被験者
三十から一健康な、抵抗訓練された男性（22.1±5.0歳、180±0.1cm、86.1±13.0kg、18.1±6.4％体脂肪）は、によって承認された研究プロトコルを知らされた。参加する前にベイラー大学の機関審査委員会。 訓練状況は自己報告され、研究前に少なくとも一年の経験を欠いていた個人は除外された。 さらに、被験者は、1）代謝、高血圧、肝機能、筋骨格系、自己免疫、または神経疾患の既往があること、2）現在甲状腺、抗高脂血症、低血糖、抗高血圧薬、またはアンドロゲン薬を服用していること、および3）研究開始から三ヶ月以内に筋肉量および/または同化/異化ホルモンレベルに影響を与える可能性のある栄養補助食品を服用していたことがある場合に除外された。
ベースラインテスト
対象となる被験者は、研究デザインの口頭および書面による説明を介して研究プロトコルに精通していました。 被験者はインフォームドコンセント声明に署名し、個人および病歴を完了し、ベースライン試験の前にウィンゲート嫌気性能力試験を完了しました。 被験者は、食事摂取量の記録を可能にするために、慣れ親しんだ3-4日後に発生したベースライン試験（すなわち、0日目）の前に48時間激しい運動を控え、10時間 この研究では、被験者が年齢と体重に応じてクラスターに均等に一致したという二重盲検、プラセボ対照、並列研究デザインを採用しました。
実験プロトコル
0日目、25日目、および50日目の間に、各被験者は10時間の高速後に実験室に報告しました。 高さは、標準的な人体測定法を使用して測定し、総体重は、±0.02kgの精度で較正されたHealthometerデジタルひずみゲージ電子スケール（Bridgeview、IL）を使用して測定した。 次いで、較正されたＨｏｌｏｇｉｃ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｗ ｄｕａｌ−ｅｎｅｒｇｙ ｘ−ｒａｙ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｅｒ（ＤＸＡ）デバイス（Ｈｏｌｏｇｉｃ Ｉｎｃ． 血圧および安静時心拍数は、標準的な手順を用いて決定したが、ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍ Ａ）。 被験者はその後、血液学的、臨床化学的パネルおよび後のサイトカインおよびホルモン分析のための標準的な静脈穿刺技術を用いて、約25mlの絶食血 二つの10mlの血清分離vacutainerチューブと一つの5mlのK3EDTA vacutainerチューブは、複数のサンプル静脈切開技術を使用して連続して血液採取のためのvacutainerホルダーに挿入 血清vacutainerチューブを15分間室温で1,500gで遠心分離しながら、全血を直ちに分析し、血清上清をマイクロ遠心管に移し、血清サンプルを-20℃で保存し、その後のホルモンおよび代謝産物の分析を行った。 0日目と50日目にのみ、被験者はbergstrom生検技術を使用して横広筋から骨格筋の約60mgを寄付しました。 上半身および下半身の強度は、ベンチプレスおよび３ ５°ｈｉｐ ｓｌｅｄ ｍａｃｈｉｎｅ（Ｎｅｂｕｌａ，Ｖｅｒｓａｉｌｌｅｓ，Ｏ Ｈ）を用いた標準的な１ＲＭ試験手順を用いて評価した。 私達の実験室の抵抗訓練された主題のこれらの強さテストのテスト再テストの信頼性はベンチプレス（r=0.94）および足の出版物（r=0.91）のための高い信 Ｈｉｐそり１ＲＭの決定後、被験者は、下半身の嫌気性パワーを評価するために、コンピュータ化されたサイクルエルゴメーター（Ｌｏｄｅ Ｅｘｃａｌｉｂｕｒ，Ｌｏｄｅ，Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で３ ０秒のＷｉｎｇａｔｅ嫌気性能力試験を完 このテストは、各被験者が自転車エルゴメーター上で30秒間、体重の0.075kg·kg-1の標準的な作業負荷に対してすべての方法でスプリントすることからな 私たちの研究室では、絶対ピーク電力と平均電力のテスト-再テスト信頼性も高い信頼性値（r=0.69とr=0。95、それぞれ、P<0.05）。
経皮的筋生検
筋肉生検は、運動による筋原線維の破壊の可能性を避けるために、すべての強度試験の前に0日目と50日目に撮影しました。 被験者は、各筋肉生検の48時間前に運動を控えるように指示された。 筋肉は、適用された吸引と5ミリメートルの生検針を使用して、支配的な脚の膝蓋骨と腸骨稜の間の中間側広筋の外側部分から抽出されました。 簡単に言えば、1.5mlの1。0%のリドカインHClは小さい操縦者切り傷を作る前にsubcutaneously注入されました。 二重チョップのプロシージャおよび応用吸引を使用して、標本は液体窒素でフラッシュ凍らせている前に最初にすべての目に見える脂肪および結合 その後、すべての試料を、後の分析まで-80℃で保存した。
補充プロトコルと食事モニタリング
二重盲検方式では、被験者は、ベースライン試験後50日間にわたってコーン油プラセボまたはAA（X因子、分子栄養、Jupiter、FL）を含む250mgのカプセルを摂取した。 補足はカプセルの形態で準備され、分子栄養物によって一般的なびんで包まれました。 コンプライアンスは、被験者が補充の25日と50日後に空の補充ボトルを返すことによって監視された。 前の指針に従ってそしてエネルギーおよび蛋白質の取入口が筋肉肥大を促進するために十分であったことを保障するための努力ですべての主題はまた2g·kg-1·day-1の推定蛋白質の取入口を維持している間およそ500kcal·day-1によってカロリー摂取量を高めるように指示されましたベースライン食餌療法の分析と比較されたとき。 被験者に、上記のエネルギーおよびタンパク質の要件に対応するために、約290キロカロリー、24gの炭水化物、45gのタンパク質および1gの脂肪を含む市販の食事代替粉末(Lean Body,Labrada Nutrition,Houston,TX)を提供した。 ベースラインタンパク質の摂取量に応じて、被験者は、朝および/または各運動の直後に、食事代替サプリメントの1-2パケットを摂取するように指示された。 さらに、被験者は、魚油、亜麻仁油、冷水魚、オリーブ油、ゴマ油、ピーナッツバター、N-アセチルシステイン、共役リノール酸、ならびにアセトアミノフェン、イブプロフェン、アスピリンおよび他の非ステロイド性抗炎症薬を含むω-3脂肪酸が多いことが知られている食品の定期的な消費を避けるように指示された。 食餌療法の取入口、またリノール酸（18:2、ω-6）、リノレン酸（18:３、ω−３）、およびＡ Ａ摂取を、０日目、２ ５日目および５ ０日目の４日間の食事リコールでモニターし、Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ ＩＩＩ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＥＳＨＡ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓａｌｅｍ、ＯＲ）を使用して評価した。
抵抗トレーニングプロトコル
50日間にわたって、被験者は4日·週1分割体、線形周期化抵抗トレーニングプログラムを完了しました。 上体の上昇はベンチプレス、緯度の引き、肩の出版物、つけられていた列、肩の肩をすくめること、箱のはえ、二頭筋カールおよび三頭筋の出版物ダウンを含んでいた間、下半身の上昇は足の出版物、背部延長、ステップアップ、足のカール、足延長、かかとの昇給および腹部のクランチを週に二度含んでいた。 被験者は3セットの10回の繰り返しを行い、セットごとに持ち上げることができるほどの体重（すなわち、60-80％の1RM）を行った。 練習間の残りの期間は3分を超えず、セット間の残りの部分は2分を超えなかった。 研修は、大学の学生生活センターで実施され、研修ログに文書化され、コンプライアンスを確認し、進捗状況を監視するために指定されたスタッフによ この議定書は前の研究で筋肉強さ、肉体の持久力および脂肪質の自由な固まりの重要な利益を促進するために示されていました。
血清および全血分析
血清および全血サンプルは、補充プロトコル中の臨床的安全性を評価するために使用されました。 Serum samples were assayed for comprehensive metabolic panels including glucose, total protein, blood urea nitrogen (BUN), creatinine, BUN/creatinine ratio, uric acid, aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), creatine kinase (CK), lactate dehydrogenase (LDH), gamma-glutamyl transpeptidase (GGT), albumin, globulin, sodium, chloride, calcium, carbon dioxide, total bilirubin, alkaline phosphatase (ALP), triglycerides, cholesterol, HDL and LDL using a Dade Dimension XL clinical chemistry system (Dade Behring Inc., Newark, DE). 赤血球数、ヘモグロビン、ヘマトクリット、平均細胞体積、平均小体ヘモグロビン、平均小体ヘモグロビン濃度、赤血球分布幅、白血球数、好中球、リンパ球、単球、好酸球、および好塩基球を含む完全な血球数を、Ｃｅｌｌ−ＤＹＮ１ ８ ０ ０（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）を用いてフローサイトメトリーを介して分析した。 これらのアッセイを実行することの信頼性（内および間）をテストするためのテストは、2から6％の平均変動係数（C V）を有する個々のアッセイのための3.0％の範囲であった。 サンプルは、観察された値が標準的な手順に従って対照値および／または臨床基準の外であった場合の結果を検証するために、重複して実行された。
その後の血清サンプルは、後にコルチゾール（CORT）、遊離テストステロン（fTEST）、総テストステロン（tTEST）、インターロイキン-6（IL-6）、プロスタグランジンE2（PGE2）およびプロスタグランジンF2A（Pgf2A）についてアッセイした。 市販酵素免疫吸収アッセイを使用して、Ｐｇｆ２Ａ、ＰＧＥ２、およびＩＬ−６（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，Ｍ Ｉ）ならびにＣＯＲＴ、ｆＴＥＳＴ、およびｔＴＥＳＴ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ｔ Ｘ）の血清濃度を分析した。 これらのEIAベースのアッセイを実行するC Vは3.0から5.0％の範囲であった。
総RNA単離
総細胞RNAは、トリ試薬内に含まれるフェノールとグアニジンイソチオシアネートの単相溶液で生検試料のホモジネートから抽出した（Sigma Chemical Co.、セントルイス、ミズーリ州）。 各試料からの全ＲＮＡ濃度を、２ ６ ０ｎｍ（ＯＤ２ ６ ０）の光学密度で分光光度測定し、粗全ＲＮＡ抽出物をＤＥＰＣ処理ヌクレアーゼフリー Ｈ２Ｏに希釈することにより、最終濃度を２ ０ ０ｎｇ＊μ ｌ−１ この手順は、顕著な28Sおよび18SリボソームRNAバンド、ならびに約2.0のOD260/OD280比によって示されるように、DNAおよびタンパク質を含まない、分解されていないRNAを生成することが示されている。 ＲＮＡ試料を、後の分析まで−８ ０℃で保存した。
逆転写およびクローンDNA合成
前に記載したように、全細胞RNAの標準化された溶液を逆転写してクローンDNA（cDNA）を合成した。
要するに、逆転写反応混合物を４ ２℃で４ ０分間インキュベートし、８ ５℃に５分間加熱した後、氷上で急速冷却してｃＤＮＡ生成物を得た。 開始cDNAテンプレート濃度は、200ng·μ l-1に標準化されたリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）増幅の前に、粗cDNA合成産物を分光光度法で260nmの波長で検出し、ヌクレアーゼフリー H2Oでそれらを希釈することにより、標準化されたcDNA溶液は、リアルタイムRT-PCRが行われるまで-80℃で凍結した。アンチセンスおよびセンスオリゴヌクレオチドプライマー対を、Ｇｅｎｂａｎｋヌクレオチドデータベースに公開された既知のｍＲＮＡ配列から市販のＢｅａｃｏｎ Ｄｅｓｉｇｎｅｒソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃ Ａ）を使用して構築し、商業的に合成した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉ Ａ）。 以下の５’センスおよび３’アンチセンスオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、３つの成体ｍ Ｈ Ｃアイソフォーム（ｉ型、Ｉｉａ型、およびＩｉｘ型）を単離した：ｉ型Ｍ Ｈ Ｃ ｍ ＲＮＡ（５’プ: ２ ４ ４ ０−２ ４ ２ ０、Ｇｅｎｅｍｂｌ Ａ Ｃ Ａ Ｆ１ １ １ ７ ８ ４）、Ｉｉｘ型Ｍ Ｈ Ｃ ｍ ＲＮＡ（５’プライマー：塩基１ １ ３ ８−１ １ ５ ８、３’プライマー：塩基１ ７ ４ ６−１ ７ ２ ６、Ｇｅｎｅｍｂｌ Ａ Ｃ Ａ Ｆ１ １ １ ７ ８ ５）。 これらのプライマーは、ｉ型、Ｉｉａ型、Ｉｉｘ型ＭＨＣに対して、それぞれ１ ４ １、１ ４ ５、および１ ４ ８塩基対の断片を増幅する。 β-アクチンは、構成的に発現されるハウスキーピング遺伝子としての考慮のために、標的mRNAの量の相対的な変化を検出するための外部参照標準として使用され、これらのβ-アクチンプライマーは135塩基対のPCR断片を増幅する。 ＭＨＣ Ｉ型、−Ｉｉａ型、および−Ｉｉｘ型、およびβ−アクチンに対する４つのＰＣＲ反応のそれぞれに２ ０ ０ｎｇのｃＤＮＡを添加した。 ５μ ｌの２×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃ Ａ）、１.５μ ｌのｓｅｎｓｅおよびａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅプライマー、および７.５μ ｌのｎｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ Ｄ Ｈ２Ｏ］と共に、２μ ｌのｃＤＮＡテンプレートを添加した。 各ＰＣＲ反応をサーマルサイクラー（Ｂｉｏ Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃ Ａ）で増幅し、増幅配列は、９ ５℃で３ ０秒間変性ステップ、５ ５℃で３ ０秒間プライマーアニーリング、および７ ２℃で６ ０秒間伸長させた。 ＲＴ−ＰＣＲは、各サイクルの後に測定されるＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅから放出された蛍光を用いて４ ０サイクルにわたって実施された。 蛍光の放出は、ＰＣＲ反応中に生成された二本鎖ｃＤＮＡへのＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎの統合に起因して生じる。 全てのＣＴ値を増幅の直線部分で評価し、単一遺伝子産物がプライマー−二量体の非存在下で増幅されたことを確実にするために、増幅後にＤＮＡ融解曲線 全てのｍＲＮＡの定量は、β−アクチン発現に対して発現された。 ＣＴ値比の比較を使用して、Ａ Ａ群とＰＬ Ａ群との間の基底遺伝子発現の変化を比較した。 確定したPCR反応混合物の25μ lアリコートを用いたアガロースゲル電気泳動を1で行った。１×Ｔｒｉｓ−ホウ酸−ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝液を使用して５％アガロースゲルを、ＵＶ透過ルミネーター（Ｃｈｅｍｉ−Ｄｏｃ ＸＲＳ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃ Ａ）で照射して、標的ｍ ＲＮＡの陽性増幅を検証した（データは示さなかった）。 MHC I、IIa、およびIIxのC Vは、それぞれ2.06％、3.18％、および2.73％であった。
総筋肉タンパク質定量
総RNA単離手順から残っている総タンパク質は、イソプロパノール、エタノール、および0.3M塩酸グアニジンで単離された。 筋原線維タンパク質を0で単離した。１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５ ９ ５ｎｍの波長でＢｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙを用いて分光光度測定により決定されたタンパク質含量を有する前に。 標準曲線は、(r2=0.98,P<0.001)ウシ血清アルブミンを標準として使用して生成し、筋肉湿潤重量に対する相対的なものであった。 その後、各タンパク質サンプルを、その後の免疫ブロッティングのために30μ lのSDS緩衝液あたり50μ gのタンパク質に希釈した。 筋原線維タンパク質のC Vは2.03％であった。各マッスルホモジネート試料中のＭＨＣタンパク質アイソフォームの組成は、Ｅｘｐｅｒｉｏｎ Ｐｒｏ２ ６ ０チップ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃ Ａ）を用いた自動ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定した。 各試料の約6μ lのアリコートをマイクロチップ上の各試料ウェルにピペットでピペットした。 各未知の試料は、各被験体からのタンパク質希釈液４μ ｌ（または分子量ラダー４μ ｌ）、β−メルカプトエタノールを含む試料緩衝液２μ ｌ、および脱イオン化水８ ４μ ｌから調製した。 Gazithらの発見に基づいて、三つのMHCアイソフォームはすべて、分子量のはしごに対してポリアクリルアミドゲル内の200-210キロダルトン領域に移動すると予想された。 ゲルは、Ｅｘｐｅｒｉｏｎソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃ Ａ）によってデジタル的に可視化され、各試料中のＭＨＣ濃度は、各ｍｈｃアイソフォームの任意の密度を既知の濃度を有する分子量マー タンパク質バンド≤10kDのC Vは≤1.1％であった。
Protein immunoblotting
Pgf2A(FP)とPGE2(EP3)受容体定量は、ホモジネートから総筋肉タンパク質を抽出し、バイオドットプロテインブロッティングシステム（Bio-Rad、Hercules、CA）を用いてニトロセルロース膜に総タンパク質の50μ gをスロットブロッティングすることによって室温で行われた。 ブロッティングされた膜を、軌道ロッカー上でブロッキング溶液で１時間インキュベートし、デカントし、膜をＴＴＢＳ洗浄溶液で５分間インキュベートし、合計３回の洗浄を行った。 膜を、特異的な抗ＦＰ受容体および抗ＥＰ３受容体ポリクローナル抗体（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，Ｍ Ｉ）と一緒に、４μ ｇ＊ｍｌ−１に希釈して、軌道ロッカー上で１〜２時間インキュベートした。 次いで、一次抗体溶液をデカントし、膜を軌道ロッカー上でＴＴＢＳ溶液で５分間洗浄し、合計３回の洗浄を行った。 ＴＴＢＳ洗浄溶液をデカントし、膜を二次ビオチン化ヤギ抗ウサギ抗体溶液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃ Ａ）と一緒に、軌道ロッカー上で１時間インキュベートした。 続いて、二次ビオチン化ヤギ抗ウサギ抗体溶液をデカントし、膜をＴＴＢＳ洗浄溶液中でインキュベートし、洗浄あたり５分間で合計３回の洗浄を行った。 膜を、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ａｌｋａｌｙ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ溶液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃ Ａ）と共に、軌道ロッカー上で１時間インキュベートした。 最後に、streptavidin-biotinylatedアルカリホスファターゼ複合体溶液をデカントし、膜は軌道シェーカー上の洗浄あたり5分でTTBS溶液で三回洗浄した。 ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃ Ａ）を含有する発色液を添加し、３ ０〜６ ０分間にわたって発色をモニターした。 色の開発は、軌道ロッカー上で10分間二重蒸留H2O中の膜をインキュベートすることによって停止しました。 ブロットされた膜を、Ｃｈｅｍｉ−Ｄｏｃ ＸＲＳイメージングシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃ Ａ）を用いた濃度測定によってデジタル化し、バンド密度を筋肉重量に対する統合密度単位で表
統計分析
統計分析は、SPSS（バージョン14.0、SPSS Inc.）を使用して行った。、シカゴ、イリノイ州）。 全血、血清、パフォーマンス、および体組成変数は、2×3（グループ×テストセッション）分散分析（ANOVA）を使用して、一変量テストを繰り返し測定して分析しました。 ＭＨＣタンパク質、ＦＰおよびＥＰ３受容体タンパク質レベルを、別々の２×２（ｇｒｏｕｐ×ｔｅｓｔｉｎｇ ｓｅｓｓｉｏｎ）Ａ ＮＯＶＡを使用して、反復測定を用いて分析した。 さらに、グループの有意な主効果の場合には、テストセッションに繰り返し測定を伴う一方向ANOVAsは、テスト間の任意の違いを評価するために、各グループに 独立したｔ−試験を使用して、補給の５ ０日後のＭＨＣ ｍ ＲＮＡ発現の変化を分析した。 生のスコア分析に加えて、デルタスコア分析（すなわち、２ ５日目および／または５ ０日目から減算された０日目の値）を、０日目に群間の無関係な変動を示した変 生のスコアで述べたように、2×3（グループ×テストセッション）分散分析（ANOVA）反復測定一変量テストを使用して、体組成、パフォーマンス変数、およびホルモン濃度のデルタスコアを分析したのに対し、2×2反復測定ANOVAを使用して、すべての筋肉内デルタスコアを分析しました。 グループ内の等分散が仮定できない状況では、Hunyhs-Feldtイプシロン補正係数を使用して、グループF比内で調整しました。 統計的傾向が存在するように見えた状況では（すなわち、P=0.05から0.05まで）、P=0.05から0.05までが存在する。10)、効果サイズも部分Eta二乗(np2)として報告した。 部分的なＥｔａ二乗効果サイズは、前述のように、弱い（ｎｐ２≧０.０ １）、中程度（ｎｐ２＝０.０ ６）、強い＝（ｎｐ２＝０.１ ４）であることが決定された。 すべての統計分析の有意性は、0.05のアルファレベルを用いて決定した。 設計の先験的パワー分析は、治療あたり15人の参加者のnサイズが0.75から1.25の基準変数デルタ値に対して高いパワー（>0.8）をもたらすこ また、外れ値が存在しないことを確認するために、有意なグループ×時間の相互作用があった状況で、箱ひげ図を用いた事後異常値分析が行われたことにも留意すべきである。 すべてのデータは、平均±標準偏差（Ｓ Ｄ）として報告される。