| Taq polymerase, exonuclease | ||||||
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 Full Taq DNA polymerase bound to a DNA octamer
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| Identifiers | ||||||
| Symbol | Taq-exonuc | |||||
| Pfam | PF09281 | |||||
| InterPro | IPR015361 | |||||
| SCOP2 | 1qtm / SCOPe / SUPFAM | |||||
| Available protein strutture: | Pfam | PPB | PDBsum | |||
Taq PolA ha una struttura simile a quella di E. coli PolA. Il dominio di esonucleasi centrale 3′-5′ responsabile della correzione di bozze è stato drasticamente cambiato e non è funzionale. Ha un dominio di esonucleasi funzionale 5′-3′ al terminale amminico, descritto di seguito. I restanti due domini agiscono in coordinamento, tramite il movimento del dominio accoppiato.
Esonucleasi domainEdit
Taq polimerasi esonucleasi è un dominio trovato nel amino-terminale di Taq DNA polimerasi I (termostabile). Assume un motivo simile alla ribonucleasi H. Il dominio conferisce 5 ‘ -3 ‘ attività esonucleasica alla polimerasi.
A differenza dello stesso dominio in E. coli, che degraderebbe primer e deve essere rimosso dalla digestione per uso PCR, questo dominio non è detto di degradare il primer. Questa attività viene utilizzata nella sonda TaqMan: man mano che si formano i fili della figlia, le sonde complementari al modello entrano in contatto con la polimerasi e vengono scisse in pezzi fluorescenti.
Legame con DNAEdit
La Taq polimerasi è legata alla sua fessura del sito attivo della polimerasi con l’estremità smussata del DNA duplex. Poiché la polimerasi Taq è in contatto con il DNA legato, le sue catene laterali formano legami idrogeno con le purine e le pirimidine del DNA. La stessa regione della Taq polimerasi che si è legata al DNA si lega anche con l’esonucleasi. Queste strutture legate alla polimerasi Taq hanno interazioni diverse.
MutantsEdit
È stato riportato un esperimento di mutagenesi diretto al sito che migliora l’attività dell’esonucleasi 3′-5′ vestigale di un fattore 2, ma non è mai stato segnalato se farlo diminuisca il tasso di errore. Seguendo una linea di pensiero simile, le proteine chimera sono state prodotte da domini di raccolta delle ciliegie da E. coli, Taq e T. neapolitana polimerasi I. Scambiando il dominio vestigale con uno funzionale da E. coli ha creato una proteina con capacità di correzione delle bozze ma una temperatura ottimale più bassa e una bassa termostabilità.
Sono state prodotte versioni della polimerasi senza il dominio dell’esonucleasi 5′-3′, tra cui Klentaq o il frammento di Stoffel sono più noti. La completa mancanza di attività esonucleasica rendono queste varianti adatte per primer che presentano struttura secondaria e per copiare molecole circolari. Altre varianti includono l’uso di Klentaq con una polimerasi ad alta fedeltà, una termosequenasi che riconosce substrati come la DNA polimerasi T7, mutanti con tolleranze più elevate agli inibitori o versioni” con tag di dominio ” che hanno un motivo extra elica-tornante-elica attorno al sito catalitico per tenere il DNA più strettamente nonostante le condizioni avverse.
Significato nel rilevamento delle malattieedit
A causa dei miglioramenti Taq polimerasi forniti nella replicazione del DNA PCR: maggiore specificità, meno prodotti non specifici e processi e attrezzature più semplici, è stato determinante negli sforzi compiuti per rilevare le malattie. “L’uso della reazione a catena della polimerasi (PCR) nella diagnosi delle malattie infettive, ha portato alla capacità di diagnosticare precocemente e trattare in modo appropriato le malattie dovute a patogeni fastidiosi, determinare la suscettibilità antimicrobica degli organismi a crescita lenta e accertare il quantum dell’infezione.”L’implementazione della Taq polimerasi ha salvato innumerevoli vite. Ha svolto un ruolo essenziale nella rilevazione di molte delle peggiori malattie del mondo, tra cui: tubercolosi, faringite streptococcica, polmonite atipica, AIDS, morbillo, epatite e infezioni urogenitali ulcerative. La PCR, il metodo utilizzato per ricreare copie di campioni di DNA specifici, rende possibile il rilevamento della malattia prendendo di mira una specifica sequenza di DNA di un patogeno mirato dal campione di un paziente e amplificando le tracce delle sequenze indicative copiandole fino a miliardi di volte. Anche se questo è il metodo più accurato di rilevamento della malattia, in particolare per l’HIV, non viene eseguito più spesso di test alternativi e inferiori a causa del costo relativamente elevato, del lavoro e del tempo richiesto.
La dipendenza dalla Taq polimerasi come catalizzatore per il processo di replicazione della PCR è stata evidenziata durante la pandemia di COVID-19 del 2020. Le carenze dell’enzima necessario hanno compromesso la capacità dei paesi in tutto il mondo di produrre kit di test per il virus. Senza Taq polimerasi, il processo di rilevamento della malattia è molto più lento e noioso.
Nonostante i vantaggi dell’utilizzo della Taq polimerasi nel rilevamento della malattia PCR, l’enzima non è privo di difetti. Malattie retrovirali: HIV, HTLV-1 e HTLV-II; spesso includono mutazioni da guanina ad adenina nel loro genoma. Mutazioni come queste sono ciò che consente ai test PCR di rilevare le malattie, ma il tasso di fedeltà relativamente basso della Taq polimerasi fa sì che si verifichi la stessa mutazione G-a-A e possibilmente produca un risultato del test falso positivo.