For å utnytte kraften i målrettede homing endonukleaser, Arbeidet Jerome lab for å optimalisere et nyttig leveringssystem for både in vivo og in vitro studier. De brukte et adeno-assosiert virus (AAV) leveringssystem for å målrette musens trigeminale ganglier med en av to HSV-spesifikke endonukleaser: HSV1m5, som er designet for å spalte virionproteinet VP5-genet, Og HS1m8 ,som retter seg mot genet som koder FOR DNA-polymerasekatalytisk underenhet. Å skape mutasjoner i noen av disse genene forårsaker forstyrrelse av virusgenomet og forhindrer virionproduksjon. For ytterligere å øke effekten Av behandlingen Trex-2, ble en 3′ -5 ‘ endonuklease, som har vist seg å øke rettet mutagenese, samtidig transdusert. Etter å ha etablert systemet, startet laboratoriet in vitro-arbeid med fokus på nevroner, den biologisk relevante celletypen. Kulturer av nevroner ble co-transdusert Med HSV1m5 eller 8 Og Trex-2 og deretter infisert MED HSV. Behandlede kulturer viste en 50% reduksjon i viral titer samt tilstedeværelse av mutasjoner I HSV Ved t7 Endonuklease 1-analysen og klonal sekvensering. Når forstyrrelse av lytisk infeksjon ble etablert, begynte forskerne å se på effekter på de ulike stadiene AV HSV-infeksjon. Ved å bruke infiserte kulturer av nevroner MED HSV og påfølgende behandlet Med HSV1m5 eller 8 Med Trex-2 på forskjellige tidspunkter, kunne forskerne simulere de ulike stadiene av infeksjon. De behandlet kulturer på 7 dager (akuttfase), 14 dager (sen akutt/ tidlig latentfase) og 32 dager (latentfase) og fant ingen endring i effekt uavhengig av viral fase. Dette antyder at HSV er like utsatt for endonuklease mutagenese uavhengig av viral fase. Nivåene av mutasjoner på målstedet varierte fra 4,5-7,6% og 1,1-6,6% for Henholdsvis hsv1m5 og HSV1m8. For tiden er dette den første studien som ser på endonukleaseaktivitet i latent infiserte nevroner.Oppmuntret av in vitro-resultatene utførte forskerne in vivo-studier med mus infisert MED HSV etterfulgt 32 dager senere av aav (uttrykker HSV1m5 eller 8 og Trex-2) injeksjon. Neuroner fra musene ble samplet 30 dager etter aav-injeksjon for viral titer, virusmengde og HSV-genommutasjoner. Gruppen viste 1-2% mutasjoner i 2/4 mus For HSV1m5 og i 3/4 mus For HSV1m8. Virusmengden til disse dyrene var imidlertid lik mellom kontroll-og behandlede dyr. Virusutskillelse ble forsinket med en dag hos behandlede dyr, men nådde lignende nivåer over tid sammenlignet med ubehandlet. Ved å reflektere over resultatene Sa Dr. Jerome: «dette er første gang en faktisk latent virusinfeksjon er blitt etablert i et dyr, og deretter deaktivert, selv delvis, ved hjelp av endonukleasebehandling. Så det representerer et kritisk skritt mot å bringe slike terapier til menneskelig bruk. Hovedutfordringen nå er å øke styrken av terapien, slik at alt eller nesten alt latent virus er genetisk deaktivert. Vi undersøker nyere, mer effektive nukleaser som CRISPR/Cas, og evaluerer nye metoder for å levere nukleasene til infiserte nevroner in vivo.»I fremtiden kan denne terapien føre til en ny måte å tenke på å behandle latente sykdommer som HSV og HIV som vi for tiden ser på som uhelbredelig.Finansiering for denne forskningen ble gitt Av National Institutes Of Health og Canadian Foundation.
Aubert M,Madden EA,Loprieno M,DeSilva Feeixge HS,Stensland L,Huang ML,Greninger AL,Roychoudhury P,Niyonzima N,Nguyen T,Magaret A,Galleto R,Stein D,Jerome KR. 2016. In vivo forstyrrelse av latent HSV ved designer endonukleasebehandling. JCI Innsikt, 1 (14).