1 Teori
Oligonukleotider syntetiseres ved tilsetning av en base om gangen, som strekker seg fra 3′ til 5′-enden, festet til en fastfasestøtte. Når den kjemiske syntesen av oligonukleotid er fullført, frigjøres DNA-kjeden fra den faste støtten ved inkubasjon med ammoniumhydroksyd. Ammonium virker også som et deprotektivt middel, som spalter av gruppene som beskytter fosfatene i fosfodiesterbindingene. Etter dette tilsettes varm ammoniakk for å hydrolysere beskyttelsesgruppene fra de eksocykliske aminogruppene av deoksyadenosin, deoksycytosin og deoksyguanosin. Oligonukleotid kan leveres til brukeren i ammoniakkoppløsningen som et råpreparat. I dette tilfellet, før bruk, kan det være nødvendig å utføre et ekstra trinn for å fjerne salter og biprodukter fra oligonukleotidpreparatet generert under deproteksjon.
etter deproteksjon blir oligonukleotidpreparatet vanligvis desaltet, kvantifisert, fordampet til tørrhet i en lyofilisator og tilført brukeren i form av et pulver. Den avsaltede oligonukleotidløsningen inneholder oligonukleotid i full lengde, men inneholder også en blanding av avkortede produkter som ble akkumulert under kjemisk syntese. Avkorting oppstår når den angitte basen ikke legger til kjeden i den tilsvarende syklusen (Hecker & Rill, 1998). Således bestemmes prosentandelen av avkortede produkter akkumulert i preparatet av synteseeffektiviteten (fraksjonen av full lengdeprodukt etter syntese) og lengden av molekylet. Lange oligonukleotider, som krever flere sykluser som skal syntetiseres, er mindre rene enn korte oligonukleotider. Disse feilene kan konkurrere med full lengde produktet i enkelte programmer og kan trenge fjerning før oligonukleotid kan brukes. Imidlertid er avsaltede oligonukleotidpreparater vanligvis egnet for mange applikasjoner, for eksempel standard PCR eller mikroarrays, spesielt hvis oligonukleotid er < 20 nukleotider i lengde.
Ytterligere rensing for oligonukleotider lengre enn 50 baser anbefales fordi prosentandelen av full lengde produkt i preparatet er vanligvis ikke høyere enn 80%. For krevende applikasjoner der den nøyaktige lengden av oligonukleotid er viktig, for eksempel gel-skift analyser, sted-rettet mutagenese, sekvensering, produksjon av kloning adaptere, eller første-tråd cDNA syntese for generering av biblioteker, er ytterligere rensing anbefales, selv for kortere oligonukleotider (se mer informasjon om teknikkene ovenfor På Standard in vitro Analyser For Protein-Nukleinsyre Interaksjoner – Gel skift Analyser FOR RNA OG DNA-Binding og Sted-Rettet Mutagenese).
Rensing kan være nødvendig etter syntese eller etter enzymatisk modifikasjon av oligonukleotid. Det finnes flere metoder for å oppnå dette, og valget avhenger av arten av oligonukleotid og søknaden som den er beregnet på.
Omvendt fase hplc rensing er basert på hydrofobicitet. Den bruker en ikke-polar stasjonær fase, og vandige buffere og organiske løsningsmidler som mobilfasen for å eluere analyttene; polare forbindelser elueres først, mens ikke-polare forbindelser beholdes. Dette er den beste metoden for rensing av oligonukleotider modifisert med en hydrofob gruppe, for eksempel biotin, fluorescerende fargestoffetiketter eller nhs-esterkonjugasjoner. Massegjenvinningen er høyere enn VED BRUK AV SIDERENSING, og den er egnet til rensing av større mengder oligonukleotider( mmolskala), selv om den ikke fjerner ufullstendige produkter så effektivt. Oligonukleotidrensingspatroner, basert på revers-fase kromatografi, gir en rask metode for avsaltning og rensing av oligonukleotider.Polyakrylamid gel elektroforese (PAGE) løser oligonukleotider i henhold til deres lengde og gir dermed nok oppløsning til å skille full lengde produkter fra mislykkede molekyler (Atkinson og Smith, 1984). Polyakrylamidgeler er mer effektive for å separere SMÅ fragmenter AV DNA enn agarosegeler (Se Analyse AV RNA ved analytisk polyakrylamidgelelektroforese og Agarosegelelektroforese). Den eneste ulempen med polyakrylamidgeler er at de er vanskeligere å forberede og håndtere enn agarosegeler. Polyakrylamidgeler kjøres i vertikal konfigurasjon i et konstant elektrisk felt. Etter elektroforese elueres oligonukleotid fra gelen og konsentreres ved bruk av etanolutfelling (finn mer om utfelling av nukleinsyrer på rna – rensemetoder) eller omvendt fasekromatografi. Dette er den valgte metoden når den høyeste prosentandelen av oligonukleotider i full lengde er ønsket for krevende applikasjoner. Det anbefales også sterkt for oligonukleotider som er lengre enn 30 baser. Også flere prøver kan kjøres samtidig, og det kreves ikke dyrt utstyr. Den eneste ulempen ved denne teknikken er den lille mengden oligonukleotid oppnådd per rensing. Vanligvis brukes oligonukleotider i skalaen 1 µ eller mindre, og massegjenvinningen etter SIDERENSING er < 50% og enda lavere ved modifiserte oligonukleotider. Likevel, selv om utbyttet er lavt, er det tilfredsstillende for de fleste biokjemiske applikasjoner.
oligonukleotidpreparatet lastes på en denaturerende polyakrylamidgel i en mengde på minst 1 mg per kjørefelt. Utvalget av oppløsning av gelen avhenger av konsentrasjonen av polyakrylamid. For korte oligonukleotider (fra 15 til 35 baser) anbefales 13-15% polyakrylamidgeler; for lengre oligonukleotider (fra 35 til 70 baser) anbefales 8-13% polyakrylamidgeler. Prosentandelen av gelen skal tilpasses løpesystemet. Vi bruker Vanligvis Bio-Rad Mini Protean II-systemet og kjører 15% geler for å rense oligonukleotider på 25 baser i lengde. Etter identifisering av det riktige båndet VED UV-visualisering, blir båndet skåret ut og ekstrahert fra gelen.
To forskjellige metoder for rensing av oligonukleotider fra polyakrylamidgeler er beskrevet i dette kapitlet. Den enkleste metoden er eluering ved hjelp av diffusjon. Dette er basert på bevegelse av molekyler fra en region med høyere konsentrasjon til en lavere konsentrasjon. Resultatet av diffusjon er en gradvis blanding av materiale. Denne metoden er tidkrevende, men det krever ikke for mye arbeid eller utstyr. I utgangspunktet er polyakrylamidbåndet som inneholder oligonukleotid av interesse skåret i små stykker og dekket med elueringsbuffer. ETTER inkubasjon renses DNA fra supernatanten ved etanolutfelling. Utbyttet er begrenset, mellom 20% og 70%, avhengig av lengden av oligonukleotid. Jo større mengden elueringsbuffer som brukes, jo mer oligonukleotid diffunderes fra gelen.
den andre metoden er elektroelusjon i en dialysepose (McDonell et al., 1977). Gelstykket som inneholder oligonukleotid, blir skåret ut og plassert i en dialysepose med en buffer. Påføringen av en elektrisk strøm får DNA til å migrere ut av gelen inn i dialyseposebufferen. Oligonukleotid utvinnes fra denne bufferen og renses. Ved hjelp av denne metoden kan oligonukleotid isoleres med godt utbytte, selv om det er tidkrevende hvis et stort antall prøver renses samtidig, fordi det krever innføring av hvert gelbånd i individuelle dialyseposer. Denne metoden fungerer også godt for STØRRE DNA-fragmenter og kan til og med brukes TIL å trekke UT DNA fra agarosegeler.