Al fine di sfruttare la potenza delle endonucleasi di homing mirate, il Jerome lab ha lavorato per ottimizzare un sistema di consegna utile sia per gli studi in vivo che in vitro. Hanno usato un sistema di distribuzione del virus adeno-associato (AAV) per colpire i gangli trigeminali del topo con una delle due endonucleasi specifiche HSV: HSV1m5, che è progettato per scindere il gene della proteina virione VP5, e HS1m8 ,che si rivolge al gene che codifica per la subunità catalitica della DNA polimerasi. La creazione di mutazioni in uno di questi geni provoca l’interruzione del genoma virale e impedisce la produzione di virioni. Al fine di aumentare ulteriormente gli effetti del trattamento Trex-2, è stata co-trasdotta un’endonucleasi 3’-5’, che ha dimostrato di aumentare la mutagenesi diretta. Dopo aver stabilito il sistema, il laboratorio ha iniziato il lavoro in vitro concentrandosi sui neuroni, il tipo di cellula biologicamente rilevante. Le colture di neuroni sono state co-trasdotte con HSV1m5 o 8 e Trex-2 e quindi infettate con HSV. Le colture trattate hanno mostrato una riduzione del 50% del titolo virale e la presenza di mutazioni nell’HSV mediante il test dell’endonucleasi 1 T7 e il sequenziamento clonale. Una volta stabilita l’interruzione dell’infezione litica, i ricercatori hanno iniziato a esaminare gli effetti sulle diverse fasi dell’infezione da HSV. Utilizzando colture infette di neuroni con HSV e successivamente trattati con HSV1m5 o 8 con Trex-2 in diversi punti temporali i ricercatori hanno potuto simulare le varie fasi dell’infezione. Hanno trattato colture a 7 giorni (fase acuta), 14 giorni (fase latente acuta/ precoce) e 32 giorni (fase latente) e non hanno trovato alcun cambiamento in effetti indipendentemente dalla fase virale. Ciò suggerisce che HSV è similmente suscettibile alla mutagenesi dell’endonucleasi indipendentemente dalla fase virale. I livelli di mutazioni del sito bersaglio variavano rispettivamente da 4,5-7,6% e 1,1-6,6% per HSV1m5 e HSV1m8. Attualmente, questo è il primo studio a esaminare l’attività dell’endonucleasi nei neuroni infettati latentemente.
Incoraggiati dai risultati in vitro, i ricercatori hanno eseguito studi in vivo utilizzando topi infetti da HSV seguiti 32 giorni dopo dall’iniezione di AAV (che esprime HSV1m5 o 8 e Trex-2). I neuroni dei topi sono stati campionati 30 giorni dopo l’iniezione di AAV per mutazioni del titolo virale, della carica virale e del genoma HSV. Il gruppo ha mostrato mutazioni 1-2% in 2/4 topi per HSV1m5 e in 3/4 topi per HSV1m8. Tuttavia la carica virale di questi animali era simile tra gli animali di controllo e quelli trattati. Lo spargimento virale è stato ritardato di un giorno negli animali trattati, ma ha raggiunto livelli simili nel tempo rispetto ai non trattati. Dopo aver riflettuto sui risultati, il Dr. Jerome ha detto: “Questa è la prima volta che un’infezione virale latente reale è stata stabilita in un animale e quindi disabilitata, anche parzialmente, usando la terapia con endonucleasi. Quindi rappresenta un passo fondamentale per portare tali terapie all’applicazione umana. La sfida principale ora è aumentare la potenza della terapia, in modo che tutto o quasi tutto il virus latente sia geneticamente disabilitato. Stiamo studiando nuove nucleasi più efficienti come CRISPR / Cas e valutando nuovi metodi per fornire le nucleasi ai neuroni infetti in vivo.” In futuro, questa terapia potrebbe portare a un nuovo modo di pensare al trattamento di malattie latenti come l’HSV e l’HIV che attualmente consideriamo incurabili.
I finanziamenti per questa ricerca sono stati forniti dal National Institutes of Health e dalla Canadian Foundation.
Aubert M,Madden EA,Loprieno M,DeSilva Feelixge HS,Stensland L,Huang ML,Greninger AL,Roychoudhury P,Niyonzima N,Nguyen T,Magaret A,Galleto R,Stone D,Jerome KR. 2016. Interruzione in vivo dell’HSV latente mediante terapia endonucleasica di progettazione. JCI Insight, 1(14).