과목
한,건강한 저항을 훈련한 남성(22.1±5.0yrs,180±0.1cm,86.1±13.0kg,18.1±6.4%body fat) 을 통보했다의 연구 프로토콜 승인 기관 검토 위원회에 의해 베일러 대학에서 이전에 참여합니다. 훈련 상태는 자체보고되었으며,연구 전에 적어도 1 년의 경험이 부족한 개인은 제외되었습니다. 또한,과목은 제외되었던 경우:1)어떤 기록의 신진대사,고혈압,간신,근골격계,면역,또는 신경학적 질병이다;2)는 현재 갑상선,antihyperlipidemic,혈당,고혈압,또는겐 약물;및 3)촬영했고 영양 보충교재에 영향을 미칠 수 있는 근육량 및/또는 신진대사/이화에서 호르몬의 세월의 시작을 연구하는 학문이다.
기준 테스트
자격 과목은 익숙해 연구 프로토콜을 통해 구두 및 서면 설명 연구의 디자인이다. 과목에 서명한 동의 성명 및 완료된 개인하고 의학의 역사는 동안 또한을 완료하는 윈게이트 바이 윈 혐기성능 테스트 전 기준을 테스트합니다. 과목은 지시을 자제하는 격렬한 운동에서 48 시간과 빠른 대한 10 시간 전에 초기 테스트(예,0)발생하는 3~4 일 다음과 같은 익숙해를 허용하는 기록을 위한 식품의 섭취. 이 연구는 고용된 이중 맹검,위약 대조,평행한 디자인을 공부하여 과목은 균등하게 일치하는 클러스터로 연령에 따라 몸과 질량.
험 프로토콜
일 동안 0,25,50 각 주제 보고하는 실험실후 10 시간 빠르다. 높이를 측정하였을 사용하여 표시하고 몸 전체의 질량 측정을 사용하여 측정 Healthometer 디지털 스트레인 게이지를 전자 가늠자(Bridgeview,IL)의 정밀도는±0.02kg. 그런 다음 보정 된 Hologic Discovery W dual-energy x-ray absorptiometer(Dxa)장치(Hologic Inc.)를 사용하여 신체 조성을 결정 하였다.,Bedford,MA),혈압과 휴식 심박수는 표준 절차를 사용하여 결정되었습니다. 주제는 다음 기증한 약 25ml 의 금식을 이용하여 혈액 표준 venipuncture 기술에 대한 혈액,임상 화학 위원회 및 나중에 cytokine 및 호르몬 분석합니다. 두 10ml 혈청 분리 vacutainer 관 및 중 하나 5ml K3EDTA vacutainer 튜브 삽입 된 vacutainer 홀더를 위한 혈액 컬렉션을 연속해서 사용하는 여러 개의 샘플을 정 기술입니다. 전체 혈액 즉시는 분석에 대한 전체 혈액 수 있는 동안 혈청 vacutainer 관 원심 분리하여 실온에서 15 분에서 1,500g,혈청을 쏟고 있었으로 전송 microcentrifuge 튜브,그리고 청 샘플 저장되었 -20°C 에 대한 후속 호르몬 및 대사 산물을 분석한다. 0 일과 50 일에만 피험자는 Bergstrom 생검 기술을 사용하여 vastus lateralis 에서 약 60mg 의 골격근을 기증했습니다. 벤치 프레스와 35°힙 썰매 기계(Nebula,Versailles,OH)를 사용한 표준 1RM 테스트 절차를 사용하여 상체 및 하체 강도를 평가했습니다. 시험 재 시험의 신뢰도 이러한 강도 테스트에서 저항은 훈련 과목에서 우리의 실험실에 나왔는 높은 신뢰성에 대한 벤치 프레스(r=0.94)및 다리를 눌러(r=0.91). 후에 결정의는 엉덩이 썰매 1RM,휴식 과목은 10 분을 완료하기 전에 30 초 동안 윈게이트 바이 윈 혐기성능 테스트에서는 전산화 주기 측(주 엑스칼리버,광맥,흐로닝언,네덜란드)평가 하체 혐기성에 힘입니다. 이 테스트로 구성되는 각 주체 스프린트에서 모두 패션에서 자전거 측 30 초 동안에 대한 표준 작업의 0.075kg·kg-1 의 체중이다. 신뢰성 테스트 재 시험에 대한 절대 피크 전력과 전원을 의미에서 우리의 실험실이 나왔고 또한 신뢰성 높은 값(r=0.69r=0.또한,이 경우,이 경우,이 경우,이 경우,이 경우,이 경우,이 경우,이 경우,이 경우,이 경우,이 경우,이 경우,이 경우,이 경우,이 경우,이 경우,이 경우,이 경우,이 경우,
경피적인 근육 생 검
근육 생검을 찍은 일에 0~50 하기 전에 모든 강도 테스트를 피하 잠재적인 근원섬유의 중단으로 인해 운동입니다. 피험자들은 각 근육 생검 48 시간 전에 운동을 삼가도록 지시 받았다. 근육에서 추출되는 측면의 부분리 lateralis 사 슬개골과 장골의 지배적인 다리를 사용하여 5mm 검과 바늘을 적용되는 흡입. 간단히,1.5ml 의 1.작은 파일럿 절개를하기 전에 0%리도카인 HCl 을 피하 주사 하였다. 를 사용하여 두 번 들어온 절차와 적용되는 흡착,시편을 처음 보이는 모든 지방 및 결합조직을 제거하기 전에는 플래시 냉동에서는 액체 질소입니다. 모든 샘플은 이후 분석 될 때까지 -80°c 에서 연속적으로 저장되었다.
보충 프로토콜 및 규정식 모니터링
에는 패션,과목을 섭취 네 250mg 캡슐이 포함된 옥수수 기름 또는 위약 AA(X-Factor,영양 분자,Jupiter,FL)에 있는 50 일 동안 다음 기준을 테스트합니다. 보충제는 캡슐 형태로 제조되었으며 분자 영양에 의해 일반 병에 포장되었습니다. 준수는 보충 25 일 및 50 일 후에 피험자가 빈 보충 병을 반환하도록함으로써 모니터링되었다. 에 따라 이전 지침과를 위한 노력 에너지와 단백질을 섭취했기에 충분을 촉진 근육의 비대,모든 과목은 지시 증가하는 열량을 섭취에 약 500 킬로 칼로리·하루-1 동안 유지는 예상된 단백질을 섭취 2g·kg-1·일-1 경우에 비해 초기 규정식 분석합니다. 체가 제공되는 상업적으로 가능 식사 보충 분말(린체,labrada 은 영양,휴스턴,텍사스)를 포함하는 약 290 의 칼로리를 소모,24g,탄수화물,45g 의 단백질과 1g 의 지방 당사에서는 시도를 수용하는 위에 언급된 에너지 및 단백질 요구 사항입니다. 기준 단백질 섭취량에 따라,피험자는 아침 및/또는 각 운동 직후에 식사 대체 보충제의 1~2 패킷을 섭취하도록 들었다. 또한,과목은 지시를 피해 일반 식품의 소비가 높은 것으로 알려져 있으 ω-3 지방산 물고기를 포함한 기름,아마씨 기름,차가운 물이 물고기,올리브 오일,참기름,땅콩 버터,N-아세틸-시스테인,conjugated linoleic acid,뿐만 아니라 항염증성 약물을 포함하여 아세트아미노펜,이부프로펜,아스피린과 기타 non-steroidal anti-inflammatory drugs. 식이 섭취뿐만 아니라 리놀레산(18:2,ω-6),리놀레산(18:3,ω-3),및 AA 섭취량을 0 일,25 일 및 50 일에 4 일식이 회상으로 모니터링하고 식품 가공기 III 영양 소프트웨어(ESHA Nutrition Research,Salem,OR)를 사용하여 평가 하였다.
성-교육 프로토콜
50 일 동안,주제를 완료했 4 일·주 1 분할-체,선형 시대성-교육 프로그램입니다. 상체 리프트를 포함 벤치 프레스,위도,어깨에 눌러 앉아 행은 어깨를 으쓱,가슴 파리,팔뚝을 곱슬,그리고 삼각 누르면 아래는 하체 리프트를 포함한 다리를 누르,확장,단계 ups,다리의 머리,다리를 확장,발뒤꿈치 제,복 덕 두 번 주당. 피실험자들은 세트 당 들어 올릴 수있는만큼의 무게로 3 세트의 10 반복을 수행했습니다(즉,1rm 의 60-80%). 운동 사이의 휴식 기간은 3 분을 넘지 않았고 세트 사이의 휴식 시간은 2 분을 넘지 않았습니다. 훈련에서 실시하는 대학의 학생 생활 센터,문서화 교육에서는 로그와 떨어져 서명에 의해 지정된 직원들이 규정을 준수하는지 확인하고 모니터링 진행됩니다. 이 프로토콜은 근력,근육 지구력 및 무 지방 질량에서 상당한 이득을 촉진하기위한 선행 연구에서 나타났습니다.
혈청과 전체 혈액 분석
혈청과 전체 혈액 샘플을 평가하는 데 사용되는 임상 안전하는 동안 보충 프로토콜. Serum samples were assayed for comprehensive metabolic panels including glucose, total protein, blood urea nitrogen (BUN), creatinine, BUN/creatinine ratio, uric acid, aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), creatine kinase (CK), lactate dehydrogenase (LDH), gamma-glutamyl transpeptidase (GGT), albumin, globulin, sodium, chloride, calcium, carbon dioxide, total bilirubin, alkaline phosphatase (ALP), triglycerides, cholesterol, HDL and LDL using a Dade Dimension XL clinical chemistry system (Dade Behring Inc., Newark, DE). 전혈구 세포수 빨간을 포함하여 세포수,헤모글로빈 혈소판,의미 셀량,평균 미립자 헤모글로빈,평균 미립자 헤모글로빈 농도,빨간 분포 폭,백혈구 수,호중구,림프구,단핵구,호산구 및 basophils 분석을 통해 cytometry 를 사용하여 세포 DYN1800(Abbott Laboratories,애보트 공원,IL). 이들 분석법을 수행하는 신뢰성(내 및 그 사이)을 시험하기위한 시험은 평균 변동 계수(c V)가 3.0%인 개별 분석법에 대해 2 내지 6%범위였다. 샘플에서 실행 중복된 결과를 확인하는 경우 관치는 외부 제어 값과/또는 임상 규범에 표준 절차에 따라.
이후 청 샘플 나중에 분석을 위한 코티솔(CORT),무료 테스토스테론(fTEST),총 테스토스테론(tTEST),interleukin-6(IL-6),prostaglandin E2(PGE2)와 프로스타글란딘 F2a(PGF2a). Commerical enzyme immunoabsorbent assay 는 PGF2a,PGE2 및 IL-6(Cayman Chemical,Ann Arbor,MI)및 CORT,fTEST 및 test(Diagnostic Systems Laboratories,Webster,TX)의 혈청 농도를 분석하는 데 사용되었습니다. 이러한 EIA 기반 분석법을 수행하는 C V 는 3.0~5.0%범위였다.
총 RNA 분리
총 세포 RNA 는 삼중 시약(Sigma Chemical Co.,세인트 루이스,모). 총 RNA 농도에서 각 샘플이 결정되었 spectrophotometrically 광학 밀도의 260nm(OD260),와 최종 농도를 조정하여 200ng·µl-1 희석하여 원 total RNA 추출물로 DEPC 처리 nuclease-무료 H2O. 이 절차 수익률을 보여왔 un-저 RNA,무료 DNA 및 단백질 등으로 표시 눈에 띄는 28S 및 18S ribosomal RNA 밴드뿐만 아니라,OD260/OD280 비율의 약 2.0. Rna 샘플을 나중에 분석 할 때까지 -80°c 에서 저장 하였다.
역방향 녹음하고 클론 DNA 합성
표준화된 솔루션의 총 세포 RNA 었 역 전사 합성 클론 DNA(cDNA)으로 설명한다. 간단히 말해서,역전사 반응 혼합물을 42°c 에서 40 분 동안 배양하고,85°C 로 5 분 동안 가열 한 다음,cDNA 생성물을 산출하는 얼음 위에서 급속 냉각시켰다. 시작 cDNA 템플릿 농도 표준화 200ng·µl-1 전에 실시간 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)증폭 감지하여 원 cDNA 를 합성하는 제품 spectrophotometrically 파장에서의 260nm 고 희석에서 그들을 nuclease-무료 H2O. 표준화된 cDNA 솔루션 냉동에서 -80°C 때까지 실시간 RT-PCR 을 수행하였다.
RT-PCR
방지 감각과 감각을 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍 건설되었을 사용하여 상업적으로 사용할 수 있 Beacon 디자이너는 소프트웨어(Bio-Rad,헤라클레스,캘리포니아)에서 알려진 mRNA 시퀀스에 게시된 은행 뉴클레오티드 데이터베이스 및 상업적으로 합성(통합되는 DNA 기술,코럴빌,IA). 다음과 같은 5’감각과 3’anti-감 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하였을 격리시키는 세 가지 성인 MHC isoforms(Type I,IIa,그리고 IIx):종류 I MHC mRNA(5’프라이머:기 776-796,3’프라이머:기 1398-1378,GenEMBL AC X06976),유형 IIa MHC mRNA(5’프라이머: 염기 1785-1805,3’프라이머:염기 2440-2420,GenEMBL AC AF111784),유형 IIx MHC mRNA(5’프라이머:염기 1138-1158,3’프라이머:염기 1746-1726,GenEMBL AC AF111785). 이들 프라이머는 유형 I,IIa,IIx MHC 에 대해 각각 141,145 및 148 염기쌍의 단편을 증폭시킨다. β-말라가 사용되었으로 외부 참조 표준에 대한 검출하는 상대에서 변경량의 대상 mRNA 때문에 고려 사항으로 constitutively 객실 정돈 서비스는 유전자,이러한 β-말라 프라이머를 PCR 증폭 조각의 135 기초 쌍이다. Mhc 타입 I,-IIa,및-IIx,및 β-액틴에 대한 4 개의 PCR 반응 각각에 2 백 ng 의 cDNA 를 첨가 하였다. 구체적으로,각각의 PCR 반응은 다음의 혼합물을 함유 하였다:2μl 의 cDNA 템플리트를 12.5μl 의 2×SYBR Green Supermix(Bio-Rad,Hercules,CA),1.5μl 의 sense 및 anti-sense 프라이머 및 7.5μl nuclease-free dH2O]와 함께 첨가 하였다. 각 PCR 반응을 열 사이클러(Bio Rad,Hercules,CA)로 증폭시키고 증폭 서열은 30 초 동안 95°c 에서 변성 단계,30 초 동안 55°c 에서 프라이머 어닐링,60 초 동안 72°c 에서 연장을 포함했다. RT-PCR 은 각 사이클 후에 측정되는 SYBR green fluorophore 로부터 방출 된 형광을 갖는 40 사이클에 걸쳐 수행되었다. 형광의 방출은 PCR 반응 동안 생성 된 이중 가닥 cDNA 에 SYBR 녹색의 통합으로 인해 발생합니다. 모든 CT 가치 평가에서는 선형 부분 확대하고 DNA melting curve 분석 수행한 후에는 증폭 확신하는 단 하나 유전자 제품에서 증폭된 부재의 프라이머-이합체. 모든 mRNA 의 정량화는 β-액틴 발현과 관련하여 발현되었다. CT 값 비율의 비교는 AA 와 PLA 그룹 사이의 기저 유전자 발현의 변화를 비교하기 위해 사용되었다. 완성 된 PCR 반응 혼합물의 25μl aliquots 를 이용한 아가 로스 겔 전기 영동을 1 에서 수행 하였다.1×Tris-Boric acid-EDTA(TBE)완충액을 사용하고 UV transilluminator(Chemi-Doc XRS,Bio-Rad,Hercules,CA)로 조명하여 표적 mRNA 의 양성 증폭을 확인하는 5%아가 로스 겔(데이터는 표시되지 않음). MHC I,IIa 및 IIx 에 대한 C V 는 각각 2.06%,3.18%및 2.73%였다.
총 근육 단백질 정량
총 단백질이 남아서 total RNA isolation 절차에 고립되었으로 이소프로판올,에탄올,그리고 0.3M 염 구아니딘. 근섬유 단백질은 0 으로 분리되었다.1%나트륨 도데 실 설페이트(SDS),단백질 함량이 595nm 의 파장에서 브래드 포드 분석법을 사용하여 분광 광도계를 결정하기 전에. 표준 곡선을 생성되었을 사용하여(r2=0.98,P<0.001)소 serum albumin 표준으로 표현에 상대적인 근육은 젖은 무게. 각 단백질 샘플을 후속 면역 블로팅을 위해 30μl SDS 완충액 당 50μg 의 단백질로 연속적으로 희석시켰다. 근섬유 단백질에 대한 C V 는 2.03%였다.
MHC protein isoform quantitation
각 muscle homogenate 샘플 내의 MHC protein isoforms 의 조성은 Experion Pro260 칩(Bio-Rad,Hercules,CA)을 사용하여 자동화 된 SDS-PAGE 에 의해 결정되었다. 각 샘플의 약 6μl aliquots 를 마이크로 칩상의 각 샘플 웰로 피펫팅 하였다. 각각의 알 수 없는 샘플에서 준비한 4μl 단백질의 희석에서 각 과목(4μl 의 분자량을 사다리),2μl 의 샘플 버퍼 β-mercaptoethanol,84µl 의 이온을 제거한 물. 에 기초 연구 결과의 Gazith 와 동료,세 MHC isoforms 것으로 예상되었 마이그레이션에서 200-210kiloDaulton 영역 내에서 폴리아크릴아미드 겔 상대 분자량 사다리입니다. 젤 디지털 방식으로 시각화에 의해 Experion 소프트웨어(Bio-Rad,헤라클레스,캘리포니아)과 MHC 농도에서 각 샘플을 평가 했을 비교하여 임의의 밀도 각 MHC isoform 임의 밀도의 분자량 마커의 이미 알려진 농도. 단백질 밴드≥10kD 의 C V 는≤1.1%였다.
단백질 immunoblotting
PGF2a(FP)및 PGE2(EP3)수용량을 수행하였 실온에서 추출하여 총 근육 단백질이에서 균질화액과 슬롯 압 50µg 의 전체 단백질에 니트로 막을 사용하여 생물 점 단백질 blotting 시스템(Bio-Rad,헤라클레스,캘리포니아). 의 도말 막을 배양되었으로 차단 솔루션을 위해 1 시간에는 궤도 로커,경사와 막을 배양되었으로 TTBS 워싱 솔루션에 5 분 세의 총 세척한다. 멤브레인을 궤도 로커에서 1 내지 2 시간 동안 4μg·ml-1 로 희석 한 특정 항-FP 수용체 및 항-EP3 수용체 폴리 클로 날 항체(Cayman Chemical,Ann Arbor,MI)로 배양 하였다. 이어서 1 차 항체 용액을 디캔팅하고 막을 총 3 회 세척을 위해 궤도 로커에서 5 분 동안 TTBS 용액으로 세척 하였다. TTBS 세척 용액을 디캔팅하고 막을 궤도 로커에서 1 시간 동안 2 차 바이오 티닐 화 염소 항 토끼 항체 용액(Bio-Rad,Hercules,CA)으로 배양 하였다. 계속해서,2 차 비오티닐화된 염소 항-토끼 항체 용액을 디캔팅하고,막을 세척당 5 분에 총 3 회의 세척 동안 TTBS 세척 용액에서 배양하였다. 멤브레인을 궤도 로커에서 1 시간 동안 스트렙 타비 딘-바이오 티닐 화 알칼리성 포스파타제 복합 용액(Bio-Rad,Hercules,CA)으로 배양 하였다. 마지막으로,streptavidin-biotinylated alkaline phosphatase complex 용액을 디캔팅하고 막을 궤도 셰이커에서 세척 당 5 분에 TTBS 용액으로 3 회 세척 하였다. Bcip/NBT(Bio-Rad,Hercules,CA)를 함유하는 컬러 개발 용액을 첨가하고 컬러 개발을 30-60 분에 걸쳐 모니터링 하였다. 궤도 로커에서 10 분 동안 이중 증류 된 H2O 에서 막을 배양함으로써 색 발달을 중단시켰다. 얼룩이 막았 디지털화의 방법으로 농도계 사용 케미 Doc XRS 이미징 시스템(Bio-Rad,헤라클레스,캘리포니아)및 밴드 조밀도는 표현에 통합밀도 단위 상대적인 근육량.
통계 분석
통계 분석은 SPSS(버전 14.0,SPSS Inc.,시카고,일리노이). 전혈,혈청,성능 및 신체 구성 변수를 사용하여 분석되었다 2×3(그룹×테스트 session)analysis of variance(ANOVA)반복 측정을 변량 테스트합니다. MHC 단백질 FP 및 EP3 수용체 단백질 레벨 분석을 사용하여 별도의 2×2(그룹×테스트 session)분산 분석으로 반복되는 조치입니다. 또한,의 경우에는 상당한 주요 효과를 위해 그룹,한 방법이 여러 가지 분산 분석에 반복 측정을 테스트하는 세션 수행에 대한 각 그룹을 평가하는 사이에 어떤 차이 테스트합니다. 독립적 인 t-테스트는 보충 50 일 후 MHC mRNA 발현의 변화를 분석하는 데 사용되었습니다. 이외에 원수 분석,델타 점수 분석(즉,하루에 0 뺀 값에서 날 25 그리고/또는 50)을 수행하였는 변수의 전시 관계없는 변화는 그룹 사이에서 날 0. 으로 언급으로 원점수,2×3(그룹×테스트 session)analysis of variance(ANOVA)을 반복되는 변량 측정은 테스트를 분석하는 데 사용 델타 점수를 위한 신체 조성,성능 변수와 호르몬 농도는 반면 2×2 반복 측정을 사용한 분산 분석하는 데 사용되었을 분석하는 모든 근육내 델타 점수가 있습니다. 그룹 내의 동등한 분산이 가정 될 수없는 상황에서,Hunyhs-Feldt epsilon 보정 인자를 사용하여 그룹 F-비율 내에서 조정 하였다. 통계적 추세가 존재하는 것으로 나타난 상황에서(즉,p=0.05 내지 0.10),효과 크기도 부분 Eta 제곱(np2)으로보고되었다. 부분 Eta 제곱 효과는 크기가 결정된 약한 것을(np2≤0.01),medium(np2=0.06),강=(np2=0.14)이전으로 설명한다. 모든 통계 분석에 대한 중요성은 0.05 의 알파 수준을 사용하여 결정되었습니다. 는 것을 주목해야한다는 사전 전력 분석을 디자인하는 n-의 크기는 15 참가자를 치료할 것이 높은 전력(>0.8)에 대한 표준 변수 delta 값의 0.75 1.25. 그것은 또한 주목해야한다는 사후 특 분석을 사용하여 박스 플롯을 수행하였는 상황에서 있었던 곳 중요한 그룹이×시간이 상호 작용하는 보장이 없었 특이 존재합니다. 모든 데이터는 평균±표준 편차(SD)로보고됩니다.