1 Teoria
Gli oligonucleotidi sono sintetizzati con l’aggiunta di una base alla volta, che si estende dal 3′ al 5′-end, attaccato ad un supporto in fase solida. Quando la sintesi chimica dell’oligonucleotide è completa, la catena del DNA viene rilasciata dal supporto solido mediante incubazione con idrossido di ammonio. L’ammonio agisce anche come agente deprotettivo, scindendo i gruppi che proteggono i fosfati nei legami fosfodiesterici. Dopo questo, l’ammoniaca calda è aggiunta per idrolizzare i gruppi proteggenti dai gruppi amminici esociclici di deoxyadenosine, deoxycytosine e deoxyguanosine. L’oligonucleotide potrebbe essere fornito all’utente nella soluzione di ammoniaca come preparazione grezza. In questo caso, prima dell’uso, potrebbe essere necessario eseguire un ulteriore passaggio per rimuovere i sali e i sottoprodotti dalla preparazione dell’oligonucleotide generata durante la deprotezione.
Dopo la deprotezione, la preparazione dell’oligonucleotide viene solitamente dissalata, quantificata, evaporata a secchezza in un liofilizzatore e fornita all’utente sotto forma di polvere. La soluzione di oligonucleotide dissalata contiene l’oligonucleotide a lunghezza intera ma contiene anche una miscela di prodotti troncati che sono stati accumulati durante la sintesi chimica. Il troncamento si verifica quando la base specificata non riesce ad aggiungere alla catena nel ciclo corrispondente (Hecker& Rill, 1998). Pertanto, la percentuale di prodotti troncati accumulati nella preparazione è determinata dall’efficienza di sintesi (la frazione del prodotto a lunghezza intera dopo la sintesi) e dalla lunghezza della molecola. Gli oligonucleotidi lunghi, che richiedono più cicli per essere sintetizzati, sono meno puri degli oligonucleotidi corti. Questi guasti possono competere con il prodotto a lunghezza intera in alcune applicazioni e possono richiedere la rimozione prima che l’oligonucleotide possa essere utilizzato. Tuttavia, i preparati oligonucleotidici dissalati sono solitamente adatti a molte applicazioni, come PCR standard o microarray, specialmente se l’oligonucleotide è < 20 nucleotidi di lunghezza.
Si raccomanda un’ulteriore purificazione per oligonucleotidi più lunghi di 50 basi perché la percentuale di prodotto a lunghezza intera nella preparazione non è in genere superiore all ‘ 80%. Per le applicazioni più esigenti, dove la lunghezza esatta del oligonucleotide è importante, come dosaggi di gel-shift, mutagenesi luogo-diretta, di sequenziamento, di produzione di clonazione adattatori, o first-strand cDNA di sintesi per la generazione di librerie, ulteriore purificazione è raccomandato, anche per brevi oligonucleotidi (vedere ulteriori informazioni sulle tecniche di sopra di Standard di test in vitro delle Proteine-Acidi Nucleici Farmacologiche – Gel shift analisi di RNA e DNA Binding e di Mutagenesi Sito-Diretta).
La purificazione può essere necessaria dopo la sintesi o dopo la modifica enzimatica dell’oligonucleotide. Esistono diversi metodi per raggiungere questo obiettivo e la scelta dipende dalla natura dell’oligonucleotide e dall’applicazione a cui è destinato.
La purificazione HPLC in fase inversa si basa sull’idrofobicità. Utilizza una fase stazionaria non polare e tamponi acquosi e solventi organici come fase mobile per eluire gli analiti; i composti polari vengono eluiti per primi, mentre i composti non polari vengono trattenuti. Questo è il metodo migliore per purificare gli oligonucleotidi modificati con un gruppo idrofobo, come biotina, etichette di coloranti fluorescenti o coniugazioni NHS-estere. Il recupero di massa è superiore a quando si utilizza la purificazione della PAGINA ed è suscettibile alla purificazione di maggiori quantità di oligonucleotidi (scala mmole), sebbene non rimuova i prodotti incompleti in modo così efficace. Le cartucce di purificazione dell’oligonucleotide, basate sulla cromatografia in fase inversa, forniscono un metodo veloce di dissalazione e purificazione degli oligonucleotidi.
L’elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE) risolve gli oligonucleotidi in base alla loro lunghezza e quindi offre una risoluzione sufficiente per differenziare i prodotti a lunghezza intera dalle molecole fallite (Atkinson e Smith, 1984). I gel di poliacrilammide sono più efficaci per separare piccoli frammenti di DNA rispetto ai gel di agarosio (vedi Analisi dell’RNA mediante elettroforesi analitica su gel di poliacrilammide e elettroforesi su gel di agarosio). L’unico svantaggio dei gel di poliacrilammide è che sono più difficili da preparare e gestire rispetto ai gel di agarosio. I gel di poliacrilammide vengono eseguiti in una configurazione verticale in un campo elettrico costante. Dopo l’elettroforesi, l’oligonucleotide viene eluito dal gel e concentrato, utilizzando la precipitazione di etanolo (ulteriori informazioni sulla precipitazione degli acidi nucleici sui metodi di purificazione – precipitazione dell’RNA) o cromatografia a fase inversa. Questo è il metodo di scelta quando si desidera la più alta percentuale di oligonucleotidi a lunghezza intera per applicazioni impegnative. È anche fortemente raccomandato per oligonucleotidi più lunghi di 30 basi. Inoltre, è possibile eseguire più campioni contemporaneamente e non è richiesta alcuna attrezzatura costosa. L’unico inconveniente di questa tecnica è la piccola quantità di oligonucleotide ottenuta per purificazione. Tipicamente, gli oligonucleotidi vengono utilizzati nella scala di 1 µmol o meno e il recupero di massa dopo la purificazione della PAGINA è < 50% e ancora più basso nel caso di oligonucleotidi modificati. Tuttavia, sebbene la resa sia bassa, è soddisfacente per la maggior parte delle applicazioni biochimiche.
La preparazione di oligonucleotide viene caricata su un gel di poliacrilammide denaturante ad una quantità di almeno 1 mg per corsia. La gamma di risoluzione del gel dipende dalla concentrazione di poliacrilammide. Per oligonucleotidi brevi (da 15 a 35 basi), si raccomandano gel di poliacrilammide al 13-15%; per oligonucleotidi più lunghi (da 35 a 70 basi), si raccomandano gel di poliacrilammide all ‘ 8-13%. La percentuale del gel deve essere adattata al sistema in esecuzione. Di solito usiamo il sistema Bio-Rad Mini Protean II ed eseguiamo gel al 15% per purificare oligonucleotidi di 25 basi di lunghezza. Dopo l’identificazione della banda corretta mediante visualizzazione UV, la banda viene asportata ed estratta dal gel.
In questo capitolo sono descritti due diversi metodi di purificazione degli oligonucleotidi dai gel di poliacrilammide. Il metodo più semplice è l’eluizione mediante diffusione. Ciò è basata sul moto delle molecole da una regione di più alta concentrazione ad una di una concentrazione più bassa. Il risultato della diffusione è una miscelazione graduale del materiale. Questo metodo richiede molto tempo, ma non richiede troppo lavoro o qualsiasi attrezzatura. Fondamentalmente, la banda di poliacrilammide contenente l’oligonucleotide di interesse viene tagliata in piccoli pezzi e coperta con tampone di eluizione. Dopo l’incubazione, il DNA viene purificato dal surnatante mediante precipitazione di etanolo. La resa è limitata, tra il 20% e il 70%, a seconda della lunghezza dell’oligonucleotide. Maggiore è la quantità di tampone di eluizione utilizzata, più oligonucleotide viene diffuso dal gel.
Il secondo metodo è l’elettroeluzione in una sacca per dialisi (McDonell et al., 1977). Il pezzo di gel contenente l’oligonucleotide viene asportato e posto in una sacca per dialisi con un tampone. L’applicazione di una corrente elettrica fa migrare il DNA dal gel nel tampone della sacca per dialisi. L’oligonucleotide viene recuperato da questo tampone e purificato. Utilizzando questo metodo, l’oligonucleotide può essere isolato con una buona resa, anche se richiede tempo se un gran numero di campioni viene purificato allo stesso tempo, perché richiede l’inserimento di ciascuna banda di gel in singoli sacchetti di dialisi. Questo metodo funziona bene anche per frammenti di DNA più grandi e può anche essere utilizzato per estrarre il DNA dai gel di agarosio.