-kontroll), etter en lang subthreshold depolarisering (10 s, -62.6 mV, d-ADF), etter en kort hyperpolarisering (200 ms, -96.1 mV, h-ADF) eller etter kombinasjonen av en lang depolarisering og en kort hyperpolarisering (D – og h-ADF; Fig. 1c, venstre). Faktisk er kombinasjonen av DE to formene FOR ADF produsert, i de samme forbindelser, en større tilrettelegging (113±3%, n=16; Fig. 1c) enn det som produseres separat ved hver protokoll (d-ADF alene: 105±3%, n=16, h-adf alene: 108±4%, n = 11; Fig. 1c). Spesielt ble gjennomsnittlig h – og d-ADF funnet å summere lineært, noe som tyder på to uavhengige molekylære mekanismer. Videre ble d – og h-ADF målt i de samme parene positivt korrelert (Supplerende Fig. 1), noe som tyder på at noen synaptiske tilkoblinger er mer utsatt FOR ad-tilrettelegging, sannsynligvis fordi analog signalutbredelse langs axonen avhenger av avstanden mellom soma og presynaptiske terminaler. Disse dataene viser at h – og d-ADF sameksisterer I ca3 pyramidale nevroner, og at de underliggende mekanismene sannsynligvis vil være uavhengige.

h-ADF ble observert hos unge CA3-nevroner (DIV8–10 fremstilt Fra p5–P7-rotter), og dermed kunne det hovedsakelig skyldes lav tetthet eller umodne egenskaper av spenningsstyrte ionekanaler. Vi bestemte derfor om h-ADF også ble funnet i modne ca3 pyramidale celler. Paired opptak av tilkoblede CA3 nevroner ble oppnådd I DIV24-DIV32 skive kulturer. Kort presynaptisk hyperpolarisering (200 ms) økte synaptisk styrke betydelig (104.2±1.1% n = 25; Wilcoxon,P < 0.01; Supplerende Fig. 2). h-ADF målt i modne celler var mindre enn det som ble målt i utviklende nevroner (Mann–Whitney, P < 0,01; Supplerende Fig. 2). Vi konkluderer derfor med at h-ADF er utviklingsmessig regulert I CA3-nevroner in vitro.

alle opptak ble oppnådd med høyt ekstracellulært kalsium (3 mM) for å optimalisere synaptisk styrke. Under disse forholdene er presynaptisk frigivelsessannsynlighet høy, og presynaptisk tilrettelegging som H-ADF kan undervurderes. Vi målte derfor h-ADF i modne CA3-nevroner (DIV24–DIV32) registrert med fysiologisk ekstracellulært kalsium (1,3 mM)22. Under disse forholdene ble h-ADF funnet å være rundt +16.4% (Wilcoxon,P < 0.01; Supplerende Fig. 2). Vi konkluderer med at h-ADF er robust uttrykt i modne nevroner registrert i fysiologisk ekstracellulært kalsium.

h-ADF induseres av simulerte IPSPs og oscillasjoner

for å undersøke h-ADFS rolle under nær fysiologiske forhold ble EN GABAA-lignende konduktans introdusert i presynaptisk nevron ved hjelp av dynamisk klemme (Fig . 2a, venstre). I samsvar med resultatene illustrert I Fig. 1, aps foran injeksjonen av EN IPSC-lignende strøm ga en større respons i det postsynaptiske nevronet sammenlignet med APs utløst fra hvilemembranpotensial (Wilcoxon P<0,001, n=11). I samsvar med en presynaptisk økning i glutamatfrigivelse ble PPR redusert når Simulert Gabaergisk IPSPs gikk foran APs (fra 121% i kontroll til 96%; Wilcoxon P < 0,05, n = 7; data ikke vist). Interessant nok ble størrelsen på den synaptiske potensieringen funnet å være avhengig av størrelsen på den simulerte IPSP (R2=0.39, P <0.05), noe som indikerer at h-ADF er gradert mellom hvilemembranpotensialet (-74 mV) og 10-mV hyperpolarisering (-84 mV; Fig. 2a, høyre). Faktisk ble tilretteleggingsfaktoren i dette området funnet å være 1.8% per mV av hyperpolarisering.

Vi undersøkte deretter moduleringen av synaptisk styrke under presynaptisk membranpotensialoscillasjon. Oscillasjon av det presynaptiske membranpotensialet ved 4 Hz ble produsert ved å injisere sinusformet strøm, og enkle presynaptiske pigger ble fremkalt i forskjellige faser av svingningen. I samsvar med tidligere resultater ble h-ADF observert når cellen sparket under hyperpolariserende faser av oscillasjonen (0 ms: 124,3±7%, 250 ms: 122±7%, Wilcoxon p<0,05, n=8; Fig. 2b). I andre faser er den synaptiske styrken uendret (56 ms: 112.2±6%, 163 ms: 95.8±5%, 211 ms: 110.5±6%, Wilcoxon p>0.1, n=8). Spesielt observeres ingen d-ADF med depolariseringen fordi varigheten er for kort Til Å inaktivere Kv1. 1-kanaler13. Vi konkluderer med at oscillasjoner i θ-området induserer h-ADF I CA3-nevroner.

h-ADF er assosiert med en økning i aksonal spike amplitude

Neste undersøkte vi mekanismene bak h-ADF. En mulig mekanisme for H-ADF er en modulering av presynaptisk spike amplitude indusert av hyperpolarisering. Vi undersøkte derfor konsekvensen av hyperpolarisering på spike amplitude målt i axon. CA3-nevroner ble fylt Med Alexa 488 (50 µ) for å visualisere axon-arboriseringen, og celletilkoblede opptak ble hentet fra axonen på avstander mellom 60 og 240 µ (Fig. 3a). Ved somatisk hyperpolarisering ble amplituden til aksonalspissen forbedret (106±1% av kontrollamplituden, n = 6, Wilcoxon, p<0,05; Fig. 3b). Imidlertid ble størrelsen på aksonal spike-tilrettelegging funnet å synke med aksonal avstand med en romkonstant på 212 µ (Fig. 3b). Som konklusjon er h-ADF I CA3-nevroner forbundet med en lokal økning i spike amplitude i axonen.

mens hele celleopptak FRA CA3 axoner er ekstremt vanskelig i organotypiske kulturer, kan den oppnås I l5 pyramidale nevroner fra akutte skiver5, 6. Derfor målte vi først om h-ADF også kunne observeres Ved l5-L5 eksitatoriske forbindelser. Par monosynaptisk tilkoblede l5 pyramidale nevroner ble registrert i akutte skiver fra sensori-motor cortex av unge rotter (P14–P20). Kort hyperpolarisering i soma (200 ms, 10-15 mV) av presynaptisk neuron ble funnet å forbedre synaptisk styrke (109,6±2,3%, n=13, Wilcoxon test, P<0,05; Fig. 4a).

for å bekrefte at H-ADF i l5 pyramidale nevroner var assosiert med aksonal spike amplitude økning, ble det oppnådd samtidige helcelleopptak fra soma og cut-end axons (blebs) (50-80 µ fra soma) I L5 pyramidale nevroner. Transient hyperpolarisering av soma (ca. -13 mV) forbedret amplituden til spike overshoot i axon, men ikke i soma (+5.5±1.5 versus -0.3±1.1 mV, n=5, Mann-Whitney, P<0.05; Fig. 4b). Depolariseringshastigheten ble også utvidet (fra 251±59 til 289±56 mV ms−1, n=5), og piggterskelen ble hyperpolarisert (fra -35.7±5.2 til -38.8±4.3 mV, n=5). Vi konkluderer med at h-ADF i BÅDE ca3 og L5 pyramidale celler er forbundet med økningen i spike amplitude målt i axon.

h-ADF er assosiert med forbedrede aksonale kalsiumsignaler

Vi brukte Deretter Ca2 + imaging for å bestemme konsekvensen av hyperpolariseringsindusert forbedring av spike amplitude i axonen. Ca3 pyramidale nevroner ble fylt med 50µ Alexa-594; 250 µ Fluo-4 og spike-fremkalte kalsiumsignaler ble målt i antatte en passant boutoner ved avstander mellom 150 og 250 µ fra soma (Fig. 5a). Integralet Av den spike-fremkalte Ca2+ forbigående ble økt når den presynaptiske spike ble fremkalt etter en forbigående hyperpolarisering av ∼20 mV(126±10%, n=5; Fig. 5b). Vi konkluderer med at presynaptisk hyperpolarisering under h-ADF øker både presynaptisk spike amplitude og spike-indusert Ca2+ tilstrømning, som senere forbedrer glutamatfrigivelse.

Nav-kanalinaktivering i axonen bestemmer h-ADF

den økte amplitude av aksonal spike under hyperpolarisering kan skyldes gjenoppretting Av Nav-kanaler fra inaktivering. For å bekrefte rollen som natriumkanalinaktivering i h-ADF brukte vi EN NEURONMODELL av to monosynaptisk tilkoblede CA3-nevroner. Vi bestemte deretter forekomsten av modifisering av inaktivering av natriumkanaler i axonen på h-ADF. Når halvinaktivering av aksonale natriumkanaler ble satt til -80 mV (refs 18, 19), økte somatisk hyperpolarisering spike amplitude, ladningen av spike-fremkalt kalsiumstrøm og synaptisk overføring (Fig. 6a, venstre). Dette skyldes gjenoppretting Av Nav-kanaler fra inaktivering ved hyperpolarisering(Fig. 6b, venstre). Det oppstod imidlertid ingen endring dersom halvinaktivering av de aksonale natriumkanalene ble satt til -70 mV (Fig. 6a, høyre). I dette sistnevnte tilfellet er andelen Tilgjengelige Nav-kanaler allerede svært høy ved hvilemembranpotensial, og produserer EN AP med full amplitude(Fig. 6a, b, høyre). Derfor påvirker utvinningen fra inaktivering ikke den presynaptiske spike amplitude ytterligere. Således, h-ADF i modellen er på grunn av gjenvinning Av Nav kanaler fra inaktivering og økes ved hyperpolarisering Nav halv-inaktivering (Fig. 6c).

Videre brukte Vi VÅR NEURON modell for å simulere aksonal Nav-kanal tilgjengelighet under en theta oscillasjon lik den som brukes I Fig. 2b. Nav kanaler ble funnet å inaktivere under depolarisering og gjenopprette under hyperpolarisering, forklarer EPSC modulering under svingning (Supplerende Fig. 4). Imidlertid er inaktivering raskere enn utvinning under oscillasjonen på grunn Av den langsommere Nav-kinetikken ved depolariserte potensialer (Supplerende Fig. 4). Dette forklarer hvorfor Epscene produsert ved 163 ms ikke presenterte noen h-ADF, selv om spissen slippes ut fra et litt hyperpolarisert potensial (Fig. 2b). Faktisk, på dette punktet av svingning Nav kanaler ikke har nok tid til å gjenopprette fra inaktivering(Supplerende Fig. 4).

Til Sammen støtter disse resultatene det faktum at h-ADF skyldes gjenoppretting Av Nav-kanaler fra inaktivering.

Nav rende tetthet bestemmer styrken av h-ADF

h-ADF avhenger av tilgjengeligheten av natriumkanaler i axonen. Dermed bør reduksjon av tettheten Av Nav-kanaler påvirke h-ADF. Faktisk viste vår modell at reduksjon Av Nav rende tetthet til 70% av kontrolltilstanden forbedret h-ADF fra 130 til 180% (Fig. 7a). Den kritiske parameteren her var gevinsten av presynaptisk spike overshoot som avhenger av aktiverbar Na konduktans(Fig. 7b). Under kontrolltilstand var denne verdien allerede høy, og hyperpolarisering av det presynaptiske elementet fra -78 til -93 mV økte amplitude av spissen med 28%. Når tettheten Av Nav ble redusert, økte den samme hyperpolariseringen amplituden til den presynaptiske AP med 42%.

Vi bekreftet neste eksperimentelt at reduksjon Av Nav rende tetthet okte h-ADF i CA3-nevroner. Vi blokkerte derfor delvis Nav-kanaler med lav konsentrasjon av tetrodotoksin (TTX) påført i badet (15-25 nM). VED denne konsentrasjonen BLOKKERER ttx ∼80% Av Na + strømmen, men opprettholder induksjon av rask Na+ spikes24,25. I NÆRVÆR AV TTX ble piggamplituden i soma redusert med 45±4% (n = 9) og synaptisk overføring ved CA3–CA3-tilkoblinger ble redusert med 55±8% (n=9; Supplerende Fig. 5). Viktigst, å redusere andelen aktiverbare Nav-kanaler med 15-25 nM TTX ble funnet å forbedre h-ADF i modne nevroner som ikke uttrykker h-ADF (fra 103±3% i kontroll til 121±4% i nærvær AV TTX, n = 6, Wilcoxon p<0.05; Fig. 7c, d). Disse dataene bekrefter derfor at h-ADF I CA3-nevroner avhenger av tilgjengeligheten Av Nav-kanaler.

t-Type Ca2+ kanaler er til stede i axonen. De kan aktiveres under hyperpolariserings-depolariseringssekvensen som brukes til å indusere h-ADF og dermed kan utgjøre h-ADF. Det ble imidlertid funnet at h-ADF forblir stabil i nærvær av 100 nM mibefradil, en t-type kanalblokker (fra 112,2±1,1% i kontroll til 116,2±11,9% med mibefradil, n=3; data ikke vist), noe som tyder på At T-Type Ca2+ kanaler ikke deltar i h-ADF.

h-ADF fremmer nettverkssynkronisering

Vi testet neste implikasjon av h-ADF i nettverkssynkronisering ved hjelp av en hippocampal nettverksmodell dannet av 80 pyramidallignende eksitatoriske celler (e-celler) og 20 interneuronlignende hemmende celler (i-celler) sammenkoblet (Fig. 8a; Se Metoder). e-og i-celler ble matet av stokastisk inngang. Nettverket av e-celler ble synkronisert, og svingninger i gammaområdet dukket opp som synaptisk styrke mellom e-celler økte (Supplerende Fig. 6). Disse oscillasjonene ble drevet av i-celler: aktivering av e-celler ble funnet å fremme aktiveringen av i-celler, som igjen tyste hele nettverket (Supplerende Fig. 6). Siden h-ADF øker interpyramidal synaptisk styrke når presynaptisk pigg innledes med EN IPSP, er h-ADF en god kandidat til å fremme disse i-celle-drevne svingninger.

h-ADF-regelen ble innlemmet i nettverket ved å øke synaptisk styrke mellom e-celler i henhold til membranpotensialet målt 17 ms før spissen. Faktisk ble synaptisk styrke økt med 20% hvis presynaptisk potensial var under -84 mV(Fig. 8b). Denne regelen ble direkte avledet fra verdier målt eksperimentelt (se Fig 1a og 2a). For en e-celle-synaptisk styrke på 2,8 mS, økte h-ADF i nettverket markant både avfyringsfrekvensen og synkroniseringen over e-celler (Fig . 8c-e). Faktisk ble tilbøyelighet til å svinge i gammaområdet lettere hvis h-ADF mellom e-celler var effektiv(Fig. 8e). Interessant, i et nettverk med shunting-inhibering (ECl=-73 mV i stedet for -80 mV i kontrolltilstand), forbedret h-ADF-regelen ikke synkronisering og fremmet ikke gamma-svingninger (Supplerende Fig. 6). Men da h-ADF øker synaptisk styrke mellom e-celler, kan synkroniseringseffekten ganske enkelt skyldes økningen i spike-hastigheten til nettverket. For å øke pigghastigheten uten å påvirke synaptisk styrke, bestemte vi oss for å fikse inter-e-cellestyrken ved 2,5 mS og øke den eksterne drivfrekvensen til e-celler fra 6 til 20 Hz. Vi plottet synkroniseringskoeffisienten versus spike rate av nettverket. Selv om synkroniseringen viste seg å være lineært korrelert med piggrate, økte h-ADF synkroniseringskoeffisienten for en gitt piggrate i 4-14 Hz-området (Supplerende Fig. 6). Dette viste at for lav piggrate øker h-ADF synkroniseringen uavhengig av gjennomsnittlig nettverksaktivitet. Til slutt, i vår modell, øker h-ADF nettverkssynkronisering og fremmer svingninger ved å knytte interpyramidal synaptisk styrke med aktivitet av interneuroner.